The author thanks Hugo Juraver-Geslin, Marion Wassef and Anne H&#233;l&#232;ne Monsoro-Burq for their help and advice, and the Animal Facility of the Institut Curie. The author thanks Paul Johnson for his editing work on the manuscript. This work was supported by the Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS UMR8197, INSERM U1024) and by grants from the "Association pour la Recherche sur le Cancer" (ARC 4972 and ARC 5115; FRC DOC20120605233 and LABEX Memolife) and the Fondation Pierre Gilles de Gennes (FPGG0039).

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The authors have nothing to disclose.

神経発生は（3,31,32に投稿）周囲の組織からの細胞の発生プログラムと信号間の複雑な相互作用によって編成されます。ここでは、Xで使用することができるプロトコルのセットを記述し外因性およびin vitroおよびin vivoでの神経運命の決意と神経形態形成に関与する内因性の要因を探るために胚をアフリカツメガエル 。これらのプロトコルは、Xでそのまま使用することができしかしトロピカ胚 、X.トロピカ胚は、Xの後、4倍小さく、胚をアフリカツメガエル 。鉗子やタングステン針の両方が微細化する必要性を使用していました。可能な場合は、Xを使用しますアフリカツメガエル 。 Xの正確な可視化ツメガエルとX.トロピカ神経組織原のフィールドは、WM-ISHから解剖し、神経管の組織学的フラットマウントを使用して達成することができます。この手法は、X上で正常に実行されましたステージ26からの胚をアフリカツメガエルステージ45（ 図1）とX上 45 8,33をステージングするステージ30からトロピカ胚 。古い胚はその後、若い胚を解剖するのが容易です。この手法は、実行するのは簡単です。これは、異なる発生段階の神経管に、個別にまたは組み合わせて、遺伝子発現パターンの解析が可能になります。このプロトコルを用いると、相互に神経管の片側を比較することは容易です。これは、 アフリカツメガエル GOFとLOF実験に非常に有用です。神経管の注入側に観察欠陥を直接制御側で観察さ正常な発生事象と比較することができます。この戦略は、Xの GOFとLOF表現型を分析するために使用されています胚に8,33を アフリカツメガエル 。このプロトコルにおける一つの重要なステップは、胚組織の正しい固定です。不完全な固定は、神経管から外胚葉の効率的な分離を防ぐことができます。神経管のプレ解剖は、SIT内の浸透を促進しますUプローブ。しかし一度単離されると、それは神経管を失うのは簡単です。これは、任意の損失を防ぐために、ISH手順の間に胚の一部を維持することをお勧めします。 これらのすべての実験に使用した胚は、堅牢で、よく治癒する必要がありますする必要があります。不健康な胚の任意のバッチを捨てます。ステージ13とステージ15との間のACおよび移植片の外植片を分析するためには、Xを成長させることが可能です（12〜18°Cと18〜20°Cから）様々な温度で外植片と胚をアフリカツメガエル 。注目すべきX.胚細胞は、任意の外部の栄養素を添加せずに数日間の生存を可能にするために十分な卵黄を含まツメガエル 。胚組織、胚のいずれかの転送手順を傷つけないために、AC、または外植片を慎重に行う必要があります。その場合は、必要に応じて、その端部に先端カットしてプラスチック製のトランスファーピペットまたはマイクロピペットのいずれかを使用することをお勧めします。先端の直径は、胚の大きさ、または外植片の大きさに調整され、転送されます。これは、0.1％のBSA溶液でコーティングピペットプラスチックに、組織​​の小片の付着を防止し、注意に値します。 