وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة R01 DK05823 (لRGW)، F32 DK083213 (لjww قليلة)، F30 DK081265 (لالو)، وبواسطة منحة من فريد وسوزان الكبد للأطفال Biesecker مركز (لRGW).

ويتم إجراء كامل في درجة حرارة الغرفة ما لم ينص على خلاف ذلك. 1. إعداد حلول الإنزيم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد حلول انزيم وفق الجدول (1) ومرشح العقيمة باستخدام ميكرومتر 0.22 فلتر. إبقاء حل 1 و 2 في حل درجة حرارة الغرفة وحل 3 في 4 درجات مئوية حتى وقت الاستخدام. يجب على كل الحلول والمعدات ملامسة خلايا معزولة تكون عقيمة. </li></ol> 2. إعداد التجهيزات الإرواء <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رئيس النظام نضح مع HBSS ناقص الكالسيوم 2 + ملغم / 2 +، والتي تم تحسنت إلى 37 درجة مئوية. ملاحظة: للتأكد من أن سائل الإرواء هي 37 درجة مئوية عندما تصل إلى الكبد، وتحسنت HBSS في حمام ماء تعيين إلى 37 درجة مئوية. بعد أن يمر من خلال مضخة نضح، وغني عن طريق مكثف تغلف الزجاج الذي يتم وصله بجهاز المياه مجموعة دائري إلى 40 درجة مئوية (الشكل 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعقيم جراحي للعملية شريان الحياة في كوب مع الايثانول 70٪. </li></ol> 3. نضح من الكبد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير شخص بالغ من الذكور، سبراغ داولي عن طريق الحقن داخل الصفاق من Nembutal (50-100 وزن الجسم مغ / كغ حسب الضرورة للحصول على التخدير الكافي). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الحيوان في موقف ضعيف على صينية من البلاستيك وتحديد أطرافه إلى علبة مع الشريط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنظيف البطن مع EtOH 70٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل شق صغير في الجلد على البطن في خط الوسط. تشريح الجلد بعيدا عن لفافة من خلال جعل كبير على شكل حرف U قطع على البطن. قطع عضلات البطن مع مقص بعد نفس الشكل لكشف التجويف البريتوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فضح الوريد البابي باستخدام قطعة قطن 2 للانتقال بلطف أحشاء البطن إلى الجانب الأيمن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعدى اثنين من الحرير والخيوط الجراحية المعقمة تحت 2.0 في الوريد البابي وربط فضفاضة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يقني؛ يدخل القنية في الوريد البابي مع قسطرة مقياس الرابع 16-18 و تأمين القسطرة في مكانها من خلال تشديد TI فضفاضةالغرز إد من الخطوة السابقة (الشكل 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن الهيبارين المخفف عن طريق القسطرة رابعا (1 مل ​​من وحدة هيبارين USP 5000 / مل مخففة مع 4 مل من HBSS ناقص الكالسيوم 2 + / 2 ملغ +). وينبغي أن الكبد تبييض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توصيل قسطرة الرابع لهذا النظام نضح. يروي مع HBSS ناقص الكالسيوم 2 + / 2 ملغ + بمعدل 20 مل / دقيقة لمدة 10 دقائق. المسح الشامل للIVC السفلي للكبد لتسمح بتصريف الدم وسائل الإرواء. نضح الدم المجمعة من تجويف البطن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغيير السائل نضح في التوصل إلى حل كولاجيناز 0.3٪ (150 ملغ من كولاجيناز من النوع 2 في HBSS 500 مل زائد كا 2 + / + 2 ملغ)، ويروي لمدة 25 دقيقة. الحفاظ على رطوبة الكبد عن طريق تغطية ذلك مع رفرف البطن تشريح سابقا. وضع غطاء طبق بيتري على رفرف في البطن وموقف مصباح الحرارة على المنطقة للحفاظ على درجة الحرارة داخل البطن عند 37 درجة مئوية تقريبا </li></ol> 4. إعداد اله الشجرة الصفراوية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الكبد عن طريق رفعها من خارج تجويف البطن مع ملقط ووضعها في صحن زراعة الأنسجة عقيمة ملأت مع وسائل الاعلام الباردة ليبوفيتز لL-15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العمل في النسيج غطاء محرك السيارة والثقافة، وانزع كبسولة الكبد وندف بلطف لحمة الكبد وبصرف النظر بالملقط. نقل كبد من خلال عدة اطباق مليئة Liebovitz وسائل الاعلام لL-15 مع الاستمرار في مشط بعيدا لحمة، حتى ترك أخيرا مع الشجرة الصفراوية معزولة. لحمة الكبد هو أسمر اللون، في حين أن شجرة المتبقية الصفراوية أبيض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع شجرة معزولة الصفراوية في أنبوب 50 مل صقر مليئة 10 مل من الستربتوميسين / البنسلين (10000 وحدة دولية / مل من البنسلين و10000 ميكروغرام / مل الستربتومايسين)؛ ترك على الجليد لمدة 15 دقيقة. </li></ol> 5. عزل الخلايا الليفية كسر البوابة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الشجرة الصفراوية في معقم 50 مل أنبوب صقر واللحم المفروم مع مقص العقيمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة كمية صغيرة من سول انزيمution # 1 في أنبوب (حوالي 5 مل) والاستمرار في اللحم المفروم والشجرة الصفراوية حتى تصل إلى اتساق من الطين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب المزيج في زجاجة زجاجية معقمة. تغسل صقر أنبوب مع الحل المتبقي رقم 1، ثم صب عليه في زجاجة. احتضان في 37 درجة مئوية مع اهتزاز عند 100 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصفية الطين من خلال كوب مغطاة بطبقة واحدة من شبكة من النايلون (30 ميكرون حجم المسام). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل أي نوع من الأنسجة المتبقية على رأس شبكة لقنينة زجاجية معقمة بواسطة شبكة غسل مع حل انزيم # 2. تبدأ بصب نصف (25 مل) من الحل في معقم 15 سم طبق بيتري. إزالة بعناية شبكة من الدورق عن طريق الضغط على حواف شبكة دون تلويث منطقة المركز، ثم قلب وعيون وغمس به الى حل في طبق بيتري لإزالة أي نوع من الأنسجة المتبقية على شبكة. تجاهل شبكة. نقل الحل في طبق بيتري في زجاجة زجاجية معقمة. شطف طبق بيتري مع ريماining 25 مل من محلول رقم 2 وتحويلها الى زجاجة واحدة. احتضان في 37 درجة مئوية مع اهتزاز عند 100 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في غضون ذلك، أخذ الراشح في دورق وتصب في أنبوب 50 مل صقر. الطرد المركزي في 1600 دورة في الدقيقة (460 س ز) لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح في وسائل الإعلام وresuspend بيليه في 25 مل من محلول رقم 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتخاذ حل من خطوة 5.5 وتصفية عليه في الدورق معقمة الثانية فشملت 30 ميكرون مع شبكة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل شبكة. منبذة الراشح في 1600 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. نضح وresuspend وبيليه مع 25 مل من محلول رقم 3 كما حدث في الخطوة 5.7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الجمع بين الكسور 2 من خطوات 5.7 و 5.9 الطرد المركزي ومرة ​​أخرى في 1600 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح في وسائل الإعلام وresuspend بيليه في 10 مل من بوابة وسائل الإعلام ثقافة الخلايا الليفية (DMEM/F12 تستكمل مع FBS 10٪ fungizone 1٪ البنسلين / الستربتومايسين، جنتاميسين 0.3٪، و 0.2٪،). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد الخلايا للبقاء، وطبق في أطباق زراعة الأنسجة. اعتمادا على التطبيق المطلوب، 0.5 إلى 5 × 10 6 خلية لكل 10 سم نسيج لوحة ثقافة مناسبة. من الفئران، سبراغ داولي الكبار، وعادة ما نحصل على 2-10000000 خلايا قابلة للحياة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحل محل وسائل الإعلام ثقافة في اليوم التالي لإزالة الحطام غير ملتصقة. بعد ذلك، تحل محل وسائل الإعلام ثقافة كل يوم 2. </li></ol> 6. ممثل النتائج وتظهر الخلايا الليفية المدخل الرئيسي المعزولة من كبد الفئران الكبار في 1 و 3 و 7 أيام بعد العزلة (الشكل 3). لاحظ أن الخلايا ممدود، مع نموذجي مورفولوجيا الخلايا الليفية. ويمكن ملطخة الخلايا المضادة للأجسام المضادة الإيلاستين (CL55041AP، Cedarlane مختبرات، برلنغتون، NC) للتأكد من نقاء. الليفية بوابة الخضوع لتفريق myofibroblastic في الثقافة. يمكن أن يكون أظهر هذا من قبل المناعية للأكتين العضلات على نحو سلس α (α-SMA، A2547، سيغما، سانت لويس، MO). <tableالحدود = &quot;1&quot;&gt; <tbody><tr><td rowspan="2"> 0.3٪ كولاجيناز حل </td><td> النوع 2 كولاجيناز </td><td> 150 ملغ </td></tr><tr><td> HBSS مع كا 2 + / 2 ملغ + </td><td> 500 مل </td></tr><tr><td rowspan="7"> حل # 1 (Pronase) </td><td> ألبومين المصل البقري </td><td> 50 ملغ </td></tr><tr><td> كولاجيناز من النوع 2 </td><td> 25 ملغ </td></tr><tr><td> Pronase </td><td> 18 ملغ </td></tr><tr><td> الدناز </td><td> 3 ملغ </td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> 47.5 مل </td></tr><tr><td> القلم / بكتيريا </td><td> 1 مل </td></tr><tr><td> مصل بقري جنيني </td><td> 1.5 مل </td></tr><tr><td> حل # 2 </td><td> ألبومين المصل البقري </td><td> 50 ملغ </td></tr><tr><td rowspan="6"> (هيالورونيداز) </td><td> كولاجيناز من النوع 2 </td><td> 25 ملغ </td></tr><tr><td> هيالورونيداز </td><td> 22 مغ </td></tr><tr><td> الدناز </td><td> 3 ملغ </td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> 47.5 مل </td></tr><tr><td> القلم / بكتيريا </td><td> 1 مل </td></tr><tr><td> مصل بقري جنيني </td><td> 1.5 مل </td></tr><tr><td rowspan="2"> حل # 3 </td><td> الدناز </td><td> 3 ملغ </td></tr><tr><td> RPMI المتوسط ​​1640 </td><td> 50 مل </td></tr></tbody></table> الجدول رقم 1. حلول الانزيم. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/3669/3669fig1.jpg" /> الشكل 1. ضبط نضح حتى ألف. شكل دائري المياه لارتفاع درجة حرارة العمود. العمود B. تحتوي على وسائل الاعلام نضح. جيم الصمام السيطرة على تدفق المضخة. D. مضخة تدفق. هاء متغير السرعة مضخة تمعجية. واو قارورة فراغ مع بيو النظيفة المنظفات. G. الحرارة مصباح. H. ماء الحمام لوسائل الإعلام نضح الاحترار. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/3669/3669fig2.jpg" /> فيقوإعادة 2. في نضح الموضع. A. رابعا القسطرة إدراجها في الوريد البابي، مع تأمين خياطة ومتصلة بشبكة أنابيب التروية عن طريق محبس. ب زجاج ماصة متصلة قارورة فراغ والشفط لإزالة جدار نضح السوائل استنزاف للخروج من IVC مقطوع. أولا الأمعاء. L. الكبد. <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/3669/3669fig3.jpg" /> الشكل 3. على النقيض مرحلة المناعي وصمة عار من الخلايا الليفية بوابة فأر في الثقافة. الليفية بوابة تربيتها لمدة 1 و 3 و 7 أيام بعد العزلة كانت ثابتة وملطخة للالإيلاستين، α SMA ودابي.

