ونحن ممتنون لجورج جارفيس، مارثا بوك، وبات Hecox-ليا، المختبر البيولوجي البحري، لمساعدتهم في التصوير.

1. إعداد وسائل الإعلام ملاحظة: استخدام مياه البحر الاصطناعي نصف المخفف Brujewicz الملوحة 16.5 جزء في الألف (PSU). وكثيرا ما تستخدم أيضا مياه البحر الاصطناعية الأخرى لثقافة الدوارات Brachionus 25،26. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 454 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 26 ملي MgCl 2، 27 ملي MgSO 4، 10 ملي بوكل، و 10 ملي CaCl 2-4،5 لتر من الماء المقطر (الحجم النهائي سيكون 5 لتر). بدلا من ذلك، واستخدام الماء منزوع الأيونات تخفيف بدلا من الماء المقطر. إضافة CaCl 2 بعد حل جميع الأملاح الأخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد M NaHCO حل 3 الأوراق المالية 0.48 (تركيز 200X). إضافة 25 مل منه إلى الحل السالف الذكر. التركيز النهائي من NaHCO 3 هو 2.4 ملم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد M NaBr حل الأوراق المالية 0.4 (تركيز 500X). إضافة 10 مل منه إلى الحل السالف الذكر. التركيز النهائي من NaBr هو 0.8 ملم. ما يصل إلى 5 لتر مع الماء المقطر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصفية حل مع فلتر الغشاء 0.45 ميكرون.تمييع مرتين مع الماء المعقم قبل الاستخدام (ت / ت). ملاحظة: من الممكن أن تجعل تركيز 2X من Brujewicz مياه البحر الاصطناعي كحل الأسهم. </li></ol> 2. شروط الثقافة العامة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة أثار مختبر أو الدوارات البرية المأسورة في العقيمة كوب 100 مل بين 20 و 30 درجة مئوية. ارتفاع درجات الحرارة يؤدي إلى أقصر عمرا وتسارع الاستنساخ. استخدام 25 درجة مئوية لمدة راحة من التجارب. كثافة حيدة الخلية والروتيفر أو حجم مياه البحر الاصطناعي ليست قضية كبيرة هنا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة أنواع الطحالب الدقيقة الغذائية في مياه البحر الاصطناعي (11). انظر سنيل وآخرون (2014) لمزيد من التفاصيل 11. عادة، استخدم جنس (Tetraselmis) tetrathele (~ 2 × 10 5 خلية / مل 27،28)، T. suecica (~ 6 × 10 5 خلية / مل 25،29)، وNannochloropsis oculata (= 7 × 10 6 خلية / مل 30،31). ومنذ الحمية الطحالب (الأنواع، كونديت الثقافةالأيونات، التراكيب الكيميائية الحيوية) يؤثر بشكل كبير وقت بقاء الدوارات Brachionus، استخدم نفس الكثير من microalga في كل المجموعات التجريبية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على السكان الأسهم من الدوارات في ثقافة دفعة عن طريق تغذية وتغيير وسائل الإعلام في بعض الأحيان (على سبيل المثال، وإطعام كل أيام 2 و تطعيم كل أسبوع). العديد من حديثي الولادة والبالغين تحمل 2-3 البيض ويمكن ملاحظة عند الدوارات هي في أفضل الظروف. ملاحظة: طريقة بديلة للحصول على الدوارات التجريبية هي أن يفقس البيض يستريح. تعتبر الدوارات التي تحاك من البيض يستريح لتكون متزامنة بشكل جيد، وحياتها لا يختلف كثيرا عن أن من الدوارات التي تحاك من البيض amictic 11. ومع ذلك، الدوارات من البيض يستريح تبدأ التكاثر في وقت سابق من تلك التي من البيض amictic. وبالتالي، لا بد من الحذر لقياس الصفات الإنجاب. </li></ol> 3. تزامن الروتيفيرا من قبل الثقافة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد حيدة الخلية والروتيفر واحد من شارعسكان اوك والثقافة كما هو موضح في 2،1-2،3 لإقامة شبه سكان التي سيتم استخدامها لإجراء التجارب. ثقافة عادة لمدة أسبوعين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الدوارات التي تحمل البيض من سكان الفرعي (جمع عدد مزدوج من الأفراد التي سيتم استخدامها لتجربة). الثقافة بأنها مجموعة نموذجية واحدة (الكثافة: ~ 50 فردا / مل) في لوحة الثقافة 6 جيدا كما هو موضح في 2،1-2،3 في وسائل الإعلام الجديدة تحت تغذية libitum الإعلانية. السيطرة على الكثافة السكانية مهم جدا لأنه وسيلة مكيفة يؤثر علم وظائف الأعضاء التناسلية من الدوارات Brachionus 32،33. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل حديثي الولادة تحاك من البيض الأولى الراشدين إلى وسائل الإعلام ثقافة أعد حديثا. كرر هذا الإجراء أكثر من 2-3 أجيال. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام حديثي الولادة تحاك في غضون فترة زمنية معينة (على سبيل المثال، &lt;3 ساعة) لقياس الوقت البقاء على قيد الحياة. لتجنب التحيز المحتمل في اختيار فرد واحد، على الرغم من واردا جدا، والتحقق من استنساخ باستخدام العديد INDEمعلقة-الفرعية من السكان. ملاحظة: كما الدوارات عادة ما تتكاثر لاجنسيا فقط تحت هذا الشرط، ضمان عدم وجود الذكور موجودة في كافة مراحل التجربة. الذكور هم أصغر من حديثي الولادة وعادة ما تتحرك بسرعة أكبر من الإناث. الإناث Mictic لها أعمار مختلفة من الإناث amictic في ظل ظروف معينة (29). </li></ol> 4. قياسات الوقت البقاء على قيد الحياة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان حديثي الولادة في لوحات بلاستيكية (عادة 24- أو 48-جيدا لوحات، مع كل منها يحتوي أيضا 1 مل من مياه البحر الاصطناعي). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في 24 فترات ساعة، ونقل الدوارات إلى وسائل الإعلام الثقافة أعدت حديثا أو في 12 ساعة فترات إذا في ارتفاع درجة الحرارة (30 درجة مئوية أو أعلى). تسجيل عدد من ذرية وإذا كان كل فرد هو حيا أو ميتا. تسجيل حيدة الخلية والروتيفر في عداد الموتى عند حركة أهداب من الهالة قد توقف تماما. ملاحظة: الروتيفيرا غالبا ما نعلق على الجدران الجانبية من الآبار. pipetting لطيف من الماء يساعد على العثور عليها. إذا لم يتم العثور على الدوارات أو عالبريد التالفة عن طريق الخطأ من قبل pipetting ل، تسجيلها باسم &quot;رقابة&quot;، وليس كما &quot;حيا&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة حديثي الولادة عند الدوارات التجريبية تتوالد بنشاط. حديثي الولادة تنمو بسرعة وأنه من الصعب أحيانا التمييز بينها وبين الدوارات التجريبية. </li></ol> تحليل 5. البيانات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنشاء بقاء منحنى كابلان ماير (الشكلان 1 و 2) من خلال التآمر معدل البقاء على قيد الحياة التراكمي على المحور Y والوقت على المحور العاشر. هذا هو التمثيل الأكثر شيوعا من بيانات البقاء على قيد الحياة. استخدام غير حدودي الاختبار سجل رتبة (وتسمى أيضا رف كوكس test) لمقارنة إحصائية من الوقت البقاء على قيد الحياة 34. كما يتم تضمين اختبار سجل رتبة في الحزم الإحصائية القياسية الأخرى مثل أحزاب اللقاء المشترك وR. ملاحظة: لا تستخدم ر الطالب اختبار أو تحليل التباين (ANOVA)، يليه مقارنة متعددة حدودي لأنه عادة ما يتم الوفاء التوزيع العادي عن طريق البيانات البقاء على قيد الحياة 35. أيضا، هذه methoس لا تأخذ الأفراد رقابة بعين الاعتبار. مان ويتني U اختبار يمكن أن تستخدم إذا كان هناك أية بيانات للرقابة. </li></ol>

