وأيد هذا العمل من قبل جمعية الألمانية للبحوث (KFO 196 &quot;Signaltransduktion باي adaptativen اوند maladaptiven kardialen إعادة تشكيل-Prozessen&quot;، FR 1638 / 1-2) وقبل (مركز DZHK الألماني لأبحاث القلب والأوعية الدموية، وهو جزء من مراكز الألمانية للبحوث الصحية ، وهو BMBF (الوزارة الاتحادية للتعليم والبحوث) المبادرة).

ويبين الخطوات الأساسية لإجراء العزل في الشكل 1 ووصف جميع الخطوات بالتفصيل في البروتوكول التالي: ملاحظة. يتم تنفيذ عزل العضلات الحليمية و التركيب في الجهاز غرفة حمام وحيازة والتحليل في فترة زمنية متتالية والإلزامي. وقد أجريت التجارب على الحيوانات فقط وفقا للتشريع الألماني على حماية الحيوانات وتمت الموافقة من قبل مجلس مراجعة أخلاقيات جامعة هايدلبرغ. 1. إعداد الأجهزة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لانقباض القياسات تستخدم multichambered الإعداد حمام الجهاز. وتظهر عناصر من خارج الحي انقباض الإعداد حمام الجهاز في الشكل 2. ملاحظة: لتقليل مقدار الوقت بين إعداد العضلات الحليمية وبداية من بروتوكول التجريبية، وإعداد المعدات وإعداد مخازن قبل جمع tissue.This تجريبي يقوم بتقديموفاق أكبر قدر من الوقت الذي لا تزال قابلة للحياة الأنسجة لإجراء التجارب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء أجهزة الحاسوب والحصول على البيانات. بدوره على حرارة حمام الجهاز (مسبقا إلى 32 درجة مئوية) والسماح لوحدات إلى درجة الحرارة مسبقا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد اقتناء المعدات. بدء تسجيل البيانات على النحو المذكور في دليل البرامج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فحص وإجراء معايرة (إذا لزم الأمر) على كل قناة والصفر كل القنوات لتوحيد إشارة كهربائية الموردة من محول القوة المعنية (المرتبطة بهذا قناة) لقوة 2-ز المقدمة من وزن شهادة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على امدادات الغاز (95٪ O 2/5٪ CO 2) لغرف حمام الجهاز. الغاز المتواصل لجميع الدوائر خلال قياسات بروتوكول بأكملها. </li></ol> 2. إعداد مخازن والحلول الفسيولوجية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل العازلة كريبس-هنسلايت لتحقيق تركيزات النهائي من 119 ملي كلوريد الصوديوم. 25 ملي NaHCO 3؛ 4.6 ملي بوكل؛ الجلوكوز 11MM؛ 1 ملم نا فyruvate. 1.5 ملي CaCl 2؛ 1.64 ملي MgSO 4؛ 1.18 ملي KH 2 PO 4 وضبط درجة الحموضة إلى 7.4 (انظر الجدول 1 حل الفسيولوجي). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد منفصل حل العازلة كريبس-هنسلايت لاستخدامها أثناء العزلة كما هو موضح في الخطوة 2.1 مع إضافية 30MM 2،3 Butanedione monoxime (بي دي إم) و 50 IE الهيبارين / مل. حل بارد إلى 4 ° C (انظر الحل إعداد الجدول 1). لمحاكاة نقص التروية، وإعداد نقص التروية-الحل كما هو موضح في الجدول 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لبروتوكول كا 2 + - انقباض المعالين، إضافة الكالسيوم 2+ إلى حل العازلة كريبس-هنسلايت لطلب تركيز النهائي. ملاحظة: إعداد هذه الحلول مباشرة قبل استخدامه، وغاس مع كربوجين لتجنب ترسيب Calciumcarbonate. حل Prewarm إلى 32 ° C قبل استخدام. </li></ol> 3. إعداد بالغاز أنبوب وتشريح طبق استخدمت خلال حليمي الختان الداخلي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توصيل الغاز لينةالغناء أنبوب (الخارجية قطرها 2-4 مم) لاتصال الغاز (100٪ أكسجين، كربوجين بدلا من ذلك) مع خبير يعمل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنشاء حلقة مغلقة من الأنبوب بالغاز المناسب داخل طبق تشريح. ثقب الأنبوب بالغاز عدة مرات الذي أكد على السطح المستمر. هذا الأنبوب بالغاز يمكن استخدامها عدة مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد طبق تشريح مع المطاط الصناعي السيليكون في الجزء السفلي (0.5 سم سميكة)، بحيث دبابيس يمكن أن يكون عالقا فيه. هذا الطبق يمكن استخدام عدة مرات. </li></ol> 4. عزل اليسار الأمامي حليمي العضلات من الفئران ملاحظة: قبل البدء في عزل العضلات الحليمية، والتحقق من أن خطوط الغاز واضحة من انسداد. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد بالأعضاء الإعداد حمام على النحو المذكور في قسم البروتوكول 1-3 قبل البدء في إعداد العضلات الحليمية. إعداد جميع الحلول في يوم من التجربة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التضحية الماوس (حوالي 8-12 أسابيع من العمر) من خلال عنق الرحم التفكك accordiنانوغرام للمبادئ التوجيهية المؤسسية الخبراء العامل و. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح الحيوان في موقف الظهرية عن طريق تحديد الأرجل الأمامية وهند الكفوف على لوحة التشريح، وفتح جانبي القفص الصدري على كلا الجانبين من خلال قطع الأضلاع مع مقص العظام الحادة، ثم قص الحجاب الحاجز مع خفض مستعرضة. إزالة التامور. الآن القلب والشريان الأورطي يمكن الوصول إليها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح القلب مع ملقط حادة على الجذع الأوعية الدموية بالقرب من القلب وفصل القلب بسرعة مع مقص من الرئتين والأنسجة المحيطة بها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل القلب النابض لطبق بيتري مملوءة بمحلول إعداد تبريد بالغاز مع الأكسجين (الخطوة 2.2). السماح للالقلب ينبض ويحفز انقباضات القلب بهدوء عن طريق لمس قمة القلب مع ملقط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في أقرب وقت القلب exsanguinous تماما، نقلها إلى الطبق تشريح مملوءة بمحلول إعداد تبريد (الخطوة 2.2) وابيدوا O 2. من هذه الخطوة على استخدام وstereomicroscope. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح هيئة التعليم العاليRT مع دبوس صغير من خلال البطين الأيمن بحيث ينظر إلى القلب من الظهرية (يقع البطين الأيمن على الجانب الأيمن من وجهة نظر المشغل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مقص المجهرية فصل كل من الأذينين على مستوى الأذينية البطينية، وقطع ربط الأنسجة من البطينين وتجاهل. إجراء قطع من خلال الجدار البطيني من على المستوى صمام AV إلى قمة القلب تجنب أي ضغط الميكانيكي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح البطين الأيسر وإصلاح من جانب جدار الحرة مع ملقط، وبالتالي وجود نظرة على كل من اليسار العضلات الحليمية البطين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خفض قليلا بعيدا الجانبية نسيج البطين على كلا الجانبين من العضلات الحليمية الأمامية اليسرى الحفاظ على جزء من الشراع صمامي على إعداد العضلات الحليمية وتجنب لمس أو شد العضلات الحليمية قدر الإمكان. تشريح الأنسجة المتبقية جدار البطين من العضلات الحليمية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نعلق خيوط الحرير (7/0، متري 0.5) على كلا الجانبين من الإعدادية العضلات الحليمية<html> aration، واحدة على الشراع صمامي واحد على جزء العضلي. إصلاح إعداد في غرفة حمام جهاز مملوءة بمحلول حمام الجهاز وابيدوا كربوجين، كما اقترح درجة الحرارة 32 ° C. </li></ol> 5. موازنة وتحفيز العضلات الحليمية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحفيز إعداد العضلات الحليمية مع نبضات مستطيلة (مدة 2 مللي ثانية والحالية من 100 مللي أمبير) في وتيرة التحفيز 1 هرتز مباشرة بعد تثبيت الجهاز في الحمام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضمان التغيير المتكرر للحمام حل الجهاز، إما عن طريق التغيير المستمر أو عن طريق تغيير يدوي متكررة (كل 5 دقائق) وفقا لإعداد من نوع حمام الجهاز المستخدم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> زيادة تدريجية في ادعاء حتى نشل القوة القصوى في التوصل إليها. يتم التوصل إلى القوة القصوى نشل عندما لم يتبع هذه الزيادة من ادعاء من قبل زيادة أخرى في القوة نشل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 45-60 دقيقة من موازنة، بدء بروتوكول تجريبي. </li></ol>&quot;jove_title&quot;&gt; 6. اقترح التجريبية بروتوكولات لانقباض القياسات ملاحظة: بروتوكول تجريبي المبينة أدناه وتشمل المناورات القياسية لتوصيف انقباض القلب في ظل الظروف الفسيولوجية والمرضية في جسم المريض. في قسم التمثيل وصفنا هذه البروتوكولات في التفاصيل تبين أيضا نتائج ممثل (انظر أيضا الجدول 2). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسجيل وتحليل البروتوكولات التجريبية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للتسجيل، واستخدام البرمجيات المناسبة لقرار الزمني الكافي (نسبة الاستحواذ ≥ 1KHZ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل المعلمات بما في ذلك القوة نشل السعة (الارتفاع)، والوقت لذروتها التوتر (TTP) ونصف أقصى وقت الاسترخاء (R 50 / TFall، على التوالي) كما ذكر في البرنامج (كمثال الرسم البياني 5.5 من ADInstruments، انظر الشكل 4). </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Endoh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+Ca2++signaling+and+Ca2++sensitizers.">Cardiac Ca2+ signaling and Ca2+ sensitizers.</a> Circ J. 12 (12), 1915-1925 (2008).</li><li>Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+cycling+and+signaling+in+cardiac+myocytes.">Calcium cycling and signaling in cardiac myocytes.</a> Annu Rev Physiol. 70, 23-49 (2008).</li><li>Bers, D., Despa, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na/K-ATPase&#8212;an+integral+player+in+the+adrenergic+fight-or+flight+response.">Na/K-ATPase&#8212;an integral player in the adrenergic fight-or flight response.</a> Trends Cardiovasc Med. 19, 111-118 (2009).</li><li>Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+excitation&#8211;contraction+coupling.">Cardiac excitation&#8211;contraction coupling.</a> Nature. 415, 198-205 (2002).</li><li>Pieske, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=al.+Ca(2+)-dependent+and+Ca(2+)-independent+regulation+of+contractility+in+isolated+human+myocardium.">al. Ca(2+)-dependent and Ca(2+)-independent regulation of contractility in isolated human myocardium.</a> Basic Res Cardiol. 92, 75-86 (1997).</li><li>Corbin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sildenafilcitrate+does+not+affect+cardiac+contractility+in+human+or+dog+heart.">Sildenafilcitrate does not affect cardiac contractility in human or dog heart.</a> Curr Med ResOpin. 19 (8), 747-752 (2003).</li><li>Romero-Vecchione, E., Vasquez, J., Rosa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+negative+inotropic+effect+of+cocaine+in+rat+ventricle+strip.">Direct negative inotropic effect of cocaine in rat ventricle strip.</a> Acta Cient Venez. 47 (1), 17-23 (1996).</li><li>N&#228;bauer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+inotropic+effects+in+isolated+ventricular+myocardium+from+nonfailing+and+terminally+failing+human+hearts.">Positive inotropic effects in isolated ventricular myocardium from nonfailing and terminally failing human hearts.</a> Eur J Clin Invest. 18 (6), 600-606 (1988).</li><li>Gao, W. D., Perez, N. G., Marban, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+cycling+and+contractile+activation+in+intact+mouse+cardiac+muscle.">Calcium cycling and contractile activation in intact mouse cardiac muscle.</a> J Physiol. 507, 175-184 (1998).</li><li>Bluhm, W. F., Kranias, E. G., Dillmann, W. H., Meyer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholamban:+a+major+determinant+of+the+cardiac+force-frequency+relationship.">Phospholamban: a major determinant of the cardiac force-frequency relationship.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 278 (1), H249-H255 (2000).</li><li>Redel, A., Baumgartner, W., Golenhofen, K., Drenckhahn, D., Golenhofen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+activity+and+force-frequency+relationship+of+isolated+mouse+papillary+muscle:+effects+of+extracellular+calcium+concentration,+temperature+and+contraction+type.">Mechanical activity and force-frequency relationship of isolated mouse papillary muscle: effects of extracellular calcium concentration, temperature and contraction type.</a> Pflugers Arch. 445 (2), 297-304 (2002).</li><li>Uhl, S., Mathar, I., Vennekens, R., Freichel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenylyl+cyclase-mediated+effects+contribute+to+increased+Isoprenaline-induced+cardiac+contractility+in+TRPM4+deficient+mice.">Adenylyl cyclase-mediated effects contribute to increased Isoprenaline-induced cardiac contractility in TRPM4 deficient mice.</a> JMCC. 74, 307-317 (2014).</li><li>Allen, D. G., Jewell, B. R., Wood, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+the+contractility+of+mammalian+myocardium+at+low+rates+of+stimulation.">Studies of the contractility of mammalian myocardium at low rates of stimulation.</a> J Physiol. 254 (1), 1-17 (1976).</li><li>Pieske, B., Maier, L. S., Schmidt-Schweda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sarcoplasmic+reticulum+Ca2++load+in+human+heart+failure.">Sarcoplasmic reticulum Ca2+ load in human heart failure.</a> Basic Res Cardiol. 97, 163-171 (2002).</li><li>Koch-Weser, J., Blinks, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Influence+of+the+Interval+between+Beats+on+Myocardial+Contractility.">The Influence of the Interval between Beats on Myocardial Contractility.</a> Pharmacol Rev. 15, 601-652 (1963).</li><li>Bocalini, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+remodeling+after+large+infarcts+in+rat+converts+post+rest-potentiation+in+force+decay.">Myocardial remodeling after large infarcts in rat converts post rest-potentiation in force decay.</a> Arq Bras Cardiol. 98 (3), 243-251 (2012).</li><li>Juggi, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+ischemia-reperfusion+on+the+post-rest+inotropy+of+isolated+perfused+rat+heart.">Effect of ischemia-reperfusion on the post-rest inotropy of isolated perfused rat heart.</a> J Cell Mol Med. 6 (4), 621-630 (2002).</li><li>Lakatta, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+Bowditch:+the+convergence+of+cardiac+chronotropy+and+inotropy.">Beyond Bowditch: the convergence of cardiac chronotropy and inotropy.</a> Cell Calcium. 35 (6), 629-624 (2004).</li><li>Taylor, D. G., Parilak, L. D., LeWinter, M. M., Knot, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+the+rat+left+ventricle+force+and+Ca2++-frequency+relationships:+similarities+to+dog+and+human.">Quantification of the rat left ventricle force and Ca2+ -frequency relationships: similarities to dog and human.</a> Cardiovasc Res. 61 (1), 77-86 (2004).</li><li>Schmidt, U., Hajjar, R. J., Gwathmey, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+force-interval+relationship+in+human+myocardium.">The force-interval relationship in human myocardium.</a> J Card Fail. 1 (4), 311-321 (1995).</li><li>Rossman, E. I., Petre, R. E., Chaudhary, K. W., Piacentino, V. 3. r. d., Janssen, P. M., Gaughan, J. P., Houser, S. R., Margulies, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+frequency-dependentresponses+represent+the+pathophysiologic+signature+of+contractile+failure+inhuman+myocardium.">Abnormal frequency-dependentresponses represent the pathophysiologic signature of contractile failure inhuman myocardium.</a> JMCC. 36 (1), 33-42 (2004).</li><li>Moran, A. E., Forouzanfar, M. H., Roth, G. A., Mensah, G. A., Ezzati, M., Murray, C. J., Naghavi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+trends+in+ischemic+heart+disease+mortality+in+21+world+regions,+1980+to+2010:+the+Global+Burden+of+Disease+2010+stud.">Temporal trends in ischemic heart disease mortality in 21 world regions, 1980 to 2010: the Global Burden of Disease 2010 stud.</a> Circulation. 129 (14), 1483-1492 (1980).</li><li>Lee, J. A., Allen, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+intracellular+free+calcium+concentration+during+long+exposures+to+simulated+ischemia+in+isolated+mammalian+ventricular+muscle.">Changes in intracellular free calcium concentration during long exposures to simulated ischemia in isolated mammalian ventricular muscle.</a> Circ Res. 71 (1), 58-69 (1992).</li></ol>