<ol>
	<li>Parola, M., Marra, F., Pinzani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myofibroblast+-+like+cells+and+liver+fibrogenesis:+Emerging+concepts+in+a+rapidly+moving+scenario.">Myofibroblast - like cells and liver fibrogenesis: Emerging concepts in a rapidly moving scenario.</a> Mol. Aspects Med. 29, 58-66 (2008).</li><li>Dranoff, J. A., Wells, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Portal+fibroblasts:+Underappreciated+mediators+of+biliary+fibrosis.">Portal fibroblasts: Underappreciated mediators of biliary fibrosis.</a> Hepatology. 51, 1438-1444 (2010).</li><li>Tuchweber, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+and+phenotypic+modulation+of+portal+fibroblasts+in+the+early+stages+of+cholestatic+fibrosis+in+the+rat.">Proliferation and phenotypic modulation of portal fibroblasts in the early stages of cholestatic fibrosis in the rat.</a> Lab Invest. 74, 265-278 (1996).</li><li>Beaussier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prominent+contribution+of+portal+mesenchymal+cells+to+liver+fibrosis+in+ischemic+and+obstructive+cholestatic+injuries.">Prominent contribution of portal mesenchymal cells to liver fibrosis in ischemic and obstructive cholestatic injuries.</a> Lab Invest. 87, 292-303 (2007).</li><li>Kinnman, N., Housset, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peribiliary+myofibroblasts+in+biliary+type+liver+fibrosis.">Peribiliary myofibroblasts in biliary type liver fibrosis.</a> Front Biosci. 7, d496-d503 (2002).</li><li>Kinnman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+myofibroblastic+conversion+of+peribiliary+fibrogenic+cells+distinct+from+hepatic+stellate+cells+is+stimulated+by+platelet-derived+growth+factor+during+liver+fibrogenesis.">The myofibroblastic conversion of peribiliary fibrogenic cells distinct from hepatic stellate cells is stimulated by platelet-derived growth factor during liver fibrogenesis.</a> Lab Invest. 83, 163-173 (2003).</li><li>Uchio, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+retinol-binding+protein-1+expression+and+modulation+during+in+vivo+and+in+vitro+myofibroblastic+differentiation+of+rat+hepatic+stellate+cells+and+portal+fibroblasts.">Cellular retinol-binding protein-1 expression and modulation during in vivo and in vitro myofibroblastic differentiation of rat hepatic stellate cells and portal fibroblasts.</a> Lab Invest. 82, 619-628 (2002).</li><li>Kruglov, E. A., Jain, D., Dranoff, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+primary+rat+liver+fibroblasts.">Isolation of primary rat liver fibroblasts.</a> J. Investig. Med. 50, 179-184 (2002).</li><li>Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transforming+growth+factor-beta+and+substrate+stiffness+regulate+portal+fibroblast+activation+in+culture.">Transforming growth factor-beta and substrate stiffness regulate portal fibroblast activation in culture.</a> Hepatology. 46, 1246-1256 (2007).</li><li>Bosselut, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+proteomic+features+of+two+fibrogenic+liver+cell+populations:+hepatic+stellate+cells+and+portal+myofibroblasts.">Distinct proteomic features of two fibrogenic liver cell populations: hepatic stellate cells and portal myofibroblasts.</a> Proteomics. 10, 1017-1028 (2010).</li><li>Dranoff, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ecto-nucleoside+triphosphate+diphosphohydrolase+NTPDase2/CD39L1+is+expressed+in+a+novel+functional+compartment+within+the+liver.">The ecto-nucleoside triphosphate diphosphohydrolase NTPDase2/CD39L1 is expressed in a novel functional compartment within the liver.</a> Hepatology. 36, 1135-1144 (2002).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