<ol>
	<li>Wallace, R. L., Snell, T. W., Ricci, C., Nogrady, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Rotifera Vol.1: Biology, ecology and systematics. , (2006).</li><li>Segers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Annotated checklist of the rotifers (Phylum Rotifera), with notes on nomenclature, taxonomy and distribution. , (2007).</li><li>Mark Welch, D. B., Meselson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+the+evolution+of+bdelloid+rotifers+without+sexual+reproduction+or+genetic+exchange.">Evidence for the evolution of bdelloid rotifers without sexual reproduction or genetic exchange.</a> Science. 288 (5469), 1211-1215 (2000).</li><li>Suga, K., Mark Welch, D., Tanaka, Y., Sakakura, Y., Hagiwara, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+expressed+sequence+tags+of+the+cyclically+parthenogenetic+rotifer+Brachionus+plicatilis.">Analysis of expressed sequence tags of the cyclically parthenogenetic rotifer Brachionus plicatilis.</a> PLoS ONE. 2, e671 (2007).</li><li>Denekamp, N. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovering+genes+associated+with+dormancy+in+the+monogonont+rotifer+Brachionus+plicatilis.">Discovering genes associated with dormancy in the monogonont rotifer Brachionus plicatilis.</a> BMC Genomics. 10, 108 (2009).</li><li>Lee, J. -. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+analysis+of+genomic+DNA+(680+Mb)+by+GS-FLX-Titanium+sequencer+in+the+monogonont+rotifer,+Brachionus+ibericus.">Sequence analysis of genomic DNA (680 Mb) by GS-FLX-Titanium sequencer in the monogonont rotifer, Brachionus ibericus.</a> Hydrobiologia. 662 (1), 65-75 (2010).</li><li>Flot, J. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+evidence+for+ameiotic+evolution+in+the+bdelloid+rotifer+Adineta+vaga.">Genomic evidence for ameiotic evolution in the bdelloid rotifer Adineta vaga.</a> Nature. 500 (7463), 453-457 (2013).</li><li>Dunn, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broad+phylogenomic+sampling+improves+resolution+of+the+animal+tree+of+life.">Broad phylogenomic sampling improves resolution of the animal tree of life.</a> Nature. 452 (7188), 745-749 (2008).</li><li>Yoshinaga, T., Kaneko, G., Kinoshita, S., Tsukamoto, K., Watabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+mechanisms+of+life+history+alterations+in+a+rotifer:+a+novel+approach+in+population+dynamics.">The molecular mechanisms of life history alterations in a rotifer: a novel approach in population dynamics.</a> Comp. Biochem. Physiol. B Biochem. Mol. Biol. 136 (4), 715-722 (2003).</li><li>Dahms, H. -. U., Hagiwara, A., Lee, J. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ecotoxicology,+ecophysiology,+and+mechanistic+studies+with+rotifers.">Ecotoxicology, ecophysiology, and mechanistic studies with rotifers.</a> Aquat. Toxicol. 101 (1), 1-12 (2011).</li><li>Snell, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rotifers+as+models+for+the+biology+of+aging.">Rotifers as models for the biology of aging.</a> Int. Rev. Hydrobiol. 99 (1-2), 84-95 (2014).</li><li>Snell, T. W., Johnston, R. K., Gribble, K. E., Mark Welch, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rotifers+as+experimental+tools+for+investigating+aging.">Rotifers as experimental tools for investigating aging.</a> Invertebr. Reprod. Dev. 59, 5-10 (2015).</li><li>Kaneko, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+Mn-superoxide+dismutase+and+gene+expression+studies+in+dietary+restricted+Brachionus+plicatilis+rotifers.">Molecular characterization of Mn-superoxide dismutase and gene expression studies in dietary restricted Brachionus plicatilis rotifers.</a> Hydrobiologia. 546, 117-123 (2005).</li><li>Yoshinaga, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-like+growth+factor+signaling+pathway+involved+in+regulating+longevity+of+rotifers.">Insulin-like growth factor signaling pathway involved in regulating longevity of rotifers.</a> Hydrobiologia. 546, 347-352 (2005).</li><li>Ozaki, Y., Kaneko, G., Yanagawa, Y., Watabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calorie+restriction+in+the+rotifer+Brachionus+plicatilis+enhances+hypoxia+tolerance+in+association+with+the+increased+mRNA+levels+of+glycolytic+enzymes.">Calorie restriction in the rotifer Brachionus plicatilis enhances hypoxia tolerance in association with the increased mRNA levels of glycolytic enzymes.</a> Hydrobiologia. 649 (1), 267-277 (2010).</li><li>Kailasam, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+calorie+restriction+on+the+expression+of+manganese+superoxide+dismutase+and+catalase+under+oxidative+stress+conditions+in+the+rotifer+Brachionus+plicatilis.">Effects of calorie restriction on the expression of manganese superoxide dismutase and catalase under oxidative stress conditions in the rotifer Brachionus plicatilis.</a> Fish. Sci. 77 (3), 403-409 (2011).</li><li>Garc&#236;a-Garc&#236;a, G., Sarma, S., N&#250;&#241;ez-Orti, A. R., Nandini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+the+mixture+of+two+endocrine+disruptors+(ethinylestradiol+and+levonorgestrel)+on+selected+ecological+endpoints+of+Anuraeopsis+fissa+and+Brachionus+calyciflorus+(Rotifera).">Effects of the mixture of two endocrine disruptors (ethinylestradiol and levonorgestrel) on selected ecological endpoints of Anuraeopsis fissa and Brachionus calyciflorus (Rotifera).</a> Int. Rev. Hydrobiol. 99 (1-2), 166-172 (2014).</li><li>Yang, J., Mu, Y., Dong, S., Jiang, Q., Yang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+expression+of+four+heat+shock+proteins+during+the+aging+process+in+Brachionus+calyciflorus+(rotifera).">Changes in the expression of four heat shock proteins during the aging process in Brachionus calyciflorus (rotifera).</a> Cell Stress Chaperones. 19 (1), 33-52 (2014).</li><li>Han, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sublethal+gamma+irradiation+affects+reproductive+impairment+and+elevates+antioxidant+enzyme+and+DNA+repair+activities+in+the+monogonont+rotifer+Brachionus+koreanus.">Sublethal gamma irradiation affects reproductive impairment and elevates antioxidant enzyme and DNA repair activities in the monogonont rotifer Brachionus koreanus.</a> Aquat. Toxicol. 155, 101-109 (2014).</li><li>Gribble, K. E., Jarvis, G., Bock, M., Mark Welch, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+caloric+restriction+partially+rescues+the+deleterious+effects+of+advanced+maternal+age+on+offspring.">Maternal caloric restriction partially rescues the deleterious effects of advanced maternal age on offspring.