تعلن الكتاب أنه ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة.

في هذه المخطوطة وصفنا أسلوبا للتحقيق في انقباض العضلات الحليمية الفئران في المختبر والتي يمكن استخدامها للإجابة على عدة أسئلة علمية تتعلق فسيولوجيا القلب وأمراض في الفئران وكذلك لدعم تحليل خطوط المعدلة وراثيا واكتشاف نهج الأدوية الجديدة لعلاج الخلل في القلب. نحن لتوضيح استخدام هذا الأسلوب لتقييم الخصائص الفسيولوجية، المرضية والدوائية من انقباض عضلة القلب (انظر الشكل 3). تطبيقات إضافية لم يتضح هنا تشمل تقييم مسارات الخلايا باستخدام وكلاء الدوائية المختلفة (انظر أيضا 12). أمراض القلب مثل أمراض نقص تروية القلب وفشل القلب عرض مشكلة السريرية البارزة وتظل السبب الرئيسي للوفيات والمراضة في جميع أنحاء العالم 22. بالنسبة لكثير من البروتينات التي أعرب عنها في القلب، ودورها لانقباض القلب هو لا يزال خارجل مفهومة أو لم تدرس حتى الآن. يوضح قياس انقباض في العضلات الحليمية معزولة نهجا مفيدا وصالحا لدراسة انقباض القلب في المختبر في نماذج الماوس. على الرغم من أن هذه الطريقة مجدية تقنيا ويظهر استنساخ جيدة، وهناك العديد من الخطوات الهامة اللازمة لضمان نجاحها: أولا، بعد عزل القلب، وضمان حل الحرة الدم أثناء إجراء اعدادها لتكون قادرة على العمل بشكل صحيح (التصور). خطوة حاسمة أخرى هي أن إعداد الأنسجة يتم تنفيذ بعناية لضمان الجدوى من خلال تجنب أي لمس أو شد العضلات الحليمية. كما هو موضح في القسم طريقة محاولة للحفاظ على الشراع صمامي متصلا العضلات الحليمية لضمان مرفق خالية من المتاعب من خيط الحرير. بعد تثبيت للإعداد في غرفة حمام الجهاز، قم بتغيير حل حمام الجهاز عدة مرات خلال الدقائق الأولى لطرد BDM. Increaسه ادعاء من إعداد قليلا وتدريجيا حتى يحدث لا مزيد من زيادة القوة نشل. هناك بعض المعايير الاستبعاد لتقييم البروتوكولات واحدة مثل عدم اتساق نبضات القلب يدق وزيادة تلقائية للادعاء كعلامة للظروف الدماغية. العديد من البروتوكولات التجريبية مثل التقوية postrest وعلاقة قوة التردد لا يمكن أن يؤديها مع عينة إعداد نفسها، في حين ينبغي أن تستخدم عينة إعداد جديدة لتحليل الآثار بوساطة المخدرات على انقباض. هو الأمثل لإعداد بروتوكول لعزل العضلات الحليمية الأمامية اليسرى. تكييف البروتوكول، وكذلك العضلات الخلفية ويمكن استخدام هذه الطريقة في قياس انقباض. هذه الطريقة في قياس العضلات الحليمية معزولة يوفر معلومات متنوعة حول الكالسيوم، و للحرارة التي تعتمد على تردد انقباض فضلا عن استجابة مقلص بعد تطبيق كلاء الدوائية أو سيمulation من الحالات المرضية. ومع ذلك، فإن تفسير واستقراء هذه النتائج يجب أن يتم التعامل معها بحذر العلمية. الطريقة الموضحة هو نموذج في المختبر من عضلة القلب، قطع من بيئتها الطبيعية وتعصيب العصبي. ولذلك، فإن الظروف التجريبية ليست الفسيولوجية والنتائج الواردة في هذا البروتوكول لا يمكن نقلها دون تفسير معمق للوضع في الجسم الحي. على سبيل المثال، الطريقة لا تأخذ في الاعتبار التغيرات في ضغط الدم والهرمونات أو التحكم العصبي خارجي. إمدادات الأوكسجين والأيض المكملات الغذائية لإعداد في الحمام الجهاز محدودة بسبب نشرها. ومن شأن إمدادات غير كافية من الأوكسجين والأيض المكملات الغذائية يؤدي إلى ظروف نقص تروية والنتائج التجريبية غير صالحة في وقت لاحق. لتجنب ذلك، يجب أن تكون الشروط التجريبية الأمثل، خاصة فيما يتعلق الأوكسجين، وتركيز الكالسيوم ودرجة الحرارة من الحل حمام الجهاز.مع الظروف التجريبية للبروتوكول وصفها هنا، يمكن أن تتاح نتائج صحيحة. في هذه المخطوطة يوصف طريقة لمحاكاة الظروف مثل نقص التروية. بالإضافة إلى ذلك لمحاكاة نقص الأكسجة، تم استنفاد جميع الملاحق حيوية من الحل حمام جهاز لمحاكاة الدولة الدماغية في الجسم الحي جيدة قدر الإمكان. وعلى النقيض من نقص الأكسجين، وتبين أن استنزاف وقت واحد من الأكسجين وإمدادات الطاقة يؤدي إلى تغيرات في العابرين الكالسيوم تضاهي التعديلات ينظر في الجسم الحي 23. الإجراء الموضح لعزل الماوس العضلات الحليمية يمكن تكييفها مع الأنواع الأخرى، على سبيل المثال، الفئران. لكن الظروف المثلى للجهاز الإعداد الحمام يمكن أن تختلف بين نماذج حيوانية مختلفة ويمكن تكييفها. المعلمات التي قد تحتاج إلى التكيف هي درجة الحرارة وتركيز الكالسيوم من الحل الفسيولوجية. في summarذ، يوفر هذا الأسلوب انقباض طريقة فعالة جدا لتقييم فسيولوجيا القلب والفيزيولوجيا المرضية والصيدلة. عندما تستخدم بشكل صحيح، لأنها توفر القدرة على دراسة انقباض القلب في بيئة معزولة ولكن تسيطر عليها بشكل جيد.

