فإن الكتاب أود أن أشكر السيد جوش Basford والدكتور لى شياو مين لتقديم المساعدة التقنية. وأيد هذا العمل في جزء من منح المعاهد الوطنية للصحة (DK70992 وDK92779 إلى ML).

1. إعداد وتعد طازجة جميع المخازن باستخدام تقنية معقمة وتصفية تعقيمها باستخدام فلتر كورنينج 0.22 ميكرون. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الإرواء العازلة أنا من خلال إضافة ما يلي إلى الحل هانك في سولت المتوازن (HBSS، دون كا 2 + والمغنيسيوم 2 +، انظر الجدول 1): 2 ملغ + (MgCl 2) إلى 0.9 مم، EDTA إلى 0.5 ملم، وHEPES إلى 25 ملي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الإرواء الثاني عازلة عن طريق إضافة التالية إلى HBSS (مع الكالسيوم والمغنيسيوم 2 + 2 +، انظر الجدول 1): HEPES إلى 25 ملم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الإرواء الثاني العازلة زائد collagenaseII: ذوب كولاجيناز الثاني (1000 U) مع 300 مل الإرواء العازلة الثاني والحفاظ على حل الحار في حمام الماء قبل التروية. وينبغي استخدام هذا الحل في غضون 30 دقيقة وذلك لأن النشاط الثاني كولاجيناز انخفضت مع الوقت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد متوسطة وليام الكامل: أضف ما يليإلى E ويليامز المتوسطة: L-الجلوتامين إلى 2 مم، الجنين مصل بقري (FBS) إلى 5٪؛ الأنسولين إلى 100 نانومتر، ديكساميثازون إلى 100 نانومتر، البنسلين إلى 100 وحدة دولية / مل والستربتوميسين إلى 100 ملغ / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وينبغي أن تكون درجة حرارة هذه المخازن المؤقتة لمدة 30 دقيقة في حمام ماء في 42 درجة مئوية، وهي درجة الحرارة المثلى المقابلة لدرجة حرارة مخرج في قنية من 37 درجة مئوية. </li></ol> 2. الإرواء الفئران لعزل الكبد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نظام نضح يتكون من مضخة وأنابيب silastic autoclavable وحمام المياه (انظر الشكل 1). مسبقا تعيين معدل التدفق للمضخة نضح تحوي على 10 مل / دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 تخدير الفئران البالغة (300 وزن الجسم ز) مع الكيتامين (IP) داخل الصفاق (87 من وزن الجسم ملغ / كلغ) زائد زيلازين (13 ملغ / كلغ). وينبغي رصد عمق التخدير بواسطة قرصة اصبع القدم. عندما الفأر لم يعد يستجيب لتحفيز الضارة، حلاقة الشعر في البطن والإعدادية في البطن مع betadine والايثانول. ادخل من خلال شق خط الوسط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فضحفي الوريد البابي الكبدي عن طريق نقل بعناية الأحشاء إلى الخارج حق من تجويف البطن، وإدراج angiocath 18-قياس في الوريد البابي الكبدي (انظر الشكل 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توصيل أنابيب سائل الإرواء إلى إبرة والشروع في ضخ في الوضع الطبيعي بمعدل تدفق منخفض (10 مل / دقيقة) مع (37 درجة مئوية) ما قبل حرارة الواق الإرواء أنا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا أجريت بشكل صحيح، وينبغي أن تبدأ على الفور في الكبد في تبييض. بمجرد تأكيد إقناء؛ إدخال القنية ناجحة، وجعل قطع في الوريد الأجوف السفلي (IVC) للسماح للهروب رأس المال (الشكل 1). يمكن إجراء اختبار آخر لإقناء؛ إدخال القنية ناجحة من خلال تطبيق ضغط خفيف مع مسحة معقمة على IVC؛ جميع فصوص الكبد يجب ان تبدأ بسرعة إلى تضخم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> زيادة معدل تدفق إلى 25 مل / دقيقة. وينبغي أن الكبد أصبح شاحب اللون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تبديل حل نضح إلى العازلة الإرواء الثاني الثاني كولاجيناز زائد مع أي انقطاع في تدفق للحصول على 6 دقائق إضافية. </li> &lt;لى&gt; دوري (5-10 مرات خلال الهضم) الضغط مع مسحة إلى IVC لمدة 5 الثانية وفترات. وسوف تضخم في الكبد، مما يؤدي إلى زيادة تفكك خلية الكبد، في المقابل خفض مجموع وقت الهضم، وزيادة العائد النهائي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد نضح كولاجيناز، ينبغي أن نبدأ في النظر الكبد طري. تشريح الكبد مجانا، مكان في كوب قبل مبرد العقيمة مع متوسط ​​مل وليام البالغ عددها 20 كاملة، ومن ثم أخذه إلى خلية الأنسجة ثقافة غطاء محرك السيارة. </li></ol> 3. الكبدية زنزانة انفرادية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> داخل الخلية غطاء محرك السيارة والثقافة، واستخدام مكشطة خلية لتفريق بلطف الخلايا في متوسطة وليام كاملة داخل طبق بتري معقمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصفية تشتت الخلية من خلال 100 ميكرون مسام حجم مصفاة خلية في أنبوب مخروطية 50 مل من أجل إزالة الأنسجة الضامة وشظايا الأنسجة غير مهضوم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعليق الخلايا في متوسطة مل وليام ال 40 كاملة وأجهزة الطرد المركزي في 50 XG لمدة 3 دقائق في درجة مئوية 4 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح طاف، وبلطف اعادة تعليق الخلايا في متوسطة 40 مل الباردة وليام الكامل لغسل الخلايا. كرر الطرد المركزي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح طاف، وبلطف اعادة تعليق الخلايا مع متوسط ​​مل وليام ال 25 كاملة. إضافة 25 مل حل Percoll 90٪ في برنامج تلفزيوني في أنبوب وتخلط بلطف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي في 200 XG لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية. نضح الخلايا الميتة من أعلى التدرج لأن خلايا قابلة للحياة لا تزال في الجزء السفلي من التدرج Percoll. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعليق بيليه الخلية في 30 مل متوسطة وليام الحارة كاملة، ثم كرر الطرد المركزي وإعادة تعليق بيليه الخلية في 20 مل متوسطة وليام الحارة كاملة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد الخلايا في تعليق خلية باستخدام عدادة الكريات وتحديد بقاء الخلية بواسطة تلوين أزرق التريبان. </li></ol> 4. الكبدية الثقافة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع الخلايا مع متوسط ​​وليام دافئ الكامل لتركيز المفضلة، على سبيل المثال 2.5 × 10 5 خلية / مل. لوحة الخلايا في حجم المطلوب على لوحات ثقافة الخلية، على سبيل المثال. 5 × 10 5 خلية / 2 مل / جيد، 6 آبار / لوحة، أو 2.5 × 10 5 خلية / مل 1.5 / جيد، و 12 بئرا / لوحة. الأمم المتحدة المغلفة لوحة على ما يرام لزراعة الخلايا الكبدية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في الإعدادية النموذجية مع الخلايا&gt; 85٪ قابلة للحياة، يجب أن كثافة الخلية تصل إلى حوالي 60-70٪ التقاء، والذي يسمح للخلية خلية الاتصال مع الحفاظ على مساحة كافية لخلايا الكبد في النمو إلى حجمها خلية كاملة وتسفر عن التقاء النهائي 90-95٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من أجل تشكيل لأحادي الطبقة حتى من خلايا الكبد، وبعبارة أخرى، للحد من ميل للخلايا لتجميع في المنطقة الوسطى من البئر (على الأرجح نتيجة لتدفق الهواء داخل الحاضنة من الخلية)، والسماح لوحات على البقاء داخل هود ثقافة خلية لمدة 30 دقيقة قبل وضعها في الحاضنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة الخلايا عند 37 درجة مئوية في جو مرطب للهواء 95٪ و 5٪ CO 2. بعد 4 ساعات والثقافة، ويمكن للخلايا لا تزال إما في المتوسط ​​مصل الدم المحتوية على نفسه أو استبدال المتوسطة مع F-المصلمتوسطة العناصر الأرضية النادرة، على سبيل المثال HepatoZYME-SFM (انظر الجدول 1). وسيلة خالية من مصل يساعد على الحفاظ على التشكل الخلية مع عدم وجود آثار ضارة من الهرمونات عند استخدام وسيلة خالية من المصل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح للخلايا من الانتعاش والنمو على الأقل خلال الليل قبل التجريب. من المستحسن استخدام الخلايا لاختبار في غضون 24 ساعة، لأن هذا قد يساعد في الحفاظ على وظيفة من الانزيمات الهامة (على سبيل المثال، P450s). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال متوسط ​​النمو على فترات اليوم 2، إذا لزم الأمر. </li></ol> 5. ممثل النتائج ووصف الظروف توليد بانتظام المحاصيل خلية من خلايا 1،0 10 8 س في إعداد من كبد الفئران واحد. وكانت صلاحية خلايا الكبد التي تقاس استبعاد أزرق التريبان باستمرار ضمن نطاق من 88 ~ 96٪. كما هو مبين في الشكل 2، وخلايا الكبد والكلي كتلة شكل بعد البذر ساعة 4. معظم الخلايا المعزولة تتسطح وانتشرت في نمو أحادي الطبقة نموذجي<html> . قبل 24 ساعة، وتحدد حواف الخلايا، سطح الخلايا على نحو سلس إلى حد ما، وقطرات دهن مرئية. هذه الخلايا لديها 1-3 نويات، والتي هي الجولة، التي تقع في مركز للخلايا، وحجم العرض نوى متسقة بين الخلايا (الشكل 2). <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/3917/3917fig1.jpg" /> الشكل 1. رسم تخطيطي من نضح الكبد. يتم إدراج angiocath 18-قياس في الوريد البابي للكبد، متصلا ثم أنابيب سائل الإرواء إلى الإبرة. بمجرد تأكيد إقناء؛ إدخال القنية ناجحة، وجعل قطع في الوريد الأجوف السفلي (IVC) للسماح للهروب رأس المال. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/3917/3917fig2.jpg" /> الشكل 2. الصرف من خلايا الكبد مثقف على مر الزمن (4 ساعة إلى 24 ساعة)، والعاشر التكبير 200. بعد تربيتها لمدة 24 ساعة، والخلايا المنتشرة في نمو أحادي الطبقة نموذجي، وتقاطعات بين الخلايا هي الخطية. <table borde</html style=";text-align:right;direction:rtl">R = &quot;1&quot;&gt; <tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td></tr><tr><td> HBSS (دون كا 2 +، والمغنيسيوم 2 +) </td><td> إينفيتروجن </td><td> 14174 </td></tr><tr><td> HBSS (مع كا 2 +، والمغنيسيوم 2 +) </td><td> إينفيتروجن </td><td> 14025 </td></tr><tr><td> وليامز E متوسطة </td><td> إينفيتروجن </td><td> 12551-032 </td></tr><tr><td> Collegenase الثاني </td><td> ورثينجتون </td><td> LS004176 </td></tr><tr><td> خلية مصفاة (100 ميكرون) </td><td> دينار بحريني </td><td> 352360 </td></tr><tr><td> HepatoZYME-SFM </td><td> إينفيتروجن </td><td> 17705 </td></tr><tr><td> Percoll </td><td> سيغما </td><td> P4937 </td></tr><tr><td> Angiocath (18 عيار) </td><td> دينار بحريني </td><td> 381705 </td></tr></tbody></table> الجدول رقم 1.