</a> Aging Cell. 13 (4), 623-630 (2014).</li><li>Yoshinaga, T., Hagiwara, A., Tsukamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+periodical+starvation+on+the+survival+of+offspring+in+the+rotifer+Brachionus+plicatilis.">Effect of periodical starvation on the survival of offspring in the rotifer Brachionus plicatilis.</a> Fish. Sci. 67 (2), 373-374 (2001).</li><li>Kaneko, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calorie+restriction-induced+maternal+longevity+is+transmitted+to+their+daughters+in+a+rotifer.">Calorie restriction-induced maternal longevity is transmitted to their daughters in a rotifer.</a> Funct. Ecol. 25 (1), 209-216 (2011).</li><li>Lansing, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transmissible,+cumulative,+and+reversible+factor+in+aging.">A transmissible, cumulative, and reversible factor in aging.</a> J. Gerontol. 2 (3), 228-239 (1947).</li><li>Yoshinaga, T., Hagiwara, A., Tsukamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+periodical+starvation+on+the+life+history+of+Brachionus+plicatilis+O.+F.+M&#252;ller+(Rotifera):+a+possible+strategy+for+population+stability.">Effect of periodical starvation on the life history of Brachionus plicatilis O. F. M&#252;ller (Rotifera): a possible strategy for population stability.</a> J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 253 (2), 253-260 (2000).</li><li>Gribble, K. E., Kaido, O., Jarvis, G., Mark Welch, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+intraspecific+variability+in+the+response+to+caloric+restriction.">Patterns of intraspecific variability in the response to caloric restriction.</a> Exp. Gerontol. 51, 28-37 (2014).</li><li>Snell, T. W., Johnston, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycerol+extends+lifespan+of+Brachionus+manjavacas+(Rotifera)+and+protects+against+stressors.">Glycerol extends lifespan of Brachionus manjavacas (Rotifera) and protects against stressors.</a> Exp. Gerontol. 57, 47-56 (2014).</li><li>Kim, H. -. J., Hagiwara, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+female+aging+on+the+morphology+and+hatchability+of+resting+eggs+in+the+rotifer+Brachionus+plicatilis+M&#252;ller.">Effect of female aging on the morphology and hatchability of resting eggs in the rotifer Brachionus plicatilis M&#252;ller.</a> Hydrobiologia. 662 (1), 107-111 (2011).</li><li>Kim, H. -. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-dependent+transcriptional+events+during+resting+egg+hatching+of+the+rotifer+Brachionus+manjavacas.">Light-dependent transcriptional events during resting egg hatching of the rotifer Brachionus manjavacas.</a> Mar. Genomics. 20, 25-31 (2015).</li><li>Gribble, K. E., Welch, D. B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life-span+extension+by+caloric+restriction+is+determined+by+type+and+level+of+food+reduction+and+by+reproductive+mode+in+Brachionus+manjavacas+(Rotifera).">Life-span extension by caloric restriction is determined by type and level of food reduction and by reproductive mode in Brachionus manjavacas (Rotifera).</a> J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 68 (4), 349-358 (2013).</li><li>Kaneko, G., Kinoshita, S., Yoshinaga, T., Tsukamoto, K., Watabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+expression+patterns+of+stress+protein+genes+during+population+growth+of+the+rotifer+Brachionus+plicatilis.">Changes in expression patterns of stress protein genes during population growth of the rotifer Brachionus plicatilis.</a> Fish. Sci. 68 (6), 1317-1323 (2002).</li><li>Kim, H. J., Sawada, C., Hagiwara, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavior+and+reproduction+of+the+rotifer+Brachionus+plicatilis+species+complex+under+different+light+wavelengths+and+intensities.">Behavior and reproduction of the rotifer Brachionus plicatilis species complex under different light wavelengths and intensities.</a> Int. Rev. Hydrobiol. 99 (1-2), 151-156 (2014).</li><li>Yoshinaga, T., Hagiwara, A., Tsukamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+conditioned+media+on+the+asexual+reproduction+of+the+monogonont+rotifer+Brachionus+plicatilis+O.+F.+Müller.">Effect of conditioned media on the asexual reproduction of the monogonont rotifer Brachionus plicatilis O. F. Müller.</a> Hydrobiologia. 412, 103-110 (1999).</li><li>Ohmori, F., Kaneko, G., Saito, T., Watabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+growth-promoting+protein+in+the+conditioned+media+from+the+rotifer+Brachionus+plicatilis+at+an+early+exponential+growth+phase.">A novel growth-promoting protein in the conditioned media from the rotifer Brachionus plicatilis at an early exponential growth phase.</a> Hydrobiologia. 667 (1), 101-117 (2011).</li><li>Collet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Modelling Survival Data in Medical Research. , 151-193 (1993).</li><li>Bouliotis, G., Billingham, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crossing+survival+curves:+alternatives+to+the+log-rank+test.">Crossing survival curves: alternatives to the log-rank test.</a> Trials. 12, A137 (2011).</li><li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+expression+of+manganese+superoxide+dismutase,+copper+and+zinc+superoxide+dismutase+and+catalase+in+Brachionus+calyciflorus+during+the+aging+process.">Changes in expression of manganese superoxide dismutase, copper and zinc superoxide dismutase and catalase in Brachionus calyciflorus during the aging process.</a> PloS ONE. 8 (2), e57186 (2013).</li><li>Snell, T. W., Johnston, R. K., Rabeneck, B., Zipperer, C., Teat, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Joint+inhibition+of+TOR+and+JNK+pathways+interacts+to+extend+the+lifespan+of+Brachionus+manjavacas+(Rotifera).">Joint inhibition of TOR and JNK pathways interacts to extend the lifespan of Brachionus manjavacas (Rotifera).</a> Exp. Gerontol. 52, 55-69 (2014).</li><li>Klass, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+in+nematode+Caenorhabditis-elegans+-+major+biological+and+environmental-factors+influencing+life-span.">Aging in nematode Caenorhabditis-elegans - major biological and environmental-factors influencing life-span.</a> Mech. Ageing Dev. 6 (6), 413-429 (1977).</li><li>Priest, N. K., Mackowiak, B., Promislow, D. E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+parental+age+effects+on+the+evolution+of+aging.">The role of parental age effects on the evolution of aging.</a> Evolution. 56 (5), 927-935 (2002).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