الليفية بوابة تلعب دورا هاما في التليف الصفراوي. نحن هنا وصفا لتعديل بروتوكول الأصلية التي نشرتها Kruglov وDranoff 8 لعزل الخلايا الليفية بوابة من كبد الفئران، وتوفير وسيلة مباشرة لدراسة هذه الفئة من السكان الخلايا في المختبر. هذا النهج يستخدم الهضم البروتيني والترشيح حجم القاعدة. والميزة الرئيسية لهذه الطريقة التي يمكن الحصول عليها من السكان نقي نسبيا من الخلايا دون مرور في الثقافة، وتمكن من دراسة التعبير الجيني أو وظيفية سلوك الخلية بعد عدة أيام من العزلة. هذا الأسلوب يوفر أيضا القدرة على عزل الخلايا من الكبد على حد سواء صحية ومريضة. واحدة من الخطوات الأكثر أهمية في هذا البروتوكول هو الهضم الأنزيمي من لحمة الكبد. لضمان نجاح عملية الهضم، من المهم أن تؤكد ينضب تماما أن الدم من الكبد خلال perfu الأوليةسيون عن طريق التأكد من أن هناك ابيضاض حتى من الكبد. لتسهيل هذا، فمن الممكن استخدام مسحة القطن لتدليك بلطف في الكبد بينما perfusing. الإفراط في هضم نتائج حمة الكبد في تحقيق عائد منخفض من خلايا قابلة للحياة، في حين أن وكيل الهضم سيجعل من الصعب فصل لحمة الكبد من الشجرة الصفراوية. ربما منذ استعدادات pronase يكون التغير في النشاط الأنزيمي بين الكثير مختلفة، وتعظيم الاستفادة من الكمية المستخدمة عندما تكون هناك حاجة إلى وجود عائد منخفض من خلايا قابلة للحياة. يجوز تعديل هذا البروتوكول لعزل الخلايا الليفية بوابة من كبد فأر أو الشباب كبد الفئران باستخدام أصغر قسطرة الرابع على مقياس يقني؛ يدخل القنية في الوريد البابي، وخفض حجم حلول نضح بما يتناسب مع وزن الحيوان، وخفض معدل نضح الكبد لحوالي 10 مل / دقيقة. بوابة الليفية في ثقافة الخضوع لتفريق myofibroblastic في 10-14 يوما، كما يتضح من α-SMA السابقينpression 9. وقد استخدمت علامات مختلفة للتمييز بين الخلايا الليفية بوابة من الخلايا النجمية كبدي، بما في ذلك fibulin-2، IL-6، الإيلاستين، نوكليوزيد ثلاثي الفوسفات diphosphohydrolase-2 (NTPDase2)، 1-cofilin وبروتينات الخلايا العصبية مثل synaptophysin 2 و 6 و 10 و 11 . لقد وجدنا أن الإيلاستين هو علامة جيدة لالليفية البوابة، وحتى بعد تمايز myofibroblastic، في حين خسر NTPDase2 بعد الليفية بوابة خضعوا لثقافة بعد عدة أيام 9. ولذلك، فإننا نؤكد عادة عزل الخلايا الليفية المدخل تلطيخ المناعي للالإيلاستين. الحد من هذه التقنية هو أنه، مباشرة بعد عزل الخلايا الليفية البوابة، وهناك نسبة ضئيلة من الخلايا بما في ذلك تلويث كوبفر والخلايا الصفراوية. والخلايا الليفية بوابة تتفوق هذه الخلايا الملوثة في غضون 2-3 أيام، ومع ذلك، مما يعني أن عدد السكان نقي نسبيا (&gt; 98٪) 9. SINCE الليفية بوابة في ثقافة الخضوع لتفريق myofibroblastic على البلاستيك زراعة الأنسجة، وعلينا أن ندرس هذه الخلايا عادة في غضون 7 أيام من العزلة. تتم المحافظة على الخلايا في وسائل الإعلام بوابة الثقافة الليفية التي تحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني، كما هو موضح في القسم طرق. ومع ذلك، فإن هذه الخلايا البقاء على قيد الحياة في وسائط النمو التي تحتوي على 2٪ مصل بقري جنيني لعدة أيام. نحن عادة لا تستخدم وسائل الاعلام المصل منخفضة حتى 24 ساعة على الأقل بعد العزلة. مرة واحدة تخضع لتمايز الخلايا الليفية بوابة myofibroblastic، يمكن passaged هم عدة مرات، وأبقى كما أسهم المجمدة من myofibroblasts.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td></tr><tr><td> النوع 2 كولاجيناز </td><td> الكيمياء الحيوية ورثينجتون (ليكوود، نيو جيرسي) </td><td> LS004177 </td></tr><tr><td> Pronase </td><td> روش (انديانابوليس، IN) </td><td> 70290120 </td></tr><tr><td> هيالورونيداز </td><td> سيغما (سانت لويس، MO) </td><td> H3506 </td></tr><tr><td> ديوكسي ريبونيوكلياز </td><td> سيغما </td><td> D4527 </td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> إينفيتروجن (كارلسباد، كاليفورنيا) </td><td> 11320 </td></tr><tr><td> HBSS دون كا 2 + / 2 ملغ + </td><td> Mediatech (ماناساس، فرجينيا) </td><td> 21-021-CM </td></tr><tr><td> HBSS مع كا 2 + / 2 ملغ + </td><td> Mediatech </td><td> 21-020-CM </td></tr><tr><td> ليبوفيتز لL-15 </td><td> إينفيتروجن </td><td> 11415 </td></tr><tr><td> RPMI متوسط ​​1640 </td><td> إينفيتروجن </td><td> 11875 </td></tr><tr><td> ألبومين المصل البقري </td><td> سيغما </td><td> A2153 </td></tr><tr><td> الأبقار مصل الجنين </td><td> الجوزاء بيو (غرب سكرامنتو، كاليفورنيا) </td><td> 900-108 </td></tr><tr><td> Nitex نايلون شبكة 30 ميكرون </td><td> جينيسي العلمية (سان دييغو، كاليفورنيا) </td><td> 57-105 </td></tr></tbody></table>