التحقيق في البروتينات مثل القنوات الأيونية في اشارة دورها لانقباض القلب ضروري لاكتشاف pathomechanisms المختلفة ووضع استراتيجيات علاجية جديدة لعلاج أمراض القلب مثل نقص التروية وفشل القلب. ومن المعروف ظيفة مقلص العضلية الثدييات إلى أن منظم من قبل القنوات الأيونية مختلفة، النقل وغيرها من البروتينات. إمكانات العمل أثار تفعيل الجهد تعتمد sarcolemmal L من نوع كا 2+ قنوات الكالسيوم يؤدي إلى تدفق 2+ من الفضاء خارج الخلية، وبعد ذلك الى كا كا 2+ يسببها 2+ إطلاق سراح (CICR) 1، والذي يؤدي الانكماش الخلوية 2. كاليفورنيا 2+ -signaling يلعب دورا مركزيا في انقباض القلب والتكيف مع الإجهاد الفسيولوجية أو المرضية. الكاتيكولامينات تنشيط مستقبلات β الأدرينالية القلب، وبالتالي تحفيز محلقة أدينيليل (AC) الذي يجمع المخيم. يجري تفعيلها، من البروتينن كينيز (PKA) phosphorylates مختلفة داخل وغشاء البروتينات المرتبطة مثل L-نوع كا 2+ القنوات، فسفولامبان وryanodine المستقبلات مما يؤدي إلى تعديل من الكالسيوم 2+ العابرين والقلب انقباض 1،3،4. تتحلل المخيم فسفودايستراز (PDE). تنشيط مستقبلات غس إلى جانب غيرها من β-adrenoceptors يؤدي أيضا إلى تراكم المخيم. يتم تأسيس تقنية القياسات انقباض في عضلة البطين معزولة شرائط جيدا لأنواع الثدييات الكبيرة 5-8. استنادا إلى إمكانية استهداف الجينات في الفئران فمن المهم وضع طرق لتحليل علم وظائف الأعضاء قلبية الفئران. ومع ذلك فإن البيانات المتوفرة حول الخصائص الفسيولوجية للالاستعدادات العضلات المعزولة في الفئران تختلف باختلاف ظروف تجريبية 12/09. يستخدم الأسلوب هو موضح لتحليل انقباض القلب من اليسار قبل العضلات الحليمية البطينparations في المختبر. يتم إجراء التحقيق في انقباض القلب في غياب تأثيرات تعديل انقباض القلب في الجسم الحي، مثل ضغط الدم، وتحفيز عصبي هرموني والاجهاد البدني أو التمثيل الغذائي. معدل الضرب من إعداد العضلات التعاقد يمكن تعريفه بدقة وتغيرت بشكل تعسفي. ويمكن تحليل نشل القوة في سياق مؤثرات معينة مثل تركيز الكالسيوم، والضرب التردد أو درجة الحرارة. وبالإضافة إلى ذلك، وهذه الطريقة يمكن استخدامها لتحقيق مختلف مكونات مسار الإشارات ومقارنة أداء القلب من نماذج الماوس المعدلة وراثيا عن طريق التحكم في ظروف تجريبية المذكورة أعلاه.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9434&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5280&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">223506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">230391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P 5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,3-Butanedione monoxime</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3917</td>
			<td>Hazard statement H312, solve in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-?Isobutyl-?1-?methylxanthine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5879</td>
			<td>Hazard statement H 302, solve in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoprenaline hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5627</td>
			<td>Hazard statement H 315-H319-H335</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Heparine 250.000 IE/10ml</td>
			<td>ratiopharm</td>
			<td>PZN 3874685</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histamine dihydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7250</td>
			<td>Hazard statement H 315-H 317-H319- H334-H335</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

contractility measurements on isolated papillary muscles for the investigation of cardiac inotropy in mice

العضلات الحليمية المعزولة من قلوب الماوس الكبار يمكن استخدامها لدراسة انقباض القلب خلال مختلف الفسيولوجية / الحالات المرضية. يمكن تقييم الخصائص مقلص بمعزل عن التأثيرات الخارجية مثل الأوعية الدموية توترية أو وضع عصبي هرموني. وهو يصور منهج علمي بين القياسات خلية واحدة مع myocytes القلب المعزولة والدراسات المجراة مثل ضربات القلب. وبالتالي، فإن الاستعدادات العضلات الحليمية بمثابة نموذجا ممتازا لدراسة علم وظائف الأعضاء قلبية / الفيزيولوجيا المرضية، ويمكن استخدامها لإجراء تحقيقات مثل تعديل من قبل وكلاء الدوائية أو استكشاف النماذج الحيوانية المعدلة وراثيا. هنا، نحن تصف طريقة لعزل العضلات الحليمية الأمامي الأيسر الفئران للتحقيق انقباض القلب في الإعداد حمام الجهاز. على النقيض من إعداد الشريط العضلات المعزولة من الجدار البطيني، والعضلات الحليمية يمكن إعداد جملة وتفصيلا دون الإضرار TISSU العضلاتالبريد بشدة. يتكون الإعداد حمام الجهاز العديد من التجهيز الكهربائي غرف حمام الجهاز، بالغاز والتحكم في درجة حرارته. يتم إصلاح العضلات الحليمية معزولة في غرفة حمام جهاز وحفز كهربائيا. يتم تسجيل قوة نشل أثار باستخدام محول الضغط والمعلمات مثل نشل القوة السعة ونشل ويتم تحليل حركية. بروتوكولات تجريبية مختلفة يمكن القيام بها لتحقيق بالكالسيوم وانقباض تعتمد على التردد فضلا عن منحنيات الاستجابة للجرعة وكلاء مقلص مثل الكاتيكولامينات أو غيرها من المستحضرات الصيدلانية. بالإضافة إلى ذلك، يمكن محاكاة ظروف مرضية مثل نقص التروية الحاد.