يصف البروتوكول الحالي وسيلة لقياس الوقت البقاء على قيد الحياة في الدوارات Brachionus. الخطوة الحاسمة هي تزامن الظروف حيدة الخلية والروتيفر على مدى عدة أجيال. عندما تتم مزامنة الدوارات التجريبية بشكل جيد، لوحظ نوع نموذجي منحنى أنا البقاء على قيد الحياة مع القليل جدا من الوفيات المبكرة كما ورد في العديد من الدراسات السابقة 18،24،37،38. لذا الانحرافات المعيارية من وقت بقائهم على قيد الحياة تصبح أصغر بالمقارنة مع الدوارات متزامنة سيئة، مما أدى في السلطة إحصائية عالية. ومن المتوقع أيضا تزامن لزيادة استنساخ القياسات الوقت البقاء على قيد الحياة - لأن تربيتها الأمهات تحت الظروف المثلى، البروتوكول الحالي تعوض الآثار الضارة المحتملة للأجيال الأمهات. إذا كان لا يزال لوحظ وفيات مبكرة بعد تزامن دقيق، والنظر في استخدام وسائل الإعلام ثقافة أعدت حديثا، الكثير آخر للتغذية الطحالب، أو لفيف التجريبية التي أنشئت حديثا (أي،نبدأ من بروتوكول 3.1). وجود قيود على هذا البروتوكول هو أن الدوارات متزامنة جيدا يحتمل أن تكون بحساسية مفرطة. على سبيل المثال، عند فحص المواد الكيميائية التي تمتد عمر، قد تفشل بعض المواد الكيميائية فحص بواسطة هذا البروتوكول للكشف عن آثار كبيرة على أعمار من الدوارات سيئة متزامنة (على سبيل المثال، والأفراد من الأنواع البرية ودفعة مثقف). وبالتالي، ينبغي أن تفسر نتائج هذه التجارب بحذر. كما تم الإبلاغ عن تأثير عمر الأم في الوقت المحدد ذرية بقاء في نماذج اللافقارية الأخرى بما فيها ذبابة الفاكهة ذبابة الفاكهة والديدان الخيطية انواع معينة ايليجانس 39،40. على الرغم من أنه هو أكثر في هذه النماذج عمرا طويلا تستغرق وقتا طويلا، فإن إجراء المزامنة على مدى عدة أجيال تكون مفيدة لهذه الحيوانات لتقليل الاختلافات التجريبية في قياس الوقت البقاء على قيد الحياة.