isolation of rat portal fibroblasts by in situ liver perfusion

يتم تعريف تليف الكبد عن طريق الترسيب المفرط للالمصفوفة خارج الخلية بواسطة myofibroblasts المنشط. هناك السلائف متعددة من myofibroblasts كبدي، بما في ذلك الخلايا النجمية كبدي، بوابة الليفية ونخاع العظام الخلايا الليفية المشتقة 1. وكانت الخلايا النجمية كبدي أفضل درس، ولكن يتم التعرف على نحو متزايد الليفية بوابة كمساهمين المهم أن تجمع myofibroblast، ولا سيما في التليف الصفراوي 2. الليفية بوابة الخضوع الانتشار استجابة لإصابات الظهارية الصفراوية، ولعب دورا رئيسيا يحتمل أن تكون في المراحل المبكرة من الصفراوية تندب 3-5. وهناك طريقة لعزل الخلايا الليفية بوابة تسمح للدراسة في المختبر من سكان هذه الخلايا وتؤدي إلى مزيد من الفهم لدور الخلايا الليفية بوابة لعب في التليف الصفراوي. وتم عزل الخلايا الليفية بوابة باستخدام تقنيات مختلفة بما في ذلك ثمرة 6 و 7 و لىالنسخة نضح مع الهضم الأنزيمي تليها اختيار حجم 8. وتستفيد من عملية الهضم وتقنية اختيار حجم مقارنة مع تقنية ثمرة هي التي يمكن دراستها الخلايا دون الحاجة للمرور في الثقافة. هنا، نحن تصف نسخة معدلة من هذه التقنية الأصلية التي وصفها Kruglov وDranoff 8 لعزل الخلايا الليفية بوابة من كبد الفئران أن النتائج في عدد السكان نقي نسبيا من الخلايا الأولية.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion at JoVE.com

Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion

يوصف تقنية لعزل الخلايا الليفية بوابة من كبد الفئران. وperfused الأكباد وهضمها<em&gt; في الموقع</em&gt; مع كولاجيناز، تليها<em&gt; خارج الحي</em&gt; الهضم من الطين الكبد واختيار حجم الخلايا. هذا الأسلوب يوفر السكان نقية من الخلايا الليفية البوابة دون الحاجة للمرور في الثقافة.

عزل الخلايا الليفية بوابة الجرذ من قبل<em&gt; في الموقع</em&gt; الكبد الإرواء

Liver fibrosis is defined  by the excessive deposition of extracellular matrix by activated  myofibroblasts. There are multiple precursors of hepatic ...

isolation-of-rat-portal-fibroblasts-by-in-situ-liver-perfusion

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion

19.2K Views.  The Children's Hospital of Philadelphia. يوصف تقنية لعزل الخلايا الليفية بوابة من كبد الفئران. وperfused الأكباد وهضمها في الموقع مع كولاجيناز، تليها خارج الحي الهضم من الطين الكبد واختيار حجم الخلايا. هذا الأسلوب يوفر السكان نقية من الخلايا الليفية البوابة دون الحاجة للمرور في الثقافة.

Video: Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion

In vivo Liver Endocytosis Followed by Purification of Liver Cells by Liver Perfusion

The liver is the metabolic center of the mammalian body and serves as a filter for the blood. The basic architecture of the liver is illustrated in figure 1 in which more than 85% of the liver mass is composed of hepatocytes and the remaining 15% of the cellular mass is composed of Kupffer cells (KCs), stellate cells (HSCs), and sinusoidal endothelial cells (SECs). SECs form the blood vessel walls within the liver and contain specialized morphology called fenestrae within in the cytoplasm. Fenestration of the cytoplasm is the appearance of holes (&tilde;100 &mu;m) within the cells so that the SECs act as a sieve in which most chylomicrons, chylomicron remnants and macromolecules, but not cells, pass through to the hepatocytes and HSCs 1 (Fig. 1). Due to the lack of a basement membrane, the gap between the SECs and hepatocytes form the Space of Disse. HSCs occupy this space and play a prominent role in regulation and response to injury, storage of retinoic acid and immunoregulation of the liver 2.
SECs are among the most endocytically active cells of the body displaying an array of scavenger receptors on their cell surface 3. These include SR-A, Stabilin-1 and Stabilin-2. Generally, small colloidal particles less than 230 nm and macromolecules in buffer phase are taken up by SECs, whereas, large particles and cellular debris is endocytosed (phagocytosed) by KCs 4. Thus, the bulk clearance of extracellular material such as the glycosaminoglycans from blood is largely dependent on the health and endocytic functions of SECs 5,6. For example, an increase in blood hyaluronan levels is indicative of liver disease ranging from mild to more severe forms 7.
With the exception of one report 8, there are no immortalized SEC cell lines in existence. Even this immortalized cell line is de-differentiated in that it does not express scavenger receptors that are present on primary SECs (our data, not shown). All cell biological studies must be performed on primary cells obtained freshly from the animal. Unfortunately, SECs dedifferentiate under standard culture conditions and must be used within 1 or 2 days upon isolation from the animal. Differentiation of SECs is marked by the expression of Stabilin-2 or HARE receptor 9 , CD31, and the presence of cytoplasmic fenestration 1. Differentiation of SECs can be extended by the addition of VEGF in culture media or by culturing cells in hepatocyte conditioned medium 10,11.
In this report, we will demonstrate the endocytic activity of SECs in the intact organ using radio-labeled heparin for hyaluronan for the SEC-specific Stabilin-2 receptor. We will then purify hepatocytes and SECs from the perfused liver to measure endocytosis.