يتم ضبطها بروتوكول لهذه المخطوطة لقياس انقباض معزولة الفئران الاستعدادات العضلات الحليمية إلى الظروف المثلى لتحقيق النتائج التجريبية استنساخه في ظل الظروف الفسيولوجية. لتحديد الظروف التجريبية المثلى أجرينا التجارب الرائدة متفاوتة درجة حرارة حمام الجهاز وتركيز الكالسيوم خارج الخلية (انظر أيضا 12). تم تنفيذ بروتوكول الموصوفة هنا مع تركيز الكالسيوم خارج الخلية من 1.5 مم ودرجة حرارة 32 ° C. خصائص انقباض القاعدية لتوصيف خصائص انقباض القاعدية، المعلمات لقوة نشل السعة، ومعدل نشل، والوقت ليصل إلى ذروته (كما هو موضح الوقت اللازم للوصول إلى قوة انقباض القصوى بدءا من القاعدية 5٪) والاسترخاء 50 مرة (نصف أقصى وقت الاسترخاء؛ الذي يعرف بأنه الزمن اللازم ل وصول إلى نصف القوة الاسترخاء) وتستخدم في هذا البروتوكول. تتبع التمثيلي TWالحكة ويتضح من تحليل هذه المعلمات في الشكل 3A-B. تعتمد على الكالسيوم انقباض تركيز الكالسيوم خارج الخلية يحدد بشكل حاسم القلب الإثارة، تقلص اقتران ومتفاوتة هذه المعلمة، وحساسية الكالسيوم من تقلص في جهاز العضلية يمكن تقييمها. كما هو مبين في الشكل 3C زيادة موارد النتائج تركيز الكالسيوم خارج الخلية في العابرين الكالسيوم غيرت وبعد ذلك في توليد قوة نشل تغير. والكالسيوم تركيز المحلول خارج الخلية يزداد خطوة بخطوة (أي بين 1.5 إلى 7MM). من خلال تطبيق هذا البروتوكول، والكالسيوم فيما يتعلق انقباض تعتمد على الكالسيوم من جهاز مقلص يمكن تقييمها. في الإعداد حمام الجهاز المستخدمة في هذه المخطوطة، تم إجراء تغيير في تركيز الكالسيوم خارج الخلية عن طريق تغيير solut حمام الجهازأيون الرائدة يدويا إلى انقطاع قصير من سرعة وبعد ذلك إلى postrest التقوية الاصطناعية (انظر التقوية قوة بعد فترة غير سرعة). التقوية التنفيذ بعد فترة غير سرعة (PRP) في نهاية الكالسيوم دورة الانكماش المحتبسة في sarcoplasmatic الشبكة (SR) في الغالب عن طريق مضخة الكالسيوم التي تعتمد على ATP (SERCA،-ساركو الباطنة شبكية الكالسيوم أتباز)، وبالتالي خفض تركيز الكالسيوم عصاري خلوي أثناء انبساط. إذا تم توسيع الفاصل الزمني بين التقلصات، ويمكن ضخ مزيد من الكالسيوم مرة أخرى في SR ويمكن أن تنطلق في وقت لاحق مزيد من الكالسيوم أثناء الإثارة القادمة. بروتوكول postrest-التقوية (PRP) يصف التعديلات من السعة قوة نشل بعد التحفيز السابق مع فترة راحة لمدة محددة. في الإنسان، الفئران وكذلك في الأنسجة القلبية الفئران، تبين لزيادة القوة نشل 10،12-14،16 ( <stroنانوغرام&gt; الشكل 3D). ومن المعروف أن الإيجابية والتقوية آخر الباقي هو الانتقاص منها أو حتى سلبية في عدم أنسجة القلب من 13،14،16،17 الإنسان والفئران. يستخدم هذا البروتوكول لتقييم وظيفة تراكم الكالسيوم الانبساطي في مخازن داخل الخلايا 4،15. التي تعتمد على تردد انقباض جنباتها يصف علاقة قوة التردد العلاقة بين الضرب معدل وقوة نشل مقلص (بوديتش المفعول) 18. العلاقة تردد force- يختلف بشكل كبير بين أنواع الثدييات والظروف التجريبية 19. في الفئران، تبين وجود علاقة محددة بين معدل الضرب وقوة الانكماش. في 32 ° C، وقد أظهرت لFFR السلبي الأولي بين معدلات التحفيز من 0،1-1 هرتز، في حين تم عرض FFR أن تكون إيجابية في حدود 1-4 هرتز من التحفيز 9-12 (الشكل 3E). في عدم myocardium وجود علاقة عكسية بين معدل الضرب ويوصف انقباض 20،21. في هذه المخطوطة، يتم تقليل معيار سرعة التردد (1 هرتز) إلى 0.1 هرتز والبدء من هناك، ورفعت سرعة التردد تدريجيا إلى 5 هرتز (0.2، 0.5، 1، 2، 3، 4، 5 هرتز). التحفيز الأدرينالية بيتا الكاتيكولامينات مثل الأدرينالين والنورادرينالين هي الهرمونات التي تم إصدارها خلال (patho-) ظروف الإجهاد الفسيولوجية تحوير قوة مقلص عضلة القلب عن طريق تفعيل β-adrenoceptors. تطبيق علاجي المنشأ الكاتيكولامينات يلعب دورا بارزا في العلاج السريري للمرضى الذين يعانون من قصور القلب الحاد لتعزيز inotropy القلب مؤقتا. ويمكن أيضا أن ينظر إلى هذا التأثير والتحقيق في الدراسات في المختبر. كما ناهض من β-adrenoceptors، إيزوبرينالين يزيد قوة نشل مقلص. في الجسم الحي، وزيادة في الضرب تردد يحدث أيضا (تأثير إيجابي مؤثر في التقلص العضلي)، والتيبالإضافة إلى ذلك ينظم استجابة مقلص (بوديتش تأثير، انظر أيضا وصف بروتوكول جنباتها أعلاه). باستخدام الطريقة الموصوفة هنا، وتأثير مؤثر في التقلص العضلي من إيزوبرينالين يمكن التحقيق بمعدل الضرب الثابتة دون أن تأثير ميقاتية (الشكل 3F). ويمكن أيضا أن يتحقق تحفيز β-adrenoceptors بواسطة هرمونات أخرى مثل الهستامين. في أنسجة البطين الفئران، وتطبيق نتائج الهستامين في استجابة ثنائية الطور الذي يحتوي على تأثير إيجابي مؤثر في التقلص العضلي الأولي، ولكن مع انخفاض عابر في القوة نشل كما هو مبين في الشكل الجيل الثالث 3G. لهذا السبب يبدو تفسير البيانات المقاسة من خلال تطبيق الهستامين أن يكون أمرا صعبا؛ خصوصا الأساسي مستقبلات التنشيط في الفئران لم تحل تماما. شروط الدماغية ويعرف نقص التروية القلبية الحاد الحصر حاسم من تدفق الدم مما يؤدي إلى قلة المعروض من أنسجة القلب مع الأكسجين والمواد الغذائية مما يؤدي إلى فقدان انقباض، وتطوير انكماش الدماغية وموت الخلايا. لمحاكاة نقص التروية في المختبر، تتعرض العضلات لمدة 30 دقيقة إلى الجلوكوز، وخالية من البيروفات حل خارج الخلية انفجر مع 95٪ N 05/02٪ CO 2. مع هذا النهج يجب أن يتسبب في نضوب ATP في العضلية. في غضون دقائق قليلة بعد بدء نقص التروية، والمحاكاة، وانخفاض القوة نشل يحدث مع مظهر انكماش الدماغية تصويرها على شكل زيادة تلقائية في التوتر التحميل المسبق (الشكل 3H). <img alt="الجدول 1" src="/files/ftp_upload/53076/53076table1.jpg" /> الجدول 1: مكونات وتركيزات المحاليل المستخدمة. <img alt="الجدول 2" src="/files/ftp_upload/53076/53076table2.jpg"<html> /&gt; الجدول 2: قائمة البروتوكولات التجريبية المقترحة لتحقيق انقباض القلب في معزولة الاستعدادات العضلات الحليمية. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/53076/53076fig1.jpg" /> الشكل 1. الخطوات الرئيسية لإعداد العضلات الحليمية. (A) تشريح كل من الأذينين. (B) عرض على العضلات الحليمية الأمامية البطين الأيسر. (C) تشريح العضلات الحليمية من جدار البطين. (D) مرفق اثنين من خيوط الحرير قبل التثبيت في غرفة حمام الجهاز. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53076/53076fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <html> 6fig2.jpg &quot;/&gt; الشكل 2. الإعداد حمام الجهاز. (A) إعداد تخطيطي لإعداد حمام الجهاز. سترة المياه غرف حمام الجهاز مجهزة فريتس الزجاج تهوية توفر التحكم في درجة الحرارة مستقرة. لتوليد نبضات مربع الموجة هي التي تعلق الأقطاب ميدانية لدعم الأنسجة. A محول القوة الحواس تقلص العضلات وبالتالي تضخيم إشارة ولدت. يتم تصفية هذه الإشارات ونقلها إلى جهاز الكمبيوتر عن طريق محول A / D. والإشارة ثم الرقمية، ويمكن حفظها للتحليلات لاحقة. (B) صورة لإعداد العضلات الحليمية واحد ثابت في غرفة حمام الجهاز من الإعداد حمام الجهاز (C). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53076/53076fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <html> خريج &quot;/&gt; الشكل 3. ممثل النتائج من القياسات انقباض العضلات الحليمية الأمامي الأيسر الفئران. (A) تحليل الممثل للقوة نشل السعة، وقت الذروة في التوتر (TTP) ونصف أقصى وقت الاسترخاء (R 50) من نشل واحد. التسجيلات التمثيلية للتشنجات حفز من الفئران الاستعدادات العضلات الحليمية في إطار التحفيز القاعدية مع معدل الضرب من 1 هرتز (B)، خلال زيادة تركيزات الكالسيوم خارج الخلية (C)، خلال فترات محددة الراحة (التقوية آخر الراحة، PRP) (D)، أو مختلفة معدلات التحفيز (علاقة قوة التردد، FFR) (E) وبعد تطبيق زيادة تركيزات Isoprenaline- (F) أو الهستامين التطبيق (G). تسجيل التمثيلي للتشنجات حفز والتحميل المسبق خلال نقص التروية التحفيز (H).الصورة: //www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53076/53076fig3large.jpg &quot;الهدف =&quot; _ فارغة &quot;&gt; الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. <img alt="الرقم 4" src="/files/ftp_upload/53076/53076fig4.jpg" /> الشكل 4. تحليل المعلمات مقلص. لتوصيف وظيفة مقلص، ويتم تحليل المعلمات بما في ذلك القوة نشل السعة (الارتفاع)، والوقت لذروتها التوتر (TTP) ونصف القصوى الوقت الاسترخاء (R 50 / TFall، على التوالي) في هذا البروتوكول باستخدام برنامج مخطط البرنامج 5.5 (ADInstruments). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53076/53076fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Contractility Measurements on Isolated Papillary Muscles for the Investigation of Cardiac Inotropy in Mice at JoVE.com