<ol>
	<li>Berry, M. N., Friend, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-yield+preparation+of+isolated+rat+liver+parenchymal+cells:+a+biochemical+and+fine+structural+study.">High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: a biochemical and fine structural study.</a> J. Cell Biol. 43, 506-520 (1969).</li><li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+isolated+rat+liver+cells.">Preparation of isolated rat liver cells.</a> Methods Cell Biol. 13, 29-83 (1976).</li><li>Saito, K., Kobayashi, K., Mizuno, Y., Fukuchi, Y., Furihata, T., Chiba, K., Schmidt, M., Schmitz, H. J., Baumgart, A., Guedon, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisome+proliferator-activated+receptor+alpha+(PPARalpha)+agonists+induce+constitutive+androstane+receptor+(CAR)+and+cytochrome+P450+2B+in+rat+primary+hepatocytes.">Peroxisome proliferator-activated receptor alpha (PPARalpha) agonists induce constitutive androstane receptor (CAR) and cytochrome P450 2B in rat primary hepatocytes.</a> Drug Metab. Pharmacokinet. 25, 108-111 (2010).</li><li>Gomez-Lechon, M. J., Donato, M. T., Castell, J. V., Jover, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+hepatocytes+in+primary+culture:+the+choice+to+investigate+drug+metabolism+in+man.">Human hepatocytes in primary culture: the choice to investigate drug metabolism in man.</a> Curr. Drug Metab. 5, 443-462 (2004).</li><li>Goncalves, L. A., Vigario, A. M., Penha-Goncalves, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+isolation+of+murine+hepatocytes+for+in+vitro+malaria+liver+stage+studies.">Improved isolation of murine hepatocytes for in vitro malaria liver stage studies.</a> Malar. J. 6, 169 (2007).</li><li>Bu, S. Y., Mashek, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+long-chain+acyl-CoA+synthetase+5+mediates+fatty+acid+channeling+between+anabolic+and+catabolic+pathways.">Hepatic long-chain acyl-CoA synthetase 5 mediates fatty acid channeling between anabolic and catabolic pathways.</a> J. Lipid Res. 51, 3270-3280 (2010).</li><li>Aiken, J., Cima, L., Schloo, B., Mooney, D., Johnson, L., Langer, R., Vacanti, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+in+rat+liver+perfusion+for+optimal+harvest+of+hepatocytes.">Studies in rat liver perfusion for optimal harvest of hepatocytes.</a> J. Pediatr. Surg. 25, 140-144 (1990).</li><li>Jauregui, H. O., McMillan, P. N., Hevey, K., Naik, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+analysis+of+lectin+binding+to+adult+rat+hepatocyte+cell+surfaces.">A quantitative analysis of lectin binding to adult rat hepatocyte cell surfaces.</a> In Vitro Cell. 24, 401-412 (1988).</li><li>Klaunig, J. E., Goldblatt, P. J., Hinton, D. E., Lipsky, M. M., Trump, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+liver+cell+culture.+II.+Primary+culture.">Mouse liver cell culture. II. Primary culture.</a> In Vitro. 17, 926-934 (1981).</li><li>Hay, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Operator-induced+contamination+in+cell+culture+systems.">Operator-induced contamination in cell culture systems.</a> Dev. Biol. Stand. 75, 193-204 (1991).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