In vivo Liver Endocytosis Followed by Purification of Liver Cells by Liver Perfusion

The study of liver sinusoidal endothelial cells (SECs) must be performed with primary cells obtained from the animal as no cell lines exist. This method relies on liver digestion and differential centrifugation for SEC purification for subsequent culturing and experimentation.

في الإلتقام الكبد المجراة تلاه تنقية خلايا الكبد الكبد الإرواء

The liver is the metabolic center of the mammalian body and serves as a filter for the blood.  The basic architecture of the liver is illustrated in ...

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal circulation, intact whole muscle, at body temperature. This includes the study of contractile responses like posttetanic potentiation, staircase and fatigue. Furthermore, the consequences of disease, disuse, injury, training and drug treatment can be of interest. This video demonstrates appropriate procedures to set up and use this valuable muscle preparation.
To set up this preparation, the animal must be anesthetized, and the medial gastrocnemius muscle is surgically isolated, with the origin intact. Care must be taken to maintain the blood and nerve supplies. A long section of the sciatic nerve is cleared of connective tissue, and severed proximally. All branches of the distal stump that do not innervate the medial gastrocnemius muscle are severed. The distal nerve stump is inserted into a cuff lined with stainless steel stimulating wires. The calcaneus is severed, leaving a small piece of bone still attached to the Achilles tendon. Sonometric crystals and/or electrodes for electromyography can be inserted. Immobilization by metal probes in the femur and tibia prevents movement of the muscle origin. The Achilles tendon is attached to the force transducer and the loosened skin is pulled up at the sides to form a container that is filled with warmed paraffin oil. The oil distributes heat evenly and minimizes evaporative heat loss. A heat lamp is directed on the muscle, and the muscle and rat are allowed to warm up to 37&deg;C. While it is warming, maximal voltage and optimal length can be determined. These are important initial conditions for any experiment on intact whole muscle. The experiment may include determination of standard contractile properties, like the force-frequency relationship, force-length relationship, and force-velocity relationship.
With care in surgical isolation, immobilization of the origin of the muscle and alignment of the muscle-tendon unit with the force transducer, and proper data analysis, high quality measurements can be obtained with this muscle preparation.

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

This video demonstrates the surgical preparation and procedures needed to study the contractile responses of the rat medial gastrocnemius muscle preparation in situ. This preparation allows measurement of skeletal muscle contractile properties under physiological conditions. The animal is anesthetized and the muscle is separated from surrounding tissue at its distal end. The Achilles tendon is attached to a force transducer, allowing measurement of the muscle&#x2019;s contractile response at 37 degrees C with an intact circulation.

إجراءات الجرذ<em&gt; في الموقع</em&gt; خصائص العضلات الهيكلية مقلص

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal ...

Isolation of CD133+ Liver Stem Cells for Clonal Expansion

Liver stem cell, or oval cells, proliferate during chronic liver injury, and are proposed to differentiate into both hepatocytes and cholangiocytes. In addition, liver stem cells are hypothesized to be the precursors for a subset of liver cancer, Hepatocellular carcinoma. One of the primary challenges to stem cell work in any solid organ like the liver is the isolation of a rare population of cells for detailed analysis. For example, the vast majority of cells in the liver are hepatocytes (parenchymal fraction), which are significantly larger than non-parenchymal cells. By enriching the specific cellular compartments of the liver (i.e. parenchymal and non-parenchymal fractions), and selecting for CD45 negative cells, we are able to enrich the starting population of stem cells by over 600-fold.The proceduresdetailed in this report allow for a relatively rare population of cells from a solid organ to be sorted efficiently. This process can be utilized to isolateliver stem cells from normal murine liver as well as chronic liver injury models, which demonstrate increased liver stem cell proliferation. This method has clear advantages over standard immunohistochemistry of frozen or formalin fixed liver as functional studies using live cells can be performed after initial co-localization experiments. To accomplish the procedure outlined in this report, a working relationship with a research based flow-cytometry core is strongly encouraged as the details of FACS isolation are highly dependent on specialized instrumentation and a strong working knowledge of basic flow-cytometry procedures. The specific goal of this process is to isolate a population of liver stem cells that can be clonally expanded in vitro.

Here we describe the isolation of CD133 expressing liver stem cells and cancer stem cells from whole murine liver, a process that requires tissue digestion, cell enrichment, and flow cytometry isolation. We include methods for advanced single cell isolation and clonal expansion.