Contractility Measurements on Isolated Papillary Muscles for the Investigation of Cardiac Inotropy in Mice

ترك الفئران العضلات الحليمية البطين يمكن استخدامها لتحقيق انقباض القلب في المختبر. توضح هذه المقالة بالتفصيل العزلة والبروتوكولات التجريبية لدراسة خصائص مقلص القلب.

انقباض القياسات على العضلات الحليمية معزولة للتحقيق في القلب Inotropy في الفئران

Papillary muscle isolated from adult mouse hearts can be used to study cardiac contractility during different physiological/pathological conditions. The ...

contractility-measurements-on-isolated-papillary-muscles-for

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

14.9K Views.  Universität Heidelberg.  ترك الفئران العضلات الحليمية البطين يمكن استخدامها لتحقيق انقباض القلب في المختبر. توضح هذه المقالة بالتفصيل العزلة والبروتوكولات التجريبية لدراسة خصائص مقلص القلب. 

Video: Contractility Measurements on Isolated Papillary Muscles for the Investigation of Cardiac Inotropy in Mice

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

أعربت المشبك التصحيح وتقنيات الإرواء لدراسة في قنوات ايون القيطم البويضات

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Bioengineering Human Microvascular Networks in Immunodeficient Mice

The future of tissue engineering and cell-based therapies for tissue regeneration will likely rely on our ability to generate functional vascular networks in vivo. In this regard, the search for experimental models to build blood vessel networks in vivo is of utmost importance 1. The feasibility of bioengineering microvascular networks in vivo was first shown using human tissue-derived mature endothelial cells (ECs) 2-4; however, such autologous endothelial cells present problems for wide clinical use, because they are difficult to obtain in sufficient quantities and require harvesting from existing vasculature. These limitations have instigated the search for other sources of ECs. The identification of endothelial colony-forming cells (ECFCs) in blood presented an opportunity to non-invasively obtain ECs 5-7. We and other authors have shown that adult and cord blood-derived ECFCs have the capacity to form functional vascular networks in vivo 7-11. Importantly, these studies have also shown that to obtain stable and durable vascular networks, ECFCs require co-implantation with perivascular cells. The assay we describe here illustrates this concept: we show how human cord blood-derived ECFCs can be combined with bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) as a single cell suspension in a collagen/fibronectin/fibrinogen gel to form a functional human vascular network within 7 days after implantation into an immunodeficient mouse. The presence of human ECFC-lined lumens containing host erythrocytes can be seen throughout the implants indicating not only the formation (de novo) of a vascular network, but also the development of functional anastomoses with the host circulatory system. This murine model of bioengineered human vascular network is ideally suited for studies on the cellular and molecular mechanisms of human vascular network formation and for the development of strategies to vascularize engineered tissues.