الدوارات هي المجهري العوالق الحيوانية عالمية (&lt;1 مم) التي تشكل الأسرة في اللغات الدوارات 1. لديهم خطة هيئة بسيطة تتألف من حوالي 1000 الخلايا الجسدية فضلا عن جهاز الهدبية عجلة تشبه مميزة تسمى الهالة، والذي يستخدم لتنقل والتغذية. معظم الدوارات تنتمي إلى الطبقات Monogononta أو Bdelloidea، والتي تحتوي على حوالي 1600 و 500 نوعا، على التوالي 2. يكون الدوارات Monogonont عموما مرحلتي الإنجابية الجنسية واللاجنسية (التوالد العذري الدوري)، في حين تتكاثر الدوارات bdelloid من التوالد العذري اجبة 3. ومن الممكن بالتالي الحصول على الأفراد حيدة الخلية والروتيفر متطابقة وراثيا، والتي تضمن استنساخ عالية في التجارب. وبالإضافة إلى ذلك، لديهم العديد من المزايا الأخرى مثل الكائنات النموذج، مثل عمر قصير، وسهولة الثقافة، وتوافر الجينومية وtranscriptomic البيانات تسلسل 4-7، وموقف النشوء والتطور الفريد من بعيدrthropods والديدان الخيطية 8. ولذلك الدوارات واعدة نماذج اللافقارية في الايكولوجية، السمية، والدراسات 9-12 الشيخوخة. الوقت البقاء على قيد الحياة تحت التعرض للإجهاد البيئي أو المواد الكيميائية غير معلمة قياس في كثير من الأحيان في هذه المجالات البحثية 13-19. ومع ذلك، هناك حاجة إلى الحذر عند قياس الوقت البقاء على قيد الحياة من الدوارات لأنها عرضة للظروف البيئية أمهاتهم. وهي، في monogonont manjavacas حيدة الخلية والروتيفر Brachionus، المواليد الإناث من الأمهات الذين تتراوح أعمارهم بين لها عمر أقصر من تلك التي من الأمهات الشابات. ومع ذلك، وتقييد السعرات الحرارية الأمهات (CR) تعوض جزئيا من الآثار الضارة للمتقدم عمر الأم 20. في B. plicatilis، توفر CR الأمهات طول العمر ذرية، وقت بقاء طويل تحت التجويع، وارتفاع الأكسدة المقاومة الضغط المرتبطة مع تعزيز التعبير عن الانزيمات المضادة للأكسدة 21،22. تأثير عمر الأمكما لوحظ في الدوارات bdelloid 23. ولذلك، فإن ظروف الدوارات التجريبية يجب أن تكون متزامنة بعناية على مدى عدة أجيال قبل أن قياسات الوقت البقاء على قيد الحياة. نحن هنا نقدم بروتوكول لقياس الوقت البقاء على قيد الحياة في الدوارات Brachionus التالية تزامن الظروف والثقافة على مدى عدة أجيال. الصوم المتقطع (IF)، والاختلاف من CR حيث يتم تغذية الدوارات بشكل دوري، تم تطبيق للكشف عن تأثير التزامن بسبب الآثار المعروفة للIF على طول العمر 22،24.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="688">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:135px;">Wako</td>
			<td style="width:119px;">190-13921</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Magnesium chloride</td>
			<td style="width:135px;">Wako</td>
			<td style="width:119px;">136-03995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Magnesium sulfate</td>
			<td style="width:135px;">Wako</td>
			<td>131-00427</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:135px;">Wako</td>
			<td style="width:119px;">168-22111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Calcium chloride</td>
			<td style="width:135px;">Wako</td>
			<td style="width:119px;">035-00455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Sodium bicarbonate</td>
			<td style="width:135px;">Wako</td>
			<td style="width:119px;">199-05985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Sodium bromide</td>
			<td style="width:135px;">Wako</td>
			<td style="width:119px;">190-01515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Membrane filter (0.45 &#181;m pore size)</td>
			<td style="width:135px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">HAWP04700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Culture plate, 6-well, non-treated</td>
			<td style="width:135px;">Thomas Scientific</td>
			<td style="width:119px;">6902D01</td>
			<td>Flat bottom</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">Culture plate, 48-well, non-treated</td>
			<td style="width:135px;">Thomas Scientific</td>
			<td style="width:119px;">6902D07</td>
			<td>Flat bottom</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:268px;">Tetraselmis, Living</td>
			<td style="width:135px;">Carolina Biological Supply Company</td>
			<td style="width:119px;">152610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:268px;">PRISM 6</td>
			<td style="width:135px;">GraphPad Software</td>
			<td style="width:119px;">Version 6.0d</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of survival time in brachionus rotifers: synchronization of maternal conditions