ثقافة الرئيسي للخلايا الكبد هو نموذج في المختبر تستخدم على نطاق واسع لدراسة جوانب مختلفة من علم وظائف الأعضاء وعلم الأمراض في الكبد. على سبيل المثال، يتم استخدام الثقافة الأولية لتقييم التعبير وظيفة الإنزيمات المخدرات التأييض بما في ذلك السيتوكرومات P450، والتمثيل الغذائي للمخدرات، وتفاعلات العقاقير المخدرات، وآليات السمسة والسمية الجينية 3-7. ويتم تكييف البروتوكول وصف العزلة والثقافة في الخلايا الكبدية الفئران من التقارير السابقة من أيكن وآخرون. 8، وغيرها من 2،9،10 مع بعض التعديلات. ووصف الظروف تولد باستمرار خلايا الكبد قادرة على البقاء حتى الى 1.0 X 10 8 خلايا في إعداد مع بقاء الخلية بين 88 ~ 96٪. وفيما يلي الخطوات الحاسمة الأخرى: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كما هو الحال مع أي بروتوكول يصف ثقافة الخلية، فإن الجانب الأكثر أهمية هو لتجنب التلوث من مسببات الأمراض البكتيرية أو الفطرية باستخدام تقنيات التعقيم الدقيق 11. </li><lI&gt; قبل التروية، ينبغي أن تؤخذ الرعاية المناسبة لتجنب ثقب الجدار الخلفي من الوريد البابي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جسيم رابط، المعروف أيضا باسم الملتصقة البقعة، هو بنية خلية متخصصة للخلية الى خلية التصاق. سلامة جسيم رابط يتطلب الكالسيوم، ويتم تقسيمها بواسطة EDTA وسائل الإعلام خالية من الكالسيوم. لا يمكن للكولاجيناز الانزيمات فصل في جسيم رابط، مما أدى إلى عزل الخلايا الكبدية. ولذلك، نضح يستخدم كا 2 + المتوسطة حرة وكاليفورنيا في وقت لاحق 2 + المتوسطة الغنية التي تحتوي على الكالسيوم 2 + كولاجيناز التابعة، لعملية الهضم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> والعلاج الملائم كولاجيناز أمر جوهري للغاية لإعداد الكبدية. ينبغي إبقاء معدل تدفق الثاني Perfussion العازلة الثاني collegenase زائد في 25 مل / دقيقة. الأسباب الشائعة للثقافة الكبدية غير ناجحة ما يلي: 1) خلية الفقراء التفكك، والتي قد تكون راجعة إلى مخازن نضح حرارة غير ملائمة إلى 37 درجة مئوية و / أو بطء سرعة نضح؛ موت الخلايا و 2)، والذي قد يزيد عدد الجياعد يكون نتيجة لهضم كولاجيناز المفرطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توخي الحذر عند تغيير وسائل الاعلام بعد ان ثقافة 4-H الأولى، كما في خلايا الكبد لا تزال هشة نسبيا ويمكن أن تتلف بسهولة أو تعطلت عن طريق الاتصال المباشر؛ ماصة فقط في جانب من البئر، وأبدا مباشرة على الجزء العلوي من الخلايا. </li></ol>