Here, we describe a methodology to deliver human cord blood-derived endothelial colony-forming cells (ECFCs) and bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs), embedded in a collagen/fibronectin gel, subcutaneously into immunodeficient mice. This cell/gel combination generates a human vascular network that connects with the mouse vasculature.

الهندسة الحيوية شبكات الاوعية الدموية الدقيقة الإنسان في الفئران العوز المناعي

The future of tissue engineering and cell-based therapies for tissue regeneration will likely rely on our ability to generate functional vascular networks ...

The ex vivo Isolated Skeletal Microvessel Preparation for Investigation of Vascular Reactivity

The isolated microvessel preparation is an ex vivo preparation that allows for examination of the different contributions of factors that control vessel diameter, and thus, perfusion resistance1-5. This is a classic experimental preparation that was, in large measure, initially described by Uchida et al.15 several decades ago. This initial description provided the basis for the techniques that was extensively modified and enhanced, primarily in the laboratory of Dr. Brian Duling at the University of Virginia6-8, and we present a current approach in the following pages. This preparation will specifically refer to the gracilis arteriole in a rat as the microvessel of choice, but the basic preparation can readily be applied to vessels isolated from nearly any other tissue or organ across species9-13. Mechanical (i.e., dimensional) changes in the isolated microvessels can easily be evaluated in response to a broad array of physiological (e.g., hypoxia, intravascular pressure, or shear) or pharmacological challenges, and can provide insight into mechanistic elements comprising integrated responses in an intact, although ex vivo, tissue. The significance of this method is that it allows for facile manipulation of the influences on the integrated regulation of microvessel diameter, while also allowing for the control of many of the contributions from other sources, including intravascular pressure (myogenic), autonomic innervation, hemodynamic (e.g., shear stress), endothelial dependent or independent stimuli, hormonal, and parenchymal influences, to provide a partial list. Under appropriate experimental conditions and with appropriate goals, this can serve as an advantage over in vivo or in situ tissue/organ preparations, which do not readily allow for the facile control of broader systemic variables. 
The major limitation of this preparation is essentially the consequence of its strengths. By definition, the behavior of these vessels is being studied under conditions where many of the most significant contributors to the regulation of vascular resistance have been removed, including neural, humoral, metabolic, etc. As such, the investigator is cautioned to avoid over-interpretation and extrapolation of the data that are collected utilizing this preparation. The other significant area of concern with regard to this preparation is that it can be very easy to damage cellular components such as the endothelial lining or the vascular smooth muscle, such that variable source of error can be introduced. It is strongly recommended that the individual investigator utilize appropriate measurements to ensure the quality of the preparation, both at the initiation of the experiment and periodically throughout the course of a protocol.

The ex vivo Isolated Skeletal Microvessel Preparation for Investigation of Vascular Reactivity

An ex vivo preparation is described for isolation of the largest gracilis muscle resistance arterioles for interrogation of both vascular responses to vasoactive stimuli and the assessment of basic structural properties via passive wall mechanics.

و خارج الحي متفرقة التحضير Microvessel الهيكل العظمي للتحقيق في التفاعل الأوعية الدموية

The isolated  microvessel preparation is an ex vivo preparation that allows for examination of the different contributions of  factors that control vessel ...

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, fatigability, and recovery after fatigue can be obtained to assess specific aspects of the excitation-contraction coupling (ECC) process such as excitability, contractile machinery and Ca2+ handling ability. This method removes the nerve and blood supply and focuses on the isolated skeletal muscle itself. We routinely use this method to identify genetic components that alter the contractile property of skeletal muscle though modulating Ca2+ signaling pathways. Here, we describe a newly identified skeletal muscle phenotype, i.e., mechanic alternans, as an example of the various and rich information that can be obtained using the in vitro muscle contractility assay. Combination of this assay with single cell assays, genetic approaches and biochemistry assays can provide important insights into the mechanisms of ECC in skeletal muscle.

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

We describe a method to directly measure muscle force, muscle power, contractile kinetics and fatigability of isolated skeletal muscles in an in vitro system using field stimulation. Valuable information on Ca2+ handling properties and contractile machinery of the muscle can be obtained using different stimulating protocols.

فيفو السابقين تقييم من تعب، وانقباض في عضلات الهيكل العظمي تناوب متفرقة

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Intravital Microscopy of the Microcirculation in the Mouse Cremaster Muscle for the Analysis of Peripheral Stem Cell Migration

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to nonmarrow tissue have not been completely clarified. We describe here the technique of intravital microscopy applied to the mouse cremaster microcirculation for analysis of peripheral bone marrow stem cell migration in vivo. Intravital microscopy of the M. cremaster has been previously introduced in the field of inflammatory research for direct observation of leucocyte interaction with the vascular endothelium. Since sufficient peripheral stem and progenitor cell migration includes similar initial steps of rolling along and firm adhesion at the endothelial lining it is conceivable to apply the M. cremaster model for the observation and quantification of the interaction of intravasculary administered stem cells with the endothelium. As various chemical components can be selectively applied to the target tissue by simple superfusion techniques, it is possible to establish essential microenvironmental preconditions, for initial stem cell recruitment to take place in a living organism outside the bone marrow.

Intravital microscopy of the mouse M. cremaster microcirculation offers a unique and well-standardized in vivo model for the analysis of peripheral bone marrow stem cell migration.

حيوي داخلي المجهري للدوران الأوعية الدقيقة في العضلات المشمرة ماوس لتحليل الهجرة الجذعية الطرفية المحمولة

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to ...

The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a prerequisite for studying the physiology of the isolated organ and for many innovative applications that may be possible in the future, including perfusion decellularization for kidney bioengineering or the administration of anti-rejection or genome-editing drugs in high doses to prime the kidney for transplantation. During the time of the perfusion, the kidney can be manipulated, renal function can be assessed, and various pharmaceuticals administered. After the procedure, the kidney can be transplanted or processed for molecular biology, biochemical analysis, or microscopy.
This paper describes the perfusate and the surgical technique needed for the ex vivo perfusion of mouse kidneys. Details of the perfusion apparatus are given and data are presented showing the viability of the kidney&#39;s preparation: renal blood flow, vascular resistance, and urine data as functional, transmission electron micrographs of different nephron segments as morphological readouts, and western blots of transport proteins of different nephron segments as molecular readout.

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. The buffers and surgical technique are described in detail.

الماوس معزولة تقنية الكلى Perfused

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...

Analysis of the Gap Junction-dependent Transfer of miRNA with 3D-FRAP Microscopy

Small antisense RNAs, like miRNA and siRNA, play an important role in cellular physiology and pathology and, moreover, can be used as therapeutic agents in the treatment of several diseases. The development of new, innovative strategies for miRNA/siRNA therapy is based on an extensive knowledge of the underlying mechanisms. Recent data suggest that small RNAs are exchanged between cells in a gap junction-dependent manner, thereby inducing gene regulatory effects in the recipient cell. Molecular biological techniques and flow cytometric analysis are commonly used to study the intercellular exchange of miRNA. However, these methods do not provide high temporal resolution, which is necessary when studying the gap junctional flux of molecules. Therefore, to investigate the impact of miRNA/siRNA as intercellular signaling molecules, novel tools are needed that will allow for the analysis of these small RNAs at the cellular level. The present protocol describes the application of three-dimensional fluorescence recovery after photobleaching (3D-FRAP) microscopy to elucidating the gap junction-dependent exchange of miRNA molecules between cardiac cells. Importantly, this straightforward and non-invasive live-cell imaging approach allows for the visualization and quantification of the gap junctional shuttling of fluorescently labeled small RNAs in real time, with high spatio-temporal resolution. The data obtained by 3D-FRAP confirm a novel pathway of intercellular gene regulation, where small RNAs act as signaling molecules within the intercellular network.

Here, we describe the application of three-dimensional fluorescence recovery after photobleaching (3D-FRAP) for the analysis of the gap junction-dependent shuttling of miRNA. In contrast to commonly applied methods, 3D-FRAP allows for the quantification of the intercellular transfer of small RNAs in real time, with high spatio-temporal resolution.

تحليل الفجوة تعتمد على تقاطع نقل ميرنا مع المجهر 3D فراب

Small antisense RNAs, like miRNA and siRNA, play an important role in cellular physiology and pathology and, moreover, can be used as therapeutic agents ...

A Simple and Efficient Method for In Vivo Cardiac-specific Gene Manipulation by Intramyocardial Injection in Mice

Gene manipulation specifically in the heart significantly potentiate the investigation of cardiac disease pathomechanisms and their therapeutic potential. In vivo cardiac-specific gene delivery is commonly achieved by either systemic or local delivery. Systemic injection via tail vein is easy and efficient in manipulating cardiac gene expression by using recombinant adeno-associated virus 9 (AAV9). However, this method requires a relatively high amount of vector for efficient transduction, and may result in nontarget organ gene transduction. Here, we describe a simple, efficient, and time-saving method of intramyocardial injection for in vivo cardiac-specific gene manipulation in mice. Under anesthesia (without ventilation), the pectoral major and minor muscles were bluntly dissected, and the mouse heart was quickly exposed by manual externalization through a small incision at the fourth intercostal space. Subsequently, adenovirus encoding luciferase (Luc) and vitamin D receptor (VDR), or short hairpin RNA (shRNA) targeting VDR, was injected with a Hamilton syringe into the myocardium. Subsequent in vivo imaging demonstrated that luciferase was successfully overexpressed specifically in the heart. Moreover, Western blot analysis confirmed the successful overexpression or silencing of VDR in the mouse heart. Once mastered, this technique can be used for gene manipulation, as well as injection of cells or other materials such as nanogels in the mouse heart.

A Simple and Efficient Method for In Vivo Cardiac-specific Gene Manipulation by Intramyocardial Injection in Mice

Here we present a protocol for cardiac-specific gene manipulation in mice. Under anesthesia, the mouse hearts were externalized through the fourth intercostal space. Subsequently, adenoviruses encoding specific genes were injected with a syringe into the myocardium, followed by protein expression measurement via in vivo imaging and Western blot analysis.

طريقة بسيطة وفعالة في فيفو التلاعب بالجينات الخاصة بالقلب بالحقن إينتراميوكارديال في الفئران

Gene manipulation specifically in the heart significantly potentiate the investigation of cardiac disease pathomechanisms and their therapeutic potential. ...

Analyzing the &alpha;-Actinin Network in Human iPSC-Derived Cardiomyocytes Using Single Molecule Localization Microscopy

The maturation of iPSC-derived cardiomyocytes is a critical issue for their application in regenerative therapy, drug testing and disease modeling. Despite the development of multiple differentiation protocols, the generation of iPSC cardiomyocytes resembling an adult-like phenotype remains challenging. One major aspect of cardiomyocytes maturation involves the formation of a well-organized sarcomere network to ensure high contraction capacity. Here, we present a super resolution-based approach for semi-quantitative analysis of the &#945;-actinin network in cardiomyocytes. Using photoactivated localization microscopy a comparison of sarcomere length and z-disc thickness of iPSC-derived cardiomyocytes and cardiac cells isolated from neonatal tissue was performed. At the same time, we demonstrate the importance of proper imaging conditions to obtain reliable data. Our results show that this method is suitable to quantitatively monitor the structural maturity of cardiac cells with high spatial resolution, enabling the detection of even subtle changes of sarcomere organization.

Analyzing the &#945;-Actinin Network in Human iPSC-Derived Cardiomyocytes Using Single Molecule Localization Microscopy

The formation of a proper sarcomere network is important for the maturation of iPSC-derived cardiomyocytes. We present a super resolution-based approach that allows for the quantitative evaluation of the structural maturation of stem cell derived cardiomyocytes, to improve culture conditions promoting cardiac development.

تحليل شبكة α أكتينين في الخلايا القلبية المشتقة من iPSC باستخدام المجهر توطين جزيء واحد

The maturation of iPSC-derived cardiomyocytes is a critical issue for their application in regenerative therapy, drug testing and disease modeling. ...

Dissection of the Endolymphatic Sac from Mice

The study of mutant mouse models of human hearing and balance disorders has unraveled many structural and functional changes which may contribute to the human phenotypes. Although important progress has been done in the understanding of the development and function of the neurosensory epithelia of the cochlea and vestibula, limited knowledge is available regarding the development, cellular composition, molecular pathways and functional characteristics of the endolymphatic sac. This is, in large part, due to the difficulty of visualizing and microdissecting this tissue, which is an epithelium comprised of only one cell layer. The study presented here describes an approach to access and microdissect the endolymphatic sac from the wild-type mouse inner ear at different ages. The result of a similar dissection is shown in a pendrin-deficient mouse model of enlargement of the vestibular aqueduct. A transgenic mouse with a fluorescent endolymphatic sac is presented. This reporter mouse can be used to readily visualize the endolymphatic sac with limited dissection and determine its size. It can also be used as an educational tool to teach how to dissect the endolymphatic sac. These dissection procedures should facilitate further characterization of this understudied part of the inner ear.

<meta charset="utf8"></head><body>تشريح الكيس اللمفاوي من الفئران

This study describes how to dissect the endolymphatic sac from the inner ear of the mouse at different ages. The result of a similar dissection is shown in an Slc26a4-null mouse model of enlargement of the endolymphatic sac. A transgenic mouse with a fluorescent reporter expressed in the endolymphatic sac is presented as a model to readily visualize the endolymphatic sac, and educational tool.

تشريح الكيس اللمفاوي من الفئران

The study of mutant mouse models of human hearing and balance disorders has unraveled many structural and functional changes which may contribute to the ...