Rotifers are microscopic cosmopolitan zooplankton used as models in ecotoxicological and aging studies due to their several advantages such as short lifespan, ease of culture, and parthenogenesis that enables clonal culture. However, caution is required when measuring their survival time as it is affected by maternal age and maternal feeding conditions. Here we provide a protocol for powerful and reproducible measurement of the survival time in Brachionus rotifers following a careful synchronization of culture conditions over several generations. Empirically, poor synchronization results in early mortality and a gradual decrease in survival rate, thus resulting in weak statistical power. Indeed, under such conditions, calorie restriction (CR) failed to significantly extend the lifespan of B. plicatilis although CR-induced longevity has been demonstrated with well-synchronized rotifer samples in past and present studies. This protocol is probably useful for other invertebrate models, including the fruitfly Drosophila melanogaster and the nematode Caenorhabditis elegans, because maternal age effects have also been reported in these species.

ويبين الشكل 1 منحنيات البقاء على قيد الحياة تمثيلية من السكان سيئة متزامنة (من أصل اثنين مكررات). في هذه التجربة، كانت الدوارات إما كل يوم بتغذية [libitum الإعلانية مجموعة (AL)] أو مرة كل يومين (IF المجموعة). كان بقاء متوسط ​​13 و 18 يوما في سورة وإذا المجموعات، على التوالي. على الرغم من أنه من المعروف أنه إذا يمتد عمر حيدة الخلية والروتيفر، فشلت هذه التجربة لاكتشاف فروق ذات دلالة إحصائية بين أعمار من سورة وإذا المجموعات. تجريبيا، غير كافية النتائج التزامن في الوفاة المبكرة وانخفاض تدريجي في معدل البقاء على قيد الحياة كما لاحظ في هذه التجربة. الأضرار التي لحقت الدوارات الناجمة عن المعاملة غير اللائقة أو انخفاض جودة المياه للسكان من الباطن يميل إلى تحقيق نتائج مماثلة. عندما تكون الظروف حيدة الخلية والروتيفر الأمثل ومتزامنة بشكل جيد، لا يكاد يلاحظ الوفاة المبكرة وaccordinالغليسين الدوارات تميل للموت بطريقة متزامنة خلال مرحلة لاحقة من تجربة (الشكل 2). كان بقاء متوسط ​​13 و 20 يوما في سورة وإذا المجموعات، على التوالي. رغم استخدام عدد أقل من الحيوانات من التجربة في الشكل 1، كان الفارق في العمر بين هذه المجموعات ذات دلالة إحصائية. هذه هي نتائج ممثلة من أكثر من خمس تجارب التي تم نشرها سابقا 22. <img alt="شكل 1" src="/files/ftp_upload/54126/54126fig1.jpg" /> الشكل 1: منحنيات كابلان-ماير للأفراد سيئة متزامنة تعرض لالصوم المتقطع (IF) تم تغذية المجموعة AL الإرضاع بحسب الرغبة في كافة مراحل التجربة، في حين تم تغذية المجموعة إذا كل يوم. N = 11 و N = 12 لسورة وإذا المجموعات، على التوالي (N يشير إلى عدد من الأفراد المستخدمة في التجربة). كان ادائها التجربةميد عند 25 درجة مئوية. تم الكشف لا يوجد فرق كبير في العمر عندما تم استخدام اختبار سجل رتبة (P = 0.1207). ومع ذلك، هذه البيانات من الصعب تفسير لاختبار سجل رتبة لا ينبغي أن تستخدم للمقارنة بين منحنيات البقاء على قيد الحياة على الرغم من أن معبر الاختبار هو معروف أن تكون قوية (36). توجد طرق إنشاء متوفرة للعبور المنحنيات بقاء مع البيانات للرقابة. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54126/54126fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/54126/54126fig2.jpg" /> الشكل 2: منحنيات كابلان-ماير للأفراد متزامنة تعرض لIF، تعرض فوج حيدة الخلية والروتيفر، التي حصلت عليها قبل الثقافة لنفسه إذا كان الجدول الزمني (تغذية كل يوم). N = 6 و N = 8 لAL وإذا المجموعات، على التوالي. تم إجراء التجربة على 25 درجة مئوية. سجل-اختبار رتبة، P = 0.0057. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54126/54126fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Survival Time in Brachionus Rotifers: Synchronization of Maternal Conditions at JoVE.com

Measurement of Survival Time in Brachionus Rotifers: Synchronization of Maternal Conditions

Rotifers are microscopic zooplankton used as models in ecotoxicological and aging studies. Here we provide a protocol for powerful and reproducible measurement of survival time in Brachionus rotifers. Synchronization of culture conditions over several generations is of particular importance because maternal condition affects life history of offspring.

قياس الوقت البقاء على قيد الحياة في<em&gt; Brachionus</em&gt; الروتيفيرا: التزامن من شروط صحة الأم

Rotifers are microscopic cosmopolitan zooplankton used as models in ecotoxicological and aging studies due to their several advantages such as short ...

measurement-survival-time-brachionus-rotifers-synchronization

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Measurement of Survival Time in Brachionus Rotifers: Synchronization of Maternal Conditions

8.4K Views.  The University of Tokyo. Rotifers are microscopic zooplankton used as models in ecotoxicological and aging studies. Here we provide a protocol for powerful and reproducible measurement of survival time in Brachionus rotifers. Synchronization of culture conditions over several generations is of particular importance because maternal condition affects life history of offspring.