AC植片は、時間と空間、制御された方法で強制的に遺伝子発現を介して、または外因性の要因への曝露を介してプログラムすることができます。私たちは、外植片とビードとの間の直接接触を介してローカルの誘導を可能にする技術が記載されています。必要に応じてビーズはさらに鉗子を使用して断片化することができます。他の前述の戦略と比較して、この技術は、正確な時間窓内に、単独で、または組み合わせて、純粋な要因、ローカル誘導の試験を可能にします。 細胞解離および再会合34の前述したアプローチを使用して、挟まれて混合AC外植片8に細胞運動能力、細胞分離挙動、および区画の境界の形成を調べることが可能です。細胞解離プロセスが15分未満で開始。シャキーンを避けますグラム解離工程中のプレートは、細胞の損失を防止します。 AC着色された層が十分に解離しません。これは、解離工程の間にそれらを削除することをお勧めします。 AC顔料着色層のカップルが再集計さ植片に残っています。これは、移植片を視覚化するのに役立ちます。それは、後に発生段階の分析を妨げることはありません。 本稿では神経板に混入した外植片を移植するためのプロトコルは、詳細です。 アフリカツメガエル胚では、神経板は、これらの段階は、したがって神経上皮内の移植に適したステージ13と、ステージ15との間に開いている。X.接着性が経時的に変化する組織をアフリカツメガエル 。これは、同じような発達段階でホストにAC植片を移植することが重要です。初期の発達段階では、X。非常に高速な3/4 NAM修復に成長した胚をアフリカツメガエル 。いくつかの胚は卵黄膜を除去する際に損傷を受けた場合は、15分を待つことが有用であり得ます、これは治癒過程が起こるのに必要な時間です​​。挿入は、移植された宿主組織の上にカバーガラスの作品を置くことによって好まれることができますが、それは必須ではありません。治癒過程で生成された力は、移植された細胞を押し出すことができます。移植片は、カバーガラスと同様に、外部からの圧力でそれに強制されたときに宿主胚の形態をよりよく保存されています。移植の成功を評価するために、蛍光トレーサーは、外植片に注入することができます。神経管が閉じるまでグラフト化胚内の蛍光細胞の存在を可視化することができます。交流文化や移植実験における主な欠点は、細菌や真菌汚染の周波数です。プロトコルの各ステップで皿汚染を避けるために、できるだけ頻繁にクリーンまたは滅菌材料と無菌溶液を使用してください。グラフトされた胚の長期培養のために常に抗生物質及び15℃の温度を使用しています。アガロースとの交流植片または胚の長期の接触を避けてください。我々はobservそれは外植片の平均寿命を低下させることができること編。グラフト技術は強力が、時間がかかります。それはそれで運命の決意の手がかりをスクリーニングすることはお勧めできませんが、事前に選択のあなたの組織に十分な情報を取得します。 その伝統的な利点の他に、 アフリカツメガエルの最近の遺伝的進歩は、このために道を開きました 深いRNA配列決定およびChromatide免疫沈降シーケンシング（チップ配列）5,35によって大規模ゲノム解析を用いた遺伝子制御ネットワークを探索するためのモデルシステム。初期胚発生をカバーする優れたRNAseqとチップのSeq参照データセットがあります。 ChIP-seqの分析の欠点の一つは、大量の材料を収集する必要があることです。 AC外植片のプログラミングは、特定の神経組織の大量生産を可能にし、少なくとも部分的に、この技術的な限界を克服するのに役立ちます。 神経管器官の基礎となる発生プログラムogenesisは、主に、特に脊椎動物では、保存されています。両生類を使用して取得した情報は、脊椎動物の発生25,32,36-38の基礎となる細胞および分子過程の理解に役立ちます。人工多能性幹細胞（性IPSC）の分野における最近の進歩は、再生医療創薬の研究のためのゲートウェイを開きました。 iPS細胞は、転写因子の組み合わせを用いて体細胞からプログラムされます。幹細胞のプログラミングキューの検索が進行中です。アッセイは、薬物スクリーニングに使用することができ、in vitroでの神経由来の細胞型を生成するための平均値を提供する、ここで説明します。彼らはまた、性IPSC 39,40のさらなる再プログラミングのために使用することができる神経運命決定因子をテストするための、安価で高速な方法を提供します。

脊椎動物の神経系は神経上皮細胞の均質層として神経板から出てきます。発生プログラムは、神経板の地域化の際に、誘導された符号化され、確立されている方法を理解することは、現時点では、発生生物学の主要な目標です。他のシステムと比較して、実験的に影響を受けやすいアフリカツメガエル胚は神経発達1,2の初期段階を分析するための選択のモデルです。これは、胚を大量に得ることが容易であり、外部の開発は神経胚形成3の非常に最初のステップへのアクセスを提供します。多くのツールは、実験的にアフリカツメガエル （ アフリカツメガエル）胚発生を操作するために利用可能です。一緒に生化学的および薬理学的ツールで誘導MOを含めたmRNAまたはモルフォリノ（MO）のマイクロインジェクション、関数（GOF）および機能喪失（LOF）および経路4,5シグナリングの特定の改変の制御ゲインができます。 BLA胞胚の動物極の周りに配置stocoel屋根外胚葉、または非常に初期原腸胚、および「アニマルキャップ」（AC）とも呼ばれる前に遺伝子発現を操作することによってプログラムすることができる多能性細胞の供給源であります準備を外植片。この原稿ではXを使用するための詳細なプロトコルは、 ツメガエル交流植片は、in vitroおよびin vivo分子機構および細胞プロセス基盤となる神経の発達にテストします。 技術は、 アフリカツメガエルのオタマジャクシの神経管における遺伝子発現パターンの微細な観察 ​​を可能にする、運命の決意キューの同定における予備段階を提示しています。フラットマウント組織の観察は、一般にニワトリ胚6の研究で使用されるが、それは適切にアフリカツメガエルに記載されていません。 2または4細胞期胚の割球に合成mRNAまたはMOを注入することにより、遺伝子発現の操作は、ACのプログラミングを可能にします外植4。抗BMP要因ノギンの発現による骨形成タンパク質（BMP）経路の例を阻害するために、AC細胞3に神経アイデンティティを与えます。プロトコルは、陰イオン交換樹脂ビーズとの直接接触を介して、外因性の合図にAC外植片の局所及び露光時間制御を行うために詳述されています。最後に、技術は、解離および再会合プログラムの異なる細胞から調製した混合植片の移植により、インビボで神経前駆細胞の発達の機能をテストするために記載されています。 カエルの胚は、初期の脊椎動物の神経発達を研究するための強力なモデルです。 体外培養で外植片に遺伝子発現の操作を組み合わせることにより、神経上皮の地域化、増殖、および形態形成7-12の研究に重要な情報を提供しています。交流外植片のプログラミングは 、ex vivo 13,14の機能の心臓の開発を可能にしました。使用15を移植植片の神経堤分化プログラム16を誘導する最小の転写スイッチの同定につながりました。 透明帯境界のintrathalamica（ZLI）は尾側前脳の成長と地域化を制御するために、ソニックヘッジホッグ（Shhのを）分泌シグナルセンターです。連続のShhにさらされると、3転写因子の遺伝子を共発現神経上皮細胞- BARH様ホメオボックス2（barhl2）、orthodenticle-2（OTX2）とイロコイ-3（irx3 は） - ZLI室の二つの特徴を取得する：能力へSHH発現し、前方神経板の細胞から分離する能力。モデル系として、神経上皮細胞へのZLIの運命の誘導は8に提示されます。 これらのプロトコルは、基本的なMECを探索するために発達生物学者や他の研究者のための単純な、安く、効率的なツールを提供することを目指してキー神経細胞の挙動のhanisms。これらのプロトコルは、非常に汎用性であり、外因性および内因性神経決意合図の大規模な範囲の調査を可能にします。これは、神経系統のコミットメント、誘導性相互作用および細胞行動の生体分析に長期を可能にします。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>VWR</td>
			<td>&#160;20909.290</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anion exchange resin beads</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>140- 1231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin&#160;</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A-7888</td>
			<td>For culture of animal cappH 7.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycine&#160;</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15751-045&#160;</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A7906</td>
			<td>&#160;for bead preparation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stem cell-like xenopus embryonic explants to study early neural developmental features in vitro and in vivo