عزل CD133 خلايا + الجذعية الكبد للتوسع نسيلي

Liver stem cell, or oval cells, proliferate during chronic liver injury, and are proposed to differentiate into both hepatocytes and cholangiocytes. In ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental gene expression 1,2,3,4,5,6,7. The recent discovery of thousands of lncRNAs in association with specific chromatin modification complexes, such as Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) that mediates histone H3 lysine 27 trimethylation (H3K27me3), suggests broad roles for numerous lncRNAs in managing chromatin states in a gene-specific fashion 8,9. While some lncRNAs are thought to work in cis on neighboring genes, other lncRNAs work in trans to regulate distantly located genes. For instance, Drosophila lncRNAs roX1 and roX2 bind numerous regions on the X chromosome of male cells, and are critical for dosage compensation 10,11. However, the exact locations of their binding sites are not known at high resolution. Similarly, human lncRNA HOTAIR can affect PRC2 occupancy on hundreds of genes genome-wide 3,12,13, but how specificity is achieved is unclear. LncRNAs can also serve as modular scaffolds to recruit the assembly of multiple protein complexes. The classic trans-acting RNA scaffold is the TERC RNA that serves as the template and scaffold for the telomerase complex 14; HOTAIR can also serve as a scaffold for PRC2 and a H3K4 demethylase complex 13.
Prior studies mapping RNA occupancy at chromatin have revealed substantial insights 15,16, but only at a single gene locus at a time. The occupancy sites of most lncRNAs are not known, and the roles of lncRNAs in chromatin regulation have been mostly inferred from the indirect effects of lncRNA perturbation. Just as chromatin immunoprecipitation followed by microarray or deep sequencing (ChIP-chip or ChIP-seq, respectively) has greatly improved our understanding of protein-DNA interactions on a genomic scale, here we illustrate a recently published strategy to map long RNA occupancy genome-wide at high resolution 17. This method, Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP) (Figure 1), is based on affinity capture of target lncRNA:chromatin complex by tiling antisense-oligos, which then generates a map of genomic binding sites at a resolution of several hundred bases with high sensitivity and low background. ChIRP is applicable to many lncRNAs because the design of affinity-probes is straightforward given the RNA sequence and requires no knowledge of the RNA's structure or functional domains.

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

ChIRP is a novel and rapid technique to map genomic binding sites of long noncoding RNAs (lncRNAs). The method takes advantage of the specificity of anti-sense tiling oligonucleotides to allow the enumeration of lncRNA-bound genomic sites.

لونين عزل من قبل تنقية الحمض النووي الريبي (السقسقة)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology and other related subjects. The method based on two-step collagenase perfusion for isolation of intact hepatocytes was first introduced by Berry and Friend in 1969 1 and, since then, has undergone many modifications. The most commonly used technique was described by Seglenin 1976 2. Essentially, hepatocytes are dissociated from anesthetized adult rats by a non-recirculating collagenase perfusion through the portal vein. The isolated cells are then filtered through a 100 &mu;m pore size mesh nylon filter, and cultured onto plates. After 4-hour culture, the medium is replaced with serum-containing or serum-free medium, e.g. HepatoZYME-SFM, for additional time to culture. These procedures require surgical and sterile culture steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol, which allow consistently in the generation of viable hepatocytes in large numbers.

Primary hepatocytes provide a valuable tool to evaluate biochemical, molecular, and metabolic functions in a physiologically relevant experimental system. We describe a reliable protocol for rat in situ liver perfusion, which consistently generates viable hepatocytes up to 1.0 &times; 108 cells per preparation with cell viability between 88 ~ 96%.

العزلة والثقافة الأساسي في الخلايا الكبدية الجرذ

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are the most prominent cell type within the tumor stroma of many cancers, in particular breast carcinoma, and their prominent presence is often associated with poor prognosis1,2. CAFs are an activated subpopulation of stromal fibroblasts, many of which express the myofibroblast marker &alpha;-SMA3. CAFs originate from local tissue fibroblasts as well as from bone marrow-derived cells recruited into the developing tumor and adopt a CAF phenotype under the influence of the tumor microenvironment4. CAFs were shown to facilitate tumor initiation, growth and progression through signaling that promotes tumor cell proliferation, angiogenesis, and invasion5-8. We demonstrated that CAFs enhance tumor growth by mediating tumor-promoting inflammation, starting at the earliest pre-neoplastic stages9. Despite increasing evidence of the key role CAFs play in facilitating tumor growth, studying CAFs has been an on-going challenge due to the lack of CAF-specific markers and the vast heterogeneity of these cells, with many subtypes co-existing in the tumor microenvironment10. Moreover, studying fibroblasts in vitro is hindered by the fact that their gene expression profile is often altered in tissue culture11,12 . To address this problem and to allow unbiased gene expression profiling of fibroblasts from fresh mouse and human tissues, we developed a method based on previous protocols for Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS)13,14. Our approach relies on utilizing PDGFR&alpha; as a surface marker to isolate fibroblasts from fresh mouse and human tissue. PDGFR&alpha; is abundantly expressed by both normal fibroblasts and CAFs9,15 . This method allows isolation of pure populations of normal fibroblasts and CAFs, including, but not restricted to &alpha;-SMA+ activated myofibroblasts. Isolated fibroblasts can then be used for characterization and comparison of the evolution of gene expression that occurs in CAFs during tumorigenesis. Indeed, we and others reported expression profiling of fibroblasts isolated by cell sorting16. This protocol was successfully performed to isolate and profile highly enriched populations of fibroblasts from skin, mammary, pancreas and lung tissues. Moreover, our method also allows culturing of sorted cells, in order to perform functional experiments and to avoid contamination by tumor cells, which is often a big obstacle when trying to culture CAFs.

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

Cancer Associated Fibroblasts (CAFs) facilitate tumor initiation, growth and progression through signaling that promotes proliferation, angiogenesis, and inflammation. Here we describe a method to isolate pure populations of normal fibroblasts and CAFs from fresh mouse and human tissues by cell sorting, using PDGFR&#x03B1; as a surface marker.

عزل الخلايا الليفية عادي والسرطان يرتبط بها من الأنسجة الطازجة من الإسفار خلية المنشط الفرز (FACS)

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are the most prominent cell type within the tumor stroma of many cancers, in particular breast carcinoma, and their ...

Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. As such, hepatocytes are an important model for a large variety of research questions. In particular, the use of human hepatocytes is especially important in the fields of pharmacokinetics, toxicology, liver regeneration and translational research. Thus, this method presents a modified version of a two-step collagenase perfusion procedure to isolate hepatocytes as described by Seglen 1.
Previously, hepatocytes have been isolated by mechanical methods. However, enzymatic methods have been shown to be superior as hepatocytes retain their structural integrity and function after isolation. This method presented here adapts the method designed previously for rat livers to human liver pieces and results in a large yield of hepatocytes with a viability of 77&plusmn;10%. The main difference in this procedure is the process of cannulization of the blood vessels. Further, the method described here can also be applied to livers from other species with comparable liver or blood vessel sizes.

A modified two-step collagenase perfusion procedure for isolation of human hepatocytes is described. This method can also be applied to other mammalian livers. The isolated hepatocytes are available in high yield and viability, making them a suitable model for scientific research in areas such as liver regeneration, pharmacokinetics and toxicology.

عزل خلايا الكبد البشرية من قبل خطوتين كولاجيناز الإرواء الداخلي

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. ...

Simultaneous Isolation of High Quality Cardiomyocytes, Endothelial Cells, and Fibroblasts from an Adult Rat Heart

The rat is an important animal model used in cardiovascular research, and rat cardiac cells are used routinely for in vitro analysis of the molecular mechanisms of cardiovascular disease progression such as cardiac hypertrophy, fibrosis, and atherosclerosis. Although several attempts with variable success have been made to develop immortalized cell lines from the cardiovascular system to understand these cellular mechanisms, primary cells offer a more natural and close to in vivo environment for such studies. Therefore, different laboratories working on a particular cell type have developed protocols to isolate individual types of rat cardiac cells of interest. A protocol that allows the isolation of more than one cell type, however, is missing. Here an optimized protocol is described that allows the isolation of high-quality major cardiac cell types (cardiomyocytes, endothelial cells, and fibroblasts) from a single preparation and enables their use for cellular analyses. This permits the most efficient use of available resources, which may save time and reduce research costs.

Several protocols have been developed and described for the isolation of different cardiac cell types from a rat heart. Here, an optimized protocol is described that allows the isolation of high-quality major cardiac cell types (cardiomyocytes, endothelial cells, and fibroblasts) from a single preparation, reducing the experimental costs.

العزلة في وقت واحد من كارديوميوسيتس عالية الجودة، الخلايا البطانية، والألياف الليفية من القلب الجرذ الكبار

The rat is an important animal model used in cardiovascular research, and rat cardiac cells are used routinely for in vitro analysis of the molecular ...

Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that mitigate fibrosis. However, fibroblast research has been hindered due to the lack of universally acceptable fibroblast markers to identify quiescent as well as activated fibroblasts. Fibroblasts are a heterogenous cell population, making them difficult to isolate and characterize. The presented protocol describes three different methods to enrich fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts. Using a standard and reliable protocol to isolate fibroblasts will enable the study of their roles in homeostasis as well as fibrosis modulation.

Obtaining a pure population of fibroblasts is crucial to studying their role in wound repair and fibrosis. Described here is a detailed method to isolate fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts followed by characterization of their purity and functionality by immunofluorescence, RTPCR, fluorescence-assisted cell sorting, and collagen gel contraction.

عزل وتوصيف الخلايا الليفية القلبية للبالغين والخلايا الليفية الليفية

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that ...

Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the isolation of these vesicles, including ultracentrifugation, ultrafiltration, and size exclusion chromatography. However, not all are suitable for large scale exosome purification and characterization. Outlined here is a protocol for establishing cultures of primary fibroblasts isolated from adult mouse skeletal muscles, followed by purification and characterization of exosomes from the culture media of these cells. The method is based on the use of sequential centrifugation steps followed by sucrose density gradients. Purity of the exosomal preparations is then validated by western blot analyses using a battery of canonical markers (i.e., Alix, CD9, and CD81). The protocol describes how to isolate and concentrate bioactive exosomes for electron microscopy, mass spectrometry, and uptake experiments for functional studies. It can easily be scaled up or down and adapted for exosome isolation from different cell types, tissues, and biological fluids.

This protocol illustrates the 1) the isolation and culture of primary fibroblasts from the adult mouse gastrocnemius muscle as well as 2) purification and characterization of exosomes using a differential ultracentrifugation method combined with sucrose density gradients followed by western blot analyses.

عزل وتوصيف الإكسوسومات من الخلايا الليفية العضلية الهيكلية

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the ...