isolation and primary culture of rat hepatic cells

الابتدائية ثقافة الكبدية هو أداة قيمة التي استخدمت على نطاق واسع في مجال البحوث الأساسية من وظائف الكبد، والأمراض، الفيزيولوجيا المرضية الصيدلة، والمواضيع الأخرى ذات الصلة. قدم للمرة الأولى في طريقة تقوم على نضح كولاجيناز من خطوتين لعزل خلايا الكبد سليمة من قبل بري وصديق في عام 1969 (1) ومنذ ذلك الحين، شهدت العديد من التعديلات. وقد وصفت هذه التقنية الأكثر استخداما من قبل Seglenin 1976 2. في الأساس، هي خلايا الكبد فصلها عن الجرذان الكبار تخدير عن طريق نضح كولاجيناز عدم اعادة توزيع من خلال الوريد البابي. ثم يتم تصفية الخلايا المعزولة من خلال 100 ميكرون فلتر حجم المسام شبكة النايلون، وتربيتها على لوحات. بعد 4 ساعات والثقافة، ويتم استبدال المتوسطة مع المتوسطة المحتوية على مصل أو مصل الحرة، على سبيل المثال HepatoZYME-SFM، لمزيد من الوقت لثقافة. هذه الإجراءات تتطلب خطوات ثقافة الجراحية والعقيمة التي يمكن البرهنة على نحو أفضل عن طريق الفيديو من قبل النص. Hيحرث، ونحن توثيق خطوات مفصلة لهذه الإجراءات من قبل كل من الفيديو وبروتوكول مكتوب، والتي تسمح باستمرار في توليد خلايا الكبد قادرة على البقاء في أعداد كبيرة.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells at JoVE.com

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

خلايا الكبد الأولية توفير أداة قيمة لتقييم البيوكيميائية، وظائف الجزيئية، والتمثيل الغذائي في نظام تجريبي ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية. وصفنا بروتوكول موثوق لفأر في تروية الكبد الموقع، الذي يولد باستمرار خلايا الكبد قادرة على البقاء حتى to1.0 × 10<sup&gt; 8</sup&gt; خلايا في إعداد مع بقاء الخلية بين 88 ~ 96٪.

العزلة والثقافة الأساسي في الخلايا الكبدية الجرذ

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

isolation-and-primary-culture-of-rat-hepatic-cells

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

55.5K Views.  University of Cincinnati College of Medicine. خلايا الكبد الأولية توفير أداة قيمة لتقييم البيوكيميائية، وظائف الجزيئية، والتمثيل الغذائي في نظام تجريبي ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية. وصفنا بروتوكول موثوق لفأر في تروية الكبد الموقع، الذي يولد باستمرار خلايا الكبد قادرة على البقاء حتى to1.0 × 10 8 ?...

Video: Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research. Nevertheless, establishment of robust, viable cultured adult myocytes can be a technically challenging, rate-limiting step for many researchers. Here we described a protocol to obtain a high yield of adult rat heart myocytes that remain viable in culture for several days. The heart is isolated and perfused with collagenase and protease under low Ca2+ conditions to recover single myocytes. Ca2+-tolerant cells are obtained by stepwise increases in extracellular Ca2+ concentration in three subsequent wash steps. Cells are filtered, resuspended in culture medium, and plated on laminin coated slips. Cultured myocytes obtained using this protocol are viable for up to four days and are suitable for most experiments including electrophysiology, biochemistry, imaging and molecular biology.

In this paper, we described a typical way to isolate and culture adult rat heart myocytes. Collagenase and protease are used to digest and isolate single myocytes. Myocytes cultured follow this protocol meet most experiment requirements.

الابتدائية ثقافة الكبار Myocytes قلب فأر

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research.  Nevertheless, establishment of robust, viable ...

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various chemokines and growth factors 1,2. However, once in the TME, these cells lose the ability to promote anti-tumor immunity and begin to support tumor growth and down-regulate anti-tumor immune responses 3-4. Studies on tumor-associated leukocytes have mainly focused on cells isolated from tumor-draining lymph nodes or spleen due to the inherent difficulties in obtaining sufficient cell numbers and purity from the primary tumor. While identifying the mechanisms of cell activation and trafficking through the lymphatic system of tumor bearing mice is important and may give insight to the kinetics of immune responses to cancer, in our experience, many leukocytes, including dendritic cells (DCs), in tumor-draining lymph nodes have a different phenotype than those that infiltrate tumors 5,6 . Furthermore, we have previously demonstrated that adoptively-transferred T cells isolated from the tumor-draining lymph nodes are not tolerized and are capable of responding to secondary stimulation in vitro unlike T cells isolated from the TME, which are tolerized and incapable of proliferation or cytokine production 7,8. Interestingly, we have shown that changing the tumor microenvironment, such as providing CD4+ T helper cells via adoptive transfer, promotes CD8+ T cells to maintain pro-inflammatory effector functions 5. The results from each of the previously mentioned studies demonstrate the importance of measuring cellular responses from TME-infiltrating immune cells as opposed to cells that remain in the periphery. To study the function of immune cells which infiltrate tumors using the Miltenyi Biotech isolation system9, we have modified and optimized this antibody-based isolation procedure to obtain highly enriched populations of antigen presenting cells and tumor antigen-specific cytotoxic T lymphocytes. The protocol includes a detailed dissection of murine prostate tissue from a spontaneous prostate tumor model (TRansgenic Adenocarcinoma of the Mouse Prostate -TRAMP) 10 and a subcutaneous melanoma (B16) tumor model followed by subsequent purification of various leukocyte populations.

In this report, we describe a protocol for isolating highly purified populations of leukocytes that infiltrate tumors. This protocol is adapted from the Miltenyi Biotech protocol to enhance yield and purity for isolating cells from complex tumor tissue.

عزل الخلايا المناعية من الأورام الأولية

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one week. More than 20 x 106 acinar cells can be obtained from a single murine pancreas. This protocol offers the possibility to independently process as many as 10 pancreases in parallel. Because it preserves acinar architecture, this model is well suited for studying the physiology of the exocrine pancreas in vitro in contrast to cell lines established from pancreatic tumors, which display many genetic alterations resulting in partial or total loss of their acinar differentiation.

In this publication, we describe a rapid and convenient procedure for isolating and culturing primary pancreatic acinar cells from the murine pancreas. This method constitutes a valuable approach to study the physiology of fresh primary normal/untransformed exocrine pancreatic cells.

العزلة والثقافة من الماوس الأساسي خلايا البنكرياس عنيبية

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

العزلة والثقافة الابتدائية من خلايا الفأر الأورطي غشائي

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

عزل وثقافة الكرياتينية الماوس الرئيسية من حديثي الولادة والفأر الكبار الجلد

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Primary Culture of Rat Adrenocortical Cells and Assays of Steroidogenic Functions

The hormone which the adrenal cortex secretes is vital for animals against stress and diseases. The method described here is the procedure of primary cultured rat adrenal cells and related functional assays (immunofluorescence staining of lipid droplet surface protein, as well as corticosterone analysis). Unlike an in vivo model, the variation of interexperiments in adrenal monolayer cultures is less and the experimental condition is easy to control. Besides, the source of rats is also more stable than other animals, like bovine ones. There are also several human adrenal cell lines (NCI-H295, NCI-H295R, SW13, etc.) that can be used in adrenal studies. However, the steroid production of these lines will still be influenced by numerous factors, which include serum lot number, passage number, mutant/loss of distinct genes, etc. Except for lacking 17&#945;-hydroxylase, the primary culture of rat adrenocortical cells is a better and more convenient technique for studying adrenal physiology. In summary, primary rat adrenal cultures could be a good in vitro platform for researchers to investigate the mechanisms of the reagent of interest in the adrenal gland system.

The hormone secreted by the adrenal cortex is vital for animals against stress and diseases. Here, we present a protocol to culture the primary rat adrenal cells. It could be a good in vitro platform for investigating the mechanisms of the reagent of interest in adrenal steroidogenesis and lipid biosynthesis.

الثقافة الأولية من خلايا الفئران البطاني وفحوصات لوظائف ستيرويدوجينيك

The hormone which the adrenal cortex secretes is vital for animals against stress and diseases. The method described here is the procedure of primary ...

Isolation and Culture of Primary Aortic Endothelial Cells from Miniature Pigs

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a suitable organ source. Immune rejection and coagulation are two major hurdles for the success of xenotransplantation. Vascular endothelial cell (EC) injury and dysfunction are important for the development of the inflammation and coagulation responses in xenotransplantation. Thus, isolation of porcine aortic endothelial cells (pAECs) is necessary for investigating the immune rejection and coagulation responses. Here, we have developed a simple enzymatic approach for the isolation, characterization, and expansion of highly purified pAECs from miniature pigs. First, the miniature pig was anaesthetized with ketamine, and a length of aorta was excised. Second, the endothelial surface of aorta was exposed to 0.005% collagenase IV digestive solution for 15 min. Third, the endothelial surface of the aorta was scraped in only one direction with a cell scraper (&#60;10 times), and was not compressed during the process of scraping. Finally, the isolated pAECs of Day 3, and after passage 1 and passage 2, were identified by flow cytometry with an anti-CD31 antibody. The percentages of CD31-positive cells were 97.4% &#177; 1.2%, 94.4% &#177; 1.1%, and 92.4% &#177; 1.7% (mean &#177; SD), respectively. The concentration of Collagenase IV, the digestive time, the direction, and frequency and intensity of scraping are critical for decreasing fibroblast contamination and obtaining high-purity and a large number of ECs. In conclusion, our enzymatic method is a highly-effctive method for isolating ECs from the miniature pig aorta, and the cells can be expanded in vitro to investigate the immune and coagulation responses in xenotransplantation.

An effective enzymatic method for isolation of primary porcine aortic endothelial cells (pAECs) from miniature pigs is described. The isolated primary pAECs can be used to investigate the immune and coagulation response in xenotransplantation.

عزل وثقافة الخلايا البطانية الأبهرية الأولية من الخنازير المصغرة

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a ...

Isolation, Culture, and Genetic Engineering of Mammalian Primary Pigment Epithelial Cells for Non-Viral Gene Therapy

Age-related macular degeneration (AMD) is the most frequent cause of blindness in patients &#62;60 years, affecting ~30 million people worldwide. AMD is a multifactorial disease influenced by environmental and genetic factors, which lead to functional impairment of the retina due to retinal pigment epithelial (RPE) cell degeneration followed by photoreceptor degradation. An ideal treatment would include the transplantation of healthy RPE cells secreting neuroprotective factors to prevent RPE cell death and photoreceptor degeneration. Due to the functional and genetic similarities and the possibility of a less invasive biopsy, the transplantation of iris pigment epithelial (IPE) cells was proposed as a substitute for the degenerated RPE. Secretion of neuroprotective factors by a low number of subretinally-transplanted cells can be achieved by Sleeping Beauty (SB100X) transposon-mediated transfection with genes coding for the pigment epithelium-derived factor (PEDF) and/or the granulocyte macrophage-colony stimulating factor (GM-CSF). We established the isolation, culture, and SB100X-mediated transfection of RPE and IPE cells from various species including rodents, pigs, and cattle. Globes are explanted and the cornea and lens are removed to access the iris and the retina. Using a custom-made spatula, IPE cells are removed from the isolated iris. To harvest RPE cells, a trypsin incubation may be required, depending on the species. Then, using RPE-customized spatula, cells are suspended in medium. After seeding, cells are monitored twice per week and, after reaching confluence, transfected by electroporation. Gene integration, expression, protein secretion, and function were confirmed by qPCR, WB, ELISA, immunofluorescence, and functional assays. Depending on the species, 30,000-5 million (RPE) and 10,000-1.5 million (IPE) cells can be isolated per eye. Genetically modified cells show significant PEDF/GM-CSF overexpression with the capacity to reduce oxidative stress and offers a flexible system for ex vivo&#160;analyses and in vivo studies transferable to humans to develop ocular gene therapy approaches.