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent. These cells can be isolated, and programmed to generate various tissues through manipulation of genes expression or induction by morphogens. In this manuscript protocols are described for the use of Xenopus laevis blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development. These protocols allow the investigation of fate acquisition, cell migration behaviors, and cell autonomous and non-autonomous properties. The blastocoel roof explants can be cultured in a serum-free defined medium and grafted into host embryos. This transplantation into an embryo allows the investigation of the long-term lineage commitment, the inductive properties, and the behavior of transplanted cells in vivo. These assays can be exploited to investigate molecular mechanisms, cellular processes and gene regulatory networks underlying neural development. In the context of regenerative medicine, these assays provide a means to generate neural-derived cell types in vitro that could be used in drug screening.

異なる種、発生学的操作、および調節遺伝子の発現パターンの形態学的考察に基づいて、概念モデルは、神経板が別個の組織原のフィールドを生成発達グリッドを定義し、横方向と縦方向のセグメントに分割されていることを保持しています。神経板では、前脳、中脳、後脳と脊髄の原基はすべて、すでに（23-25 ​​で検討）原腸陥入時に前後（AP）軸に沿って確立されています。神経胚形成の間に、組織原のフィールドは、遺伝子発現の空間的に制限された領域として検出することができます。調節遺伝子の発現パターンに基づいて、前脳の原基はprosomeres（P）と呼ばれる別個の組織原のフィールドを生成し6の横方向のセグメントに分割されます。各prosomereは腹側（基礎）及び（26,27に投稿）背側（鼻翼）の部分に分割されています。両生類では、prosomere 2（P2）は、視床上部と視床へとそのオーガナイザー（28,29に概説されている）、Z ONA L imitans 私 ntrathalamica（ZLI）8を生じさせます。 図1には、Xのフラットマウントを示していますツメガエルとX.トロピカ前方神経ステージ30、32でチューブ、およびWM-DISH後の35。 WM-ISHは、それがそれぞれこと終脳とP3、P2をマークbarhl2、皮質裾と中脳、イロコイ-1（irx1） をマークし、 イロコイ-3（irx3）fezf2転写因子のためのプローブを使用してプロトコル1に従って実施しましたマーク尾P2と鼻翼P2およびZLI、前脳基底部及び中脳（ 図1E）をマークしモルフォゲンSHHのため。種々の遺伝子発現パターンの比較分析は、その前方の限界を明らかに barhlの2 P2式はP3でfezf2式の尾限界（ 図1A）を接している。irx3は将来ZLI（ 図1B）でSHHと共発現されます。 P2 irx1発現ドメインの内部SHH（ 図1C）8のものと相補的です。 Xの barhl2の発現パターンステージ35でトロピカは、 図1Dに示されています。現像両生類前脳におけるこれらの遺伝子の発現の地域の概略図は図1Eに設けられています。 プロトコル2を使用して、SHHの発現を誘導するためのShhに浸した陰イオン交換樹脂ビーズの能力がACS植片において調べた。X.ステージ胚はbarhl2、一緒に前方神経上皮誘導因子のノギンをコードするmRNAと4と8個の細胞で4動物割球に注入したアフリカツメガエル O射出トレーサーとしてTX2、irx3 および GFP。抗BMP因子ノギンの発現は、BMP経路を阻害し、AC細胞3に神経アイデンティティを与えます。我々はAnteriorisedアニマルキャップ（AAC）としてノギンを表す交流を参照してください。説明したように胞胚腔屋根外植片をAACSは、分泌N末端部分を含有する馴化培地（CM）中に浸漬し、陰イオン交換樹脂ビーズと接触して18℃で48時間培養した、またはしないプロトコル2で調製しました。ラットからのモルフォゲンソニックヘッジホッグ（ShhのN-）。内因性SHHの発現は、ISH（ 図2）によって分析しました。 アフリカツメガエルSHH（Xshh）の発現は、N-Shhの（ 図2B）を使用せずに、CMに浸したビーズと接触した細胞におけるN-Shhのではなくて、CMに浸したビーズと接触した細胞で検出されています。 プロトコル3を一anothから分離する異なる細胞型の能力を使用してERを調べた。X.ツメガエル胚は、mRNAがまたはOTX2、barhl2とirx3なしノギンをコードするとステージ4と8個の細胞で4動物割球に注入示すように、使用していました トレーサー（ 図3A）のようßGalまたはGFP。段階8/9のACはßGal-およびGFPを発現する細胞の両方を含む混合神経上皮細胞からなる外植片を生成するために解離し、再凝集させました。再凝集外植片を18℃で48時間培養しました。 ßGal活動は30（ 図3A）に応じて赤で明らかになりました。細胞の挙動は、再凝集外植片内でのそれらの局在を追跡することによって観察されました。 AACS細胞はOTX2（赤）を発現AACS細胞と混合された外植片において、ßGal発現細胞は、GFP発現細胞から自由に混在した細胞の両方のタイプ（ 図3B、3C） を分離しません。対照的に、中細胞（GFP）をOTX2発現植片がBarhl2、OTX2、Irx3（BOI3）発現細胞（ßGal）と混合され、ßGal発現細胞（赤色）は粘着性パッチを形成し、（再凝集植片内に均一に広がりません図3D、3E）。 プロトコル4を使用して、プログラムされたAC細胞の挙動は 、インビボで調べた 。X.胚がbarhl2とirx3 単独または一緒 OTX2とノギンをコードするmRNAと4と8細胞の段階で4動物割球に注入したアフリカツメガエル 。ßGalは、トレーサーとして使用しました。並行して、胚を同様ノギンおよびラット（N-SHH）からモルフォゲンSHHの分泌されたN末端 ​​部分をコードするmRNAを注入しました。ステージ8/9でneuroepitの混合植片を生成するために、交流外植片を解離し、すぐに再凝集しますhelial細胞のいずれかを発現するN-のShhおよびOTX2、または表現するN-のShhとOTX2、Barhl2 そして、Irx3（BOI3）。混合植片の小片は、Xの神経板に移植しました移植された細胞は、ßGal染色（赤）でマークされたステージ14で胚ツメガエル 。段階35で、内因性のSHHの発現はISHによって分析しました。 Xの前方神経板に移植した場合胚は、BOI3とN-Shhを発現する細胞の混合植片がZLI細胞の特定の2つの機能が開発されたアフリカツメガエル ：移植された細胞は、Xshhを表明し、前方の神経上皮細胞（ 図3C）から分離。これに対して、OTX2からなる外植片を混合-及びN-Shh-発現細胞がXに移植し神経板をアフリカツメガエル 、移植された細胞は、SHH発現しなかったし、彼らの隣人（ 図3B）8から分離しませんでした。 Xから 図1.フラットマウントされた神経管 ツメガエル と X.トロピカ胚 は、二重ISHを全載 （A - D）。WM-ISH使用して実行されます fezf2、barhl2、irx1、irx3、および（A - C）上のプローブとしてSHH X.ステージ30、32で胚をアフリカツメガエル 、および35と、（D）は、Xステージ35でトロピカ胚が示されているように。代表的な胚の神経管を切開し、切開し、神経管は側面図、背アップ、前方左から示されているプロトコル1に記載のように平らに搭載されています。マーカーとステージが示されています。 P2の吻側および尾側の境界が矢印で示されています。 （AC）スケールバーは0.5ミリメートルの略です。 （D）のCALEバーは0.1ミリメートルの略です。 。st.30で前脳マーカーの（E）の回路図をbarhl2発現領域は、斜線で示されています。表現の領域はfezf2（ピンク）、SHH（赤）、irx3（黄色）とirx1（緑）のために示されています。 pはprosomereの略です。 P2の上部にある松果体が示されている。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53474/53474fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53474/53474fig2.jpg" /> 陰イオン交換樹脂ビーズとの接触を介してプログラム外植片における SHH の発現 図 2. 誘導 。小型のACは、トレーサーとしてGFPを、 ノギン 、barhl2、OTX2、およびirx3をコードするmRNAを注入した胚から調製されています。AACはFスタンドまたはAnteriorisedアニマルキャップ。 Barhl2、OTX2とIrx3（AAC BOI3）を発現AAC植片は、馴化培地（CM）に浸したビーズと接触して48時間培養している示されているように、N-のShhを含まない、またはいずれか。外植片は、 アフリカツメガエル （X）SHHの発現についてISHによって分析されます。スケールバーは0.5ミリメートルの略です。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53474/53474fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53474/53474fig3.jpg" /> 再集計した外植片における細胞分離の挙動の 図3. 分析。（A） &#160;示されるように、 アフリカツメガエル胚を ノギン 、OTX2、barhl2とirx3をコードするmRNAを注入しています。 ßGalとGFPは、トレーサーとして使用されています。段階では8/9小さなACSが用意されています<html> GFP /ßGal混合細胞型で作られた外植片を生成するために、解離及び再凝集。外植片を18℃で48時間培養し、ßGal活動は（赤）を明らかにされています。 （B - E）が示されて示されるように、タンパク質を発現する混合セルで構成される代表植片。 AACはAnteriorisedアニマルキャップの略です。 ACの細胞発現ノギン（GFP）と混合した場合（B、C）、ノギン及びOTX2（ßGal）を発現する細胞のACは、ランダムに広がります。 （C）（B）の拡大図。 Barhl2、OTX2とIrx3（BOI3）（ßGal）を発現する（D）AACS細胞を再編成し、OTX2（GFP）を発現するAACS細胞から分離。 （E）（D）の拡大図。 （B、D）スケールバーは0.5ミリメートルの略です。 （C、E）スケールバーは0.2ミリメートルの略です。G &quot;ターゲット=&quot; _空白 &quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/53474/53474fig4.jpg" /> ステージ14胚の神経板にグラフトされたとき、 図4. プログラムされた外植片を、その開発機能を示す （A）実験スキーム：AACSが示されているようなmRNAを注入した胚から調製されます。段階で胞胚腔の屋根から8/9の細胞をßGal（赤）を発現する混合細胞型で作られた外植片を生成するために解離し、再凝集されます。彼らの兄弟が前方神経板内の切開の中に置かれたステージ14混合植片（緑の四角形）の小片に達するまで、外植片を培養します。運営胚を35運営胚はXを使用して、WM-ISHによって分析される段階まで成長させ、 ツメガエル SHH（Xshh）プローブとして。 ßGal活動は赤ACCで明らかにされています30にオーデイング。 （B、C）段階のグラフトされた側は35代表神経管が示されているが、側面図、背アップ、前方左側。 OTX2及びN-Shhの発現を混合AACSでグラフトされた（B）。 Barhl2、OTX2、Irx3（BOI3）とN-Shhのを表現する混合AACSでグラフトされた（C）。移植された細胞は、赤い星で示されています。ピンクの星は前向き間脳を示している。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53474/53474fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

In Xenopus embryos, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent and can be programmed to generate various tissues. Here, we describe protocols to use amphibian blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development.

幹細胞様<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;胚外植片を早期神経発達の特徴を研究するために<em&gt;インビトロ</em&gt;と<em&gt;インビボ</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

7.9K ビュー.  Institut Curie. In Xenopus embryos, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent and can be programmed to generate various tissues. Here, we describe protocols to use amphibian blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development. 

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Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development. The Xenopuslaevis embryo is very useful for studying organogenesis because their large size makes them very suitable for identifying organs at the earliest steps in organogenesis. At this time, the primary method used for identifying a specific organ or primordium is whole mount in situ hybridization with labeled antisense RNA probes specific to a gene that is expressed in the organ of interest. In addition, it is relatively easy to manipulate genes or signaling pathways in Xenopus and in situ hybridization allows one to then assay for changes in the presence or morphology of a target organ. Whole mount in situ hybridization is a multi-day protocol with many steps involved. Here we provide a simplified protocol with reduced numbers of steps and reagents used that works well for routine assays. In situ hybridization robots have greatly facilitated the process and we detail how and when we utilize that technology in the process. Once an in situ hybridization is complete, capturing the best image of the result can be frustrating. We provide advice on how to optimize imaging of in situ hybridization results. Although the protocol describes assessing organogenesis in Xenopus laevis, the same basic protocol can almost certainly be adapted to Xenopus tropicalis and other model systems.

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

The Xenopus laevis embryo continues to be exceptionally useful in the study of early development due to its large size and ease of manipulation. A simplified protocol for whole mount in situ hybridization protocol is provided that can be used in the identification of specific organs in this model system.

簡体字を使用した初期の器官形成の理解<em&gt;その場で</em&gt;ハイブリダイゼーションプロトコルで<em&gt;アフリカツメガエル</em

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development.  The Xenopuslaevis embryo ...

発生生物学

Zebrafish Keratocyte Explants to Study Collective Cell Migration and Reepithelialization in Cutaneous Wound Healing

Due to their unique motile properties, fish keratocytes dissociated from explant cultures have long been used to study the mechanisms of single cell migration. However, when explants are established, these cells also move collectively, maintaining many of the features which make individual keratocytes an attractive model to study migration: rapid rates of motility, extensive actin-rich lamellae with a perpendicular actin cable, and relatively constant speed and direction of migration. In early explants, the rapid interconversion of cells migrating individually with those migrating collectively allows the study of the role of cell-cell adhesions in determining the mode of migration, and emphasizes the molecular links between the two modes of migration. Cells in later explants lose their ability to migrate rapidly and collectively as an epithelial to mesenchymal transition occurs and genes associated with wound healing and inflammation are differentially expressed. Thus, keratocyte explants can serve as an in vitro model for the reepithelialization that occurs during cutaneous wound healing and can represent a unique system to study mechanisms of collective cell migration in the context of a defined program of gene expression changes. A variety of mutant and transgenic zebrafish lines are available, which allows explants to be established from fish with different genetic backgrounds. This allows the role of different proteins within these processes to be uniquely addressed. The protocols outlined here describe an easy and effective method for establishing these explant cultures for use in a variety of assays related to collective cell migration.

Zebrafish keratocytes migrate in cell sheets from explants and provide an in vitro model for the study of the mechanisms of collective cell migration in the context of epithelial wound healing. These protocols detail an effective way to establish primary explant cultures for use in collective cell migration assays.

ゼブラフィッシュ角膜実質外植片は皮膚創傷治癒における集団細胞の移動および再上皮化を研究するために

Due to their unique motile properties, fish keratocytes dissociated from explant cultures have long been used to study the mechanisms of single cell ...

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during oogenesis. In order to study roles of such maternal factors in early embryonic development, it is desirable to manipulate their functions from the very beginning of embryonic development. Conventional ways of gene interference are achieved by injection of antisense oligonucleotides (oligos) or mRNA into fertilized eggs, enabling under- or over-expression of specific proteins, respectively. However, these methods normally require more than several hours until protein expression is affected, and, hence, the interference of gene functions is not effective during early embryonic stages. Here, we introduce an experimental system in which expression levels of maternal proteins can be altered before fertilization. Xenopus laevis oocytes obtained from ovaries are defolliculated by incubating with enzymes. Antisense oligos or mRNAs are injected into defolliculated oocytes at the germinal vesicle (GV) stage. These oocytes are in vitro matured to eggs at the metaphase II (MII) stage, followed by intracytoplasmic sperm injection (ICSI). By this way, up to 10% of ICSI embryos can reach the swimming tadpole stage, thus allowing functional tests of specific gene knockdown or overexpression. This approach can be a useful way to study roles of maternally stored factors in early embryonic development.

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

We describe methods of manipulating Xenopus laevis immature oocytes, in vitro maturation of oocytes to eggs, and intracytoplasmic sperm injection. This protocol allows degradation of some maternal proteins and overexpression of genes of interest at fertilization, and hence is valuable to study roles of specific factors in early embryonic development.

操作と<em&gt;インビトロ</emの&gt;成熟<em&gt;アフリカツメガエル</em細胞質内精子注入し&gt;卵母細胞、胚発生を研究するために

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as well as the generation of mature neural cell types for further study. In this protocol we describe a method for the differentiation of ESC to neural progenitors using serum-free, monolayer culture. The method is scalable, efficient and results in production of ~70% neural progenitor cells within 4 - 6 days. It can be applied to ESC from various strains grown under a variety of conditions. Neural progenitors can be allowed to differentiate further into functional neurons and glia or analyzed by microscopy, flow cytometry or molecular techniques. The differentiation process is amenable to time-lapse microscopy and can be combined with the use of reporter lines to monitor the neural specification process. We provide detailed instructions on media preparation and cell density optimization to allow the process to be applied to most ESC lines and a variety of cell culture vessels.

This protocol describes in detail the method for generating neural progenitors from embryonic stem cells using a serum-free monolayer method. These progenitors can be used to derive mature neural cell types or to study the process of neural specification and is amenable to multiwell format scaling for compound screening.

無血清単層培養中のマウス胚性幹細胞の神経分化

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

Generating CRISPR/Cas9 Mediated Monoallelic Deletions to Study Enhancer Function in Mouse Embryonic Stem Cells

Enhancers control cell identity by regulating tissue-specific gene expression in a position and orientation independent manner. These enhancers are often located distally from the regulated gene in intergenic regions or even within the body of another gene. The position independent nature of enhancer activity makes it difficult to match enhancers with the genes they regulate. Deletion of an enhancer region provides direct evidence for enhancer activity and is the gold standard to reveal an enhancer's role in endogenous gene transcription. Conventional homologous recombination based deletion methods have been surpassed by recent advances in genome editing technology which enable rapid and precisely located changes to the genomes of numerous model organisms. CRISPR/Cas9 mediated genome editing can be used to manipulate the genome in many cell types and organisms rapidly and cost effectively, due to the ease with which Cas9 can be targeted to the genome by a guide RNA from a bespoke expression plasmid. Homozygous deletion of essential gene regulatory elements might lead to lethality or alter cellular phenotype whereas monoallelic deletion of transcriptional enhancers allows for the study of cis-regulation of gene expression without this confounding issue. Presented here is a protocol for CRISPR/Cas9 mediated deletion in F1 mouse embryonic stem (ES) cells (Mus musculus129 x Mus castaneus). Monoallelic deletion, screening and expression analysis is facilitated by single nucleotide polymorphisms (SNP) between the two alleles which occur on average every 125 bp in these cells.

Experimental validation of enhancer activity is best approached by loss-of-function analysis. Presented here is an efficient protocol that uses CRISPR/Cas9 mediated deletion to study allele-specific regulation of gene transcription in F1 ES cells which contain a hybrid genome (Mus musculus129 x Mus castaneus).

生成CRISPR / Cas9媒介1アレル欠失マウス胚性幹細胞でエンハンサー機能を研究するために、

Enhancers control cell identity by regulating tissue-specific gene expression in a position and orientation independent manner. These enhancers are often ...

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo development due to their similar developmental process. Although genetic factors are known to affect early embryonic development, the discovery of such factors has been a serious challenge. Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. One of the main decisions that have to be made when planning a microarray experiment is whether to use a one- or two-color approach. Two-color design increases technical replication, minimizes variability, improves sensitivity and accuracy as well as allows having loop designs, defining the common reference samples. Although microarray is a powerful biological tool, there are potential pitfalls that can attenuate its power. Hence, in this technical paper we demonstrate an optimized protocol for RNA extraction, amplification, labeling, hybridization of the labeled amplified RNA to the array, array scanning and data analysis using the two-color analysis strategy.

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcripts on a genome-wide basis. Therefore, this protocol provides an optimized technical procedure in a two-color custom made bovine array using Day 7 bovine embryos to demonstrate the feasibility of using low amount of total RNA.

のトランスクリプトームプロファイリング<em&gt;生体内で</em二色マイクロアレイプラットフォームを使用&gt;産ウシ着床前の胚

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus embryos are large, develop externally, and can be easily manipulated by microinjection or surgical procedures. In addition, fate maps have been established for early Xenopus embryos. Targeted microinjection into the individual blastomere that will eventually give rise to an organ or tissue of interest can be used to selectively overexpress or knock down gene expression within this restricted region, decreasing secondary effects in the rest of the developing embryo. In this protocol, we describe how to utilize established Xenopus fate maps to target the developing Xenopus kidney (the pronephros), through microinjection into specific blastomere of 4- and 8-cell embryos. Injection of lineage tracers allows verification of the specific targeting of the injection. After embryos have developed to stage 38 - 40, whole-mount immunostaining is used to visualize pronephric development, and the contribution by targeted cells to the pronephros can be assessed. The same technique can be adapted to target other tissue types in addition to the pronephros.

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos.

開発にターゲットマイクロインジェクションのテクニック<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;腎臓

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

In Vitro and In Vivo Models to Study Corneal Endothelial-mesenchymal Transition

Corneal endothelial cells (CECs) play a crucial role in maintaining corneal clarity through active pumping. A reduced CEC count may lead to corneal edema and diminished visual acuity. However, human CECs are prone to compromised proliferative potential. Furthermore, stimulation of cell growth is often complicated by gradual endothelial-mesenchymal transition (EnMT). Therefore, understanding the mechanism of EnMT is necessary for facilitating the regeneration of CECs with competent function. In this study, we prepared a primary culture of bovine CECs by peeling the CECs with Descemet's membrane from the corneal button and demonstrated that bovine CECs exhibited the EnMT process, including phenotypic change, nuclear translocation of &#946;-catenin, and EMT regulators snail and slug, in the in vitro culture. Furthermore, we used a rat corneal endothelium cryoinjury model to demonstrate the EnMT process in vivo. Collectively, the in vitro primary culture of bovine CECs and in vivo rat corneal endothelium cryoinjury models offers useful platforms for investigating the mechanism of EnMT.

In Vitro and In Vivo Models to Study Corneal Endothelial-mesenchymal Transition

A primary culture of bovine corneal endothelial cells was used to investigate the mechanism of corneal endothelial-mesenchymal transition. Furthermore, a rat corneal endothelium cryoinjury model was used to demonstrate corneal endothelial-mesenchymal transition in vivo.

in vitroおよびin vivoモデルで角膜内皮間葉転換を研究します

Corneal endothelial cells (CECs) play a crucial role in maintaining corneal clarity through active pumping. A reduced CEC count may lead to corneal edema ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The efficient in vivo visualization of blood vessels and the reliable quantification of their complexity are key to understanding the biology and disease of the vascular network. Here, we provide a detailed method to visualize blood vessels with a commercially available fluorescent dye, human plasma acetylated low density lipoprotein DiI complex (DiI-AcLDL), and to quantify their complexity in Xenopus tropicalis. Blood vessels can be labeled by a simple injection of DiI-AcLDL into the beating heart of an embryo, and blood vessels in the entire embryo can be imaged in live or fixed embryos. Combined with gene perturbation by the targeted microinjection of nucleic acids and/or the bath application of pharmacological reagents, the roles of a gene or of a signaling pathway on vascular development can be investigated within one week without resorting to sophisticated genetically engineered animals. Because of the well-defined venous system of Xenopus and its stereotypic angiogenesis, the sprouting of pre-existing vessels, vessel complexity can be quantified efficiently after perturbation experiments. This relatively simple protocol should serve as an easily accessible tool in diverse fields of cardiovascular research.

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

This protocol demonstrates a fluorescence-based method to visualize the vasculature and to quantify its complexity in Xenopus tropicalis. Blood vessels can be imaged minutes after the injection of a fluorescent dye into the beating heart of an embryo after genetic and/or pharmacological manipulations to study cardiovascular development in vivo.

の胚性血管新生の可視化と定量分析<em&gt;ツメガエル</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

The aorta is the largest artery in the body. The aortic wall is composed of an inner layer of endothelial cells, a middle layer of alternating elastic lamellae and smooth muscle cells (SMCs), and an outer layer of fibroblasts and extracellular matrix. In contrast to the widespread study of pathological models (e.g., atherosclerosis) in the adult aorta, much less is known about the embryonic and perinatal aorta. Here, we focus on SMCs and provide protocols for the analysis of the morphogenesis and pathogenesis of embryonic and perinatal aortic SMCs in normal development and disease. Specifically, the four protocols included are: i) in vivo embryonic fate mapping and clonal analysis; ii) explant embryonic aorta culture; iii) SMC isolation from the perinatal aorta; and iv) subcutaneous osmotic mini-pump placement in pregnant (or non-pregnant) mice. Thus, these approaches facilitate the investigation of the origin(s), fate, and clonal architecture of SMCs in the aorta in vivo. They allow for modulating embryonic aorta morphogenesis in utero by continuous exposure to pharmacological agents. In addition, isolated aortic tissue explants or aortic SMCs can be used to gain insights into the role of specific gene targets during fundamental processes such as muscularization, proliferation, and migration. These hypothesis-generating experiments on isolated SMCs and the explanted aorta can then be assessed in the in vivo context through pharmacological and genetic approaches.

Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

Protocols for studying the embryonic and perinatal murine aorta using in vivo clonal analysis and fate mapping, aortic explants, and isolated smooth muscle cells are detailed here. These diverse approaches facilitate the investigation of the morphogenesis of the embryonic and perinatal aorta in normal development and the pathogenesis in disease.

体内と組織や細胞植アプローチを使用して形態形成と胚および周産期の大動脈の病因を研究するには

The aorta is the largest artery in the body. The aortic wall is composed of an inner layer of endothelial cells, a middle layer of alternating elastic ...