Video: Measurement of Survival Time in Brachionus Rotifers: Synchronization of Maternal Conditions

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

الوقت الفاصل بين مرحلة التطور الجنيني المبكر من الميكروسكوب في انواع معينة ايليجانس

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

الأساسية<em&gt; Caenorhabditis ايليجانس</em&gt; طرق: التزامن والمراقبة

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Formulations for Freeze-drying of Bacteria and Their Influence on Cell Survival

Cellular water can be removed to reversibly inactivate microorganisms to facilitate storage. One such method of removal is freeze-drying, which is considered a gentle dehydration method. To facilitate cell survival during drying, the cells are often formulated beforehand. The formulation forms a matrix that embeds the cells and protects them from various harmful stresses imposed on the cells during freezing and drying. We present here a general method to evaluate the survival rate of cells after freeze-drying and we illustrate it by comparing the results obtained with four different formulations: the disaccharide sucrose, the sucrose derived polymer Ficoll PM400, and the respective polysaccharides hydroxyethyl cellulose (HEC) and hydroxypropyl methyl cellulose (HPMC), on two strains of bacteria, P. putida KT2440 and A. chlorophenolicus A6. In this work we illustrate how to prepare formulations for freeze-drying and how to investigate the mechanisms of cell survival after rehydration by characterizing the formulation using of differential scanning calorimetry (DSC), surface tension measurements, X-ray analysis, and electron microscopy and relating those data to survival rates. The polymers were chosen to get a monomeric structure of the respective polysaccharide resembling sucrose to a varying degrees. Using this method setup we showed that polymers can support cell survival as effectively as disaccharides if certain physical properties of the formulation are controlled1.

Freeze-drying is often an easy and convenient way to obtain dry products of viable bacterial cells. An issue of the process is cell survival. We detail here a procedure to investigate how cell survival during freeze-drying is influenced by the properties of the formulation used.

تركيبات لتجميد التجفيف من البكتيريا وتأثيرها على بقاء الخلية

Cellular water can be removed to reversibly inactivate microorganisms to facilitate storage. One such method of removal is freeze-drying, which is ...

Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis. Malregulated invasion and subsequent cell movement is characteristic of multiple pathological processes, including inflammation, cardiovascular disease and tumor cell metastasis1. Focalized proteolytic degradation of extracellular matrix (ECM) components in the epithelial or endothelial basement membrane is a critical step in initiating cellular invasion. In tumor cells, extensive in vitro analysis has determined that ECM degradation is accomplished by ventral actin-rich membrane protrusive structures termed invadopodia2,3. Invadopodia form in close apposition to the ECM, where they moderate ECM breakdown through the action of matrix metalloproteinases (MMPs). The ability of tumor cells to form invadopodia directly correlates with the ability to invade into local stroma and associated vascular components3. 
Visualization of invadopodia-mediated ECM degradation of cells by fluorescent microscopy using dye-labeled matrix proteins coated onto glass coverslips has emerged as the most prevalent technique for evaluating the degree of matrix proteolysis and cellular invasive potential4,5. Here we describe a version of the standard method for generating fluorescently-labeled glass coverslips utilizing a commercially available Oregon Green-488 gelatin conjugate. This method is easily scaled to rapidly produce large numbers of coated coverslips. We show some of the common microscopic artifacts that are often encountered during this procedure and how these can be avoided. Finally, we describe standardized methods using readily available computer software to allow quantification of labeled gelatin matrix degradation mediated by individual cells and by entire cellular populations. The described procedures provide the ability to accurately and reproducibly monitor invadopodia activity, and can also serve as a platform for evaluating the efficacy of modulating protein expression or testing of anti-invasive compounds on extracellular matrix degradation in single and multicellular settings.

We describe the prototypical method for producing microscope coverslips coated with fluorescent gelatin for visualizing invadopodia-mediated matrix degradation. Computational techniques using available software are presented for quantifying the resultant levels of matrix proteolysis by single cells within a mixed population and for multicellular groups encompassing entire microscopic fields.

قياس كمية Invadopodia بوساطة التحلل البروتيني المصفوفة خارج الخلية في سياقات متعددة الخلايا واحدة و

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis.  Malregulated invasion and subsequent cell movement is ...

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced physical performance and increased risk of disease. Individual aging is manifest at the population level as an increase in age-dependent mortality, which is often measured in the laboratory by observing lifespan in large cohorts of age-matched individuals. Experiments that seek to quantify the extent to which genetic or environmental manipulations impact lifespan in simple model organisms have been remarkably successful for understanding the aspects of aging that are conserved across taxa and for inspiring new strategies for extending lifespan and preventing age-associated disease in mammals.
The vinegar fly, Drosophila melanogaster, is an attractive model organism for studying the mechanisms of aging due to its relatively short lifespan, convenient husbandry, and facile genetics. However, demographic measures of aging, including age-specific survival and mortality, are extraordinarily susceptible to even minor variations in experimental design and environment, and the maintenance of strict laboratory practices for the duration of aging experiments is required. These considerations, together with the need to practice careful control of genetic background, are essential for generating robust measurements. Indeed, there are many notable controversies surrounding inference from longevity experiments in yeast, worms, flies and mice that have been traced to environmental or genetic artifacts1-4. In this protocol, we describe a set of procedures that have been optimized over many years of measuring longevity in Drosophila using laboratory vials. We also describe the use of the dLife software, which was developed by our laboratory and is available for download (<a href="http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software">http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software</a>). dLife accelerates throughput and promotes good practices by incorporating optimal experimental design, simplifying fly handling and data collection, and standardizing data analysis. We will also discuss the many potential pitfalls in the design, collection, and interpretation of lifespan data, and we provide steps to avoid these dangers.