Here, a protocol to isolate and transfect primary iris and retinal pigment epithelial cells from various mammals (mice, rat, rabbit, pig, and bovine) is presented. The method is ideally suited to study ocular gene therapy approaches in various set-ups for ex vivo&#160;analyses and&#160;in vivo studies transferable to humans.

العزلة والثقافة والهندسة الوراثية للخلايا الظهارية الصباغية الأولية للثدييات للعلاج الجيني غير الفيروسي

Age-related macular degeneration (AMD) is the most frequent cause of blindness in patients &#62;60 years, affecting ~30 million people worldwide. AMD is a ...

Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control

Primary hepatocytes are widely used in basic research on liver diseases and for toxicity testing in vitro. The two-step collagenase perfusion procedure for primary hepatocyte isolation is technically challenging, especially in portal vein cannulation. The procedure is also prone to occasional contamination and variations in perfusion conditions due to difficulties in the assembly, optimization, or maintenance of the perfusion setup. Here, a detailed protocol for an improved two-step collagenase perfusion procedure with multiparameter perfusion control is presented. Primary rat hepatocytes were successfully and reliably isolated by taking the necessary technical precautions at critical steps of the procedure, and by reducing the operational difficulty and mitigating the variability of perfusion parameters through the adoption of a special intravenous catheter, standardized sterile disposable tubing, temperature control, and real-time monitoring and alarm system. The isolated primary rat hepatocytes consistently exhibit high cell viability (85%-95%), yield (2-5 x 108 cells per 200-300 g rat) and functionality (albumin, urea and CYP activity). The procedure was complemented by an integrated perfusion system, which is compact enough to be set up in the laminar flow hood to ensure aseptic operation.

This protocol details the use of a special intravenous catheter, standardized sterile disposable tubing, temperature control complemented by real-time monitoring, and an alarm system for two-step collagenase perfusion procedure to improve the consistency in the viability, yield, and functionality of isolated primary rat hepatocytes.

عزل خلايا كبد الفئران الأولية مع التحكم في التروية متعدد المعلمات

Primary hepatocytes are widely used in basic research on liver diseases and for toxicity testing in vitro. The two-step collagenase perfusion procedure ...

Isolation of Primary Mouse Retinal Pigmented Epithelium Cells

The retinal pigmented epithelium (RPE) layer lies immediately behind the photoreceptors and harbors a complex metabolic system that plays several critical roles in maintaining the photoreceptors' function. Thus, the RPE structure and function are essential to sustain normal vision. This manuscript presents an established protocol for primary mouse RPE cell isolation. RPE isolation is a great tool to investigate the molecular mechanisms underlying RPE pathology in the different mouse models of ocular disorders. Furthermore, RPE isolation can help in comparing primary mouse RPE cells isolated from wild-type and genetically modified mice, as well as testing drugs that can accelerate the development of therapy for visual disorders. The manuscript presents a step-by-step RPE isolation protocol; the entire procedure, from enucleation to seeding, takes approximately 4 hours. The media shouldn't be changed for 5-7 days after seeding, to allow the growth of the isolated cells without disturbance. This process is followed by the characterization of morphology, pigmentation, and specific markers in the cells via immunofluorescence. Cells can be passaged a maximum of three or four times.

This manuscript describes a simplified protocol for the isolation of retinal pigmented epithelium (RPE) cells from mouse eyes in a stepwise manner. The protocol includes the enucleation and dissection of mouse eyes, followed by the isolation, seeding, and culturing of RPE cells.

عزل الخلايا الظهارية المصطبغة بالشبكية الأولية للفأر

The retinal pigmented epithelium (RPE) layer lies immediately behind the photoreceptors and harbors a complex metabolic system that plays several critical ...