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster is a powerful model organism for exploring the molecular basis of longevity regulation. This protocol will discuss the steps involved in generating a reproducible, population-based measurement of longevity as well as potential pitfalls and how to avoid them.

قياس عمر في<em&gt; ذبابة الفاكهة الدروسوفيلا</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in various molecular and cellular processes such as gene transcription, translation, cell differentiation and cell proliferation. The biosynthesis levels of heme vary across different tissues and cell types and is altered in diseased conditions such as anemia, neuropathy and cancer. This technique uses [4-14C] 5-aminolevulinic acid ([14C] 5-ALA), one of the early precursors in the heme biosynthesis pathway to measure the levels of heme synthesis in mammalian cells. This assay involves incubation of cells with [14C] 5-ALA followed by extraction of heme and measurement of the radioactivity incorporated into heme. This procedure is accurate and quick. This method measures the relative levels of heme biosynthesis rather than the total heme content. To demonstrate the use of this technique the levels of heme biosynthesis were measured in several mammalian cell lines.

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

قياس مستويات هيم في تخليق خلايا الثدييات

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

قياس معدل الأيض في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; باستخدام قياس التنفس

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that provides an accurate and reproducible analysis. Probe-based chemistry offers the least background fluorescence as compared to other (dye-based) chemistries. Presently, there are several platforms available that use probe-based chemistry to quantitate transcript abundance. qPCR in a 96 well plate is the most routinely used method, however only a maximum of 96 samples or miRNAs can be tested in a single run. This is time-consuming and tedious if a large number of samples/miRNAs are to be analyzed. High-throughput probe-based platforms such as microfluidics (e.g. TaqMan Array Card) and nanofluidics arrays (e.g. OpenArray) offer ease to reproducibly and efficiently detect the abundance of multiple microRNAs in a large number of samples in a short time. Here, we demonstrate the experimental setup and protocol for miRNA quantitation from serum or plasma-EDTA samples, using probe-based chemistry and three different platforms (96 well plate, microfluidics and nanofluidics arrays) offering increasing levels of throughput.

Circulating microRNAs have recently emerged as promising and novel biomarkers for various cancers and other diseases. The goal of this article is to discuss three different probe-based real-time PCR platforms and methods that are available to quantify and determine the abundance of circulating microRNAs.

يستند التحقيق، في الوقت الحقيقي PCR مقاربات للقياس الكمي من microRNAs

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

Synchronization of Caulobacter Crescentus for Investigation of the Bacterial Cell Cycle

The cell cycle is important for growth, genome replication, and development in all cells. In bacteria, studies of the cell cycle have focused largely on unsynchronized cells making it difficult to order the temporal events required for cell cycle progression, genome replication, and division. Caulobacter crescentus provides an excellent model system for the bacterial cell cycle whereby cells can be rapidly synchronized in a G0 state by density centrifugation. Cell cycle synchronization experiments have been used to establish the molecular events governing chromosome replication and segregation, to map a genetic regulatory network controlling cell cycle progression, and to identify the establishment of polar signaling complexes required for asymmetric cell division. Here we provide a detailed protocol for the rapid synchronization of Caulobacter NA1000 cells. Synchronization can be performed in a large-scale format for gene expression profiling and western blot assays, as well as a small-scale format for microscopy or FACS assays. The rapid synchronizability and high cell yields of Caulobacter make this organism a powerful model system for studies of the bacterial cell cycle.

Synchronization of Caulobacter Crescentus for Investigation of the Bacterial Cell Cycle

Synchronization of bacterial cells is essential for studies of the bacterial cell cycle and development. Caulobacter crescentus is synchronizable through density centrifugation allowing a rapid and powerful tool for studies of the bacterial cell cycle. Here we provide a detailed protocol for the synchronization of Caulobacter cells.

تزامن<em&gt; العنيقاء Crescentus</em&gt; للتحقيق في دورة الخلية البكتيرية

The cell cycle is important for growth, genome replication, and development in all cells.  In bacteria, studies of the cell cycle have focused largely on ...

Temporal Tracking of Cell Cycle Progression Using Flow Cytometry without the Need for Synchronization

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell synchronization can be difficult for many cell systems. Standard practice is to block cell cycle progression at a specific stage and then release the accumulated cells producing a wave of cells progressing through the cycle in unison. However, some cell types find this block toxic resulting in abnormal cell cycling, or even mass death. Bromodeoxyuridine (BrdU) uptake can be used to track the cell cycle stage of individual cells. Cells incorporate this synthetic thymidine analog, while synthesizing new DNA during S phase. By providing BrdU for a brief period it is possible to mark a pool of cells that were in S phase while the BrdU was present. These cells can then be tracked through the remainder of the cell cycle and into the next round of replication, permitting the duration of the cell cycle phases to be determined without the need to induce a potentially toxic cell cycle block. It is also possible to determine and correlate the expression of both internal and external proteins during subsequent stages of the cell cycle. These can be used to further refine the assignment of cell cycle stage or assess effects on other cellular functions such as checkpoint activation or cell death.

This protocol describes the use of bromodeoxyuridine (BrdU) uptake to permit the temporal tracking of cells that were in S phase at a specific point in time. Addition of DNA dyes and antibody labeling facilitates detailed analysis of the fate of the S phase cells at later times.

تتبع الزمني للتقدم دورة الخلية باستخدام التدفق الخلوي دون الحاجة إلى مزامنة

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell ...