وأيد هذا العمل عن طريق منح R01 - HL87290 ، R01 - S1 HL87290 وR01 - AI082610 من المعاهد الوطنية للصحة لLJMC.

1. حج القحف A حج القحف في 8 إلى 10 أسبوعا من العمر الفئران الاحتياجات التي يتعين القيام بها في وقت مبكر ك 1 الموصوفة سابقا ، إلا أنه لم يتم وضع شريط التيتانيوم في رأس الحيوان. نافذة المزمن هو فحص الجمجمة التحضير مستقر يسمح للدوران الأوعية الدقيقة حنوني أشهر حتى بعد أن زرع. عادة ، نحن لدينا إجراء دراسات 2-3 أسابيع بعد الزرع النافذة في الجمجمة. 2. Intravital المجهري <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ليومين أو ثلاثة أسابيع بعد حج القحف ، يتم فحص درجة حرارة الجسم ومن ثم الفأر هو تخدير باستخفاف مع isoflurane (4 ٪ لتحريض ، 1-2 ٪ للصيانة). يستخدم التخدير الخفيفة لمنع التوتر والانزعاج الحيوانات أثناء إجراء التجارب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم توضع في موقف الحيوانات المعرضة على إطار التجسيمي ورئيس المضمون بعناية باستخدام قضبان الأذن. يتم ضبط مستوى باستخدام العتلات اليمين واليسار. يتم الاحتفاظ درجة حرارة الجسم الأساسية باستخدام وسادة التدفئة. لأن الفئران مع الملاريا الدماغية تطوير انخفاض حرارة الجسم ، وضبط درجة الحرارة يجب أن يتم تعديلها لكل حيوان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تنظيف بلطف زلة تغطية على نافذة الجمجمة مع قطعة من القطن مبللة مع الزيوت المعدنية ويتم التقاط صورة بانورامية للسفن تحت النافذة مع مساعدة من stereomicroscope وكاميرا رقمية (نيكون 995 ، اليابان). تتم طباعة الصور ، التي تم تحديدها ومؤرخة وسيتم استخدامها كخريطة للقياسات من قطر السفينة وسرعات خلايا الدم الحمراء (RBC). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم يتم نقل الماوس لمرحلة المجهر intravital (مخصصة لايكا - McBain ، سان دييغو ، كاليفورنيا). يتم وضع قطرة من الماء على النافذة الجمجمة الاستفادة من تشكيل جيدا من الاكريليك الأسنان ، ويتم ضبط التركيز. وتجرى القياسات باستخدام الغمر بالماء 20X (LUMPFL - WIR ، الفتحة العددية 0.6 ، أوليمبوس) الهدف. يتم اتباع نفس السفن بحيث يمكن إجراء المقارنات المباشرة إلى مستويات خط الأساس الخاص بها مما يسمح للإحصاءات أكثر قوة لعينة صغيرة من السكان. يتم التقاط الصور باستخدام الكاميرا الرقمية منخفضة الضوء عالية السرعة (هاماماتسو C9300 - 221 ، اليابان) ، أو منخفضة الضوء الكاميرا التماثلية (COHU 4815 ، وسان دييغو ، كاليفورنيا) متصلا إلى شريط فيديو (JVC ، اليابان) ، وختم الوقت (فيديو MicroImage نظم ، Boyertown ، والسلطة الفلسطينية) وشاشة ملونة (بيلكو ، كلوفيس ، كاليفورنيا). يتم التعرف بشكل صحيح على الشريط قبل بدء التسجيل ، والطابع الزمني يتيح التعرف على الأحداث من خلال توثيق الجدول الزمني الذي تم خلاله تكبد مثل هذه الأحداث. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم إجراء الفحص الأول من السفن لتقييم جودة لإعداد وإذا كان الدم يتدفق في جميع السفن. ثم ، يتم اختيار من السفن إلى أن تقاس ، وينبغي أن تشمل الأوردة والشرايين من أقطار مختلفة (في الأعمال التحضيرية لدينا حنوني الماوس ، ومعظم السفن التي تتراوح ما بين 20 و 80μm) وتغطي مواقع مختلفة داخل منطقة كشفها بواسطة النافذة. ويمكن الشرايين والأوردة متباينة بسهولة عن طريق التحقق من اتجاه تدفق الدم في تشعبات السفينة (سواء كانت توزع أو يجمع الدم). في دراستنا ، يتم إجراء قياسات في 12 سفينة. الموقع الدقيق من كل بقعة على أن يقاس هو مشروح في الصورة من الأوعية الدموية حنوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل بقعة ، يتم قياس قطر السفينة باستخدام جهاز القص الصورة (صورة القص ، فيستا الإلكترونيات ، وسان دييغو ، كاليفورنيا) 2. مرة واحدة يتم تحديد المكان ، يتم محاذاة صورة للسفينة في الوضع الرأسي والمنفصمة الصورة حتى يتم محاذاة المتطرفة تعارض ويتم توثيق القراءة. ويمكن ترجمة هذه القيمة إلى ميكرومتر بواسطة المعايرة السابقة لكل التكبير محددة باستخدام مرحلة المعايرة شبكاني ميكرومتر (ادموند بصريات ، وشركة بارينغتون ، ونيو جيرسي). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تسجيل كل بقعة خلال 30 ثانية على الأقل لتتبع كرات الدم الحمراء. لتتبع ، يتم جمع عينة من الدم ، وfluorescently المسمى الكريات الحمراء مع carbocyanine صبغ ديل (المسابر الجزيئية ، كارلسباد ، كاليفورنيا) وأكسب من خلال الوريد الذيل للحصول على التركيز في الجسم الحي من 0،4-0،5 ٪ ~ 3. في الحيوانات المصابة المتصورة berghei أنكا (PBA) معربا عن ببروتين أخضر (PBA - GFP ، تبرعا من أبحاث الملاريا والمراجع الكاشف مركز الموارد MR4 ، ماناساس ، فرجينيا ؛ أودعتها Janse CJ والمياه ا ف ب) ، أي ضخ المسمى الخلية هو ضروري. يتم تسجيل صور الفيديو بسرعة 150 لقطة في الثانية. يتم تعيين هذا المعدل للحصول على صور 1-6 في خلية على الإطار فيديو واحد لتحديد سرعات تصل إلى 8 ملم / ثانية. والرقمية وصور الفيديو مع جهاز كمبيوتر شخصي باستخدام برنامج Adobe 4.0 الممتاز ، ويتم الحصول على البيانات XY تنسيق لكل صورة الخلية باستخدام SigmaScan برو 4.0 البرمجيات (SPSS شيكاغو ، IL) 4. وتتحدد المواقف الخلية بدلا من يدويا عن طريق تحليل الصور ، نظرا لأنه يظهر للعين من مراقب مدربين لإعطاء تقدير جيد لموقع مركز للخلية ، والتيح عموما يناظر موقع مضان القصوى لاحظ توجهات معظم الخلية. تصنع قرارات متعددة لموقف والسرعة ، ولكل خلية للحصول على متوسط ​​السرعة يعني RBC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما يتم إجراء قياسات سرعة RBC حاليا ، في الوقت الملاحظة الإجمالية لكل الماوس لا تتجاوز 10-15 دقيقة التقليل من الآثار cardiodepressive من التخدير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة بقطر السفينة وقياسات سرعة RBC متوفرة ، ويمكن إجراء حساب تدفق الدم في كل سفينة باستخدام الصيغة : س = س π V (D / 2) 2 ، حيث س = تدفق الدم ، V = RBC السرعة والتطوير = قطر السفينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن تكرار هذه الإجراءات على مر الزمن. على سبيل المثال ، في نموذج الفأر من الملاريا الدماغية ، ونحن أداء قياسات يومية ابتداء من يوم 4 من العدوى. تم تطبيع القيم التي تم الحصول عليها في كل يوم عن كل ما يتعلق الماوس في اليوم 0 (قبل الاصابة) ، الذي يعتبر أن تكون 100 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بالإضافة إلى قطر السفينة وقياسات تدفق الدم ، ويمكن إجراء تقييمات إضافية على سبيل المثال تقييم تحسين التروية وتحليل المتداول الكريات البيض و / أو الصفائح الدموية في الأوعية والتقيد حنوني. يتم تنفيذ هذه القياسات مع مساعدة من علامات الفلورسنت ذات العلامات. في حالة من الملاريا ، ويمكننا أيضا الكشف عن الطفيليات المنتشرة أو ملتصقة به من قبل وسائل الضغط التي تعبر عن PBA GFP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتقييم نضح نستخدم حل FITC المسمى ألبومين (سيغما ، وسانت لويس ، MO 50μg/mouse) ، والانضمام لقياس الكريات البيض للسفن حنوني نستخدم الأجسام المضادة ضد علامة عموم الكريات البيض CD45 الأحمر المسمى مع ولاية تكساس (TxR) ( Invitrogen ، كارلسباد ، كاليفورنيا 4μg/mouse). لهذا ، من 25μL مختلطة هي (200μg/mL) الألبومين FITC (2mg/mL) و20μL من أضداد CD45 - PE وحقن في الوريد قبل الذيل تحسنت. ويمكن عندئذ يمكن تصوير الماوس على الفور ، ولكن إذا تسرب القياسات سوف تتخذ يسمح الألبومين FITC أن تعمم لمدة 15 دقيقة. يتم التقاط مخضر (518nm) المنبعثة من FITC - الألبومين وGFP (PBA - GFP pRBC) باستخدام وALPHA حية : XF100 - 2 (أوميغا البصرية ، براتلبورو ، VT) ، ومكافحة CD45 TxR ومضان (615nm) وخرجت و أسر مع قياسي حيوي : XF42. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> والألبومين الفلورسنت ذات العلامات يسمح التصور تحسين شبكة الأوعية الدموية ، بما في ذلك سفن اختراق ، وانها مفيدة بشكل خاص في ولايات مثل مرض الملاريا الدماغية للتحقق من السفن غير perfused أو تحت perfused. ويمكن أيضا أن تستخدم لقياس تسرب الأوعية الدموية 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الفلوريسنت ذات العلامات المضادة للأضداد CD45 تجعل من السهل تحديد وقياس والتصاق الكريات البيض المتداول للسفن حنوني. لتجنب التحيز في تقدير ، ونحن كمية المتداول والتصاق في نفس المواقع المحددة مسبقا لقياس تدفق الدم. يرصد الكمي للالتصاق الكريات البيض التي تحصي عدد الكريات البيض في طول 100μm - السفينة. هو كمية المتداول من قبل احتساب عدد الكريات البيض السفر في سرعة أبطأ بكثير من سرعة الدم في طول 100μm نفسه ، وخلال 30 ثانية. </li></ol> 3. ممثل النتائج <img src="/files/ftp_upload/2184/2184fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. (الخطوة 2.6) صور من شبكة الأوعية الدموية الماوس حنوني الوصول إليها من خلال نافذة في الجمجمة. <img src="/files/ftp_upload/2184/2184fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. (3،1-3،5 خطوات) عرض تخطيطي للإعداد للفحص المجهري للدوران الأوعية الدقيقة intravital الماوس حنوني. 1 : المجهر intravital ؛ 2 : 20X الهدف غمر المياه ؛ 3 : مصدر الضوء ؛ 4A : الرقمية الإضاءة المنخفضة كاميرا عالية السرعة ؛ 4B : كاميرا تمثيلية ؛ 5 : الماوس في إطار التجسيمي ؛ 6 : شاشة الحاسوب ؛ 7 : التناظرية شيرر رصد تظهر كيف تتم تقطيع الصورة (السهم) لقياس قطرها السفينة. <img src="/files/ftp_upload/2184/2184fig3.jpg" alt="الشكل 3" /> الشكل 3. (الخطوة 3،6-3،8) الاوعية الدموية الدقيقة الخلية قياسات سرعة الدم الحمراء عن طريق تتبع خلية من تسجيلات الفيديو مضان سرعة عالية. صور من ألف إلى واو هي صور تسلسل سفينة واحدة حنوني ، مما يدل على واحد يتحرك RBC عبور محدد الحقل المجهري بواسطة الكاميرا. تقرير مختصر من الإطار بواسطة مناصب الإطار من 15 أو أكثر من الخلايا عبور المجال ، وعلى مسافة ما قبل معايرة ، ويتيح حساب سرعة RBC يعني في كل سفينة بمساعدة جدول بيانات Excel. <img src="/files/ftp_upload/2184/2184fig4.jpg" alt="الشكل 4" /> الشكل 4. (الخطوة 3.9) بيانات من تجربة تمثيلية تظهر التغيرات في تدفق الدم حنوني على مر الزمن في المتصورة berghei أنكا (PBA) الفئران المصابة (ن = 5) ، والسيطرة على الفئران غير المصابة (ن = 5). في حين أن الفئران السيطرة على تدفق الدم حنوني غير مستقرة نسبيا مع مرور الوقت ، PBA الفئران المصابة تبين انخفاضا ملحوظا في تدفق الدمفي ذلك الوقت للتنمية الملاريا الدماغية (اليوم 6). البيانات هي يعني ± SEM. <img src="/files/ftp_upload/2184/2184fig5.jpg" alt="الشكل 5" /> الشكل 5. (الخطوة 4.3) وهناك عدد كبير من الكريات البيض تمسكا السفن حنوني على فأرة الحاسوب المصابين المتصورة berghei أنكا ، كما يتضح من تلطيخ مع الأضداد الأحمر لمكافحة CD45 - تكساس الفلورسنت.

<ol>
	<li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+craniotomy+surgery+procedure+for+chronic+brain+imaging.">A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging.</a> J. Vis. Exp. (15), (2008).</li><li>Intaglietta, M., Tompkins, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvascular+measurements+by+video+image+shearing+and+splitting.">Microvascular measurements by video image shearing and splitting.</a> Microvasc. Res. 5, 309-312 (1973).</li><li>Briceno, J. C., Cabrales, P., Tsai, A. G., Intaglietta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radial+displacement+of+red+blood+cells+during+hemodilution+and+the+effect+on+arteriolar+oxygen+profile.">Radial displacement of red blood cells during hemodilution and the effect on arteriolar oxygen profile.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 286, 1223-1228 (2004).</li><li>Bishop, J. J., Nance, P. R., Popel, A. S., Intaglietta, M., Johnson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+erythrocyte+aggregate+size+and+flow+rate+in+skeletal+muscle+venules.">Relationship between erythrocyte aggregate size and flow rate in skeletal muscle venules.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 286, H113-120 (2004).</li><li>Baldwin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+hemoglobins+produce+venular+interendothelial+gaps+and+albumin+leakage+in+the+rat+mesentery.">Modified hemoglobins produce venular interendothelial gaps and albumin leakage in the rat mesentery.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 277, H650-H659 (1999).</li><li>Cabrales, P., Zanini, G. M., Meays, D., Frangos, J. A., Carvalho, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+cerebral+malaria+is+associated+with+a+vasospasm-like+microcirculatory+dysfunction,+and+survival+upon+rescue+treatment+is+markedly+increased+by+nimodipine.">Murine cerebral malaria is associated with a vasospasm-like microcirculatory dysfunction, and survival upon rescue treatment is markedly increased by nimodipine.</a> Am. J. Pathol. 176 (3), 1306-1315 (2010).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

الأسلوب المجهري intravital الموصوفة هنا يوفر أداة فريدة وقوية لرصد تفصيلي للدوران الأوعية الدقيقة حنوني في الماوس. أنها تسمح استفراد فرد الشرايين والأوردة وقياس التغيرات في عدد من المعلمات مثل أقطار السفينة ، RBC السرعات ، وتدفق الدم ، والالتزام والمتداول من الكريات البيضاء والصفائح الدموية في الدم والعناصر الأخرى ، وتسرب الأوعية الدموية ، ودرجة الحموضة والأنسجة والعديد من المحتمل PO2 أخرى التطبيقات. يمكن أن تكون استجابة الأوعية الدموية فيفو تقييم فور التدخلات مثل إدارة مكافحة المخدرات ، أو أثناء عمليات المرضية. وعلاوة على ذلك ، يمكن اتباع سلوك microcirculatory ديناميكيا مع مرور الوقت. وقد استخدمنا هذه التقنية لدراسة التغيرات microcirculatory حنوني خلال الملاريا الدماغية التي تسببها P. وقد أظهرت berghei أنكا في الماوس ، وأنه يرتبط متلازمة عصبية في هذا النموذج مع اختلال وظيفي يتميز microcirculatory انخفاض تدفق الدم الدماغي ، وتضيق الأوعية ، نضح ضعف وانهيار الأوعية الدموية في النهاية 6.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Isoflurane</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Baxter</td>
<td>FDG9623</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Carbocyanine dye Dil </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Probes</td>
<td>D306</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Albumin-FITC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>A9771</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anti-CD45-TxR Ab</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>MCD4517</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>P. berghei ANKA-GFP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MR4</td>
<td>MRA-865</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

intravital microscopy of the mouse brain microcirculation using a closed cranial window

وقد صمم هذا النموذج التجريبي لتقييم دوران الأوعية الدقيقة الماوس حنوني خلال الدورة الدموية ، الحادة والمزمنة والفسيولوجية والمرضية في جسم المريض ، وظروف التهابات والأيض ، وذلك باستخدام المجهر مضان في الجسم الحي. وضعت نافذة مغلقة في الجمجمة خلال القشرة الجداري القذالي الأيسر من الفئران. يتم تسجيل دوران الأوعية الدقيقة المحلية في الوقت الحقيقي من خلال النافذة باستخدام برنامج التحصين الموسع وإنارة مضان ، وقياسات للأقطار السفن وخلايا الدم الحمراء (RBC) يتم تنفيذ سرعات. ويتم قياس سرعة RBC في الوقت الحقيقي باستخدام عبر ارتباط و / أو كرات الدم الحمراء التي تحمل علامات الفلورسنت. تصنع الكريات البيضاء والصفائح الدموية الانضمام للسفن حنوني وتقييم نضح وتسرب الأوعية الدموية مع مساعدة من علامات مضان المسمى مثل الأجسام المضادة الزلال ، ومعاداة FITC TxR CD45. يمكن أن يكون دوران الأوعية الدقيقة مرارا الفيديو المسجلة على مدى عدة أيام. استخدمنا لأول مرة في الدماغ نافذة المجهري intravital قريبة من دراسة دوران الأوعية الدقيقة حنوني لمتابعة التغيرات الدينامية خلال عدوى المتصورة أنكا berghei في الفئران وتبين أن يرتبط التعبير عن CM مع الاختلالات microcirculatory يتميز تضيق الأوعية ، وانخفاض عميقة في الدم تدفق الأوعية الدموية ، والانهيار في نهاية المطاف.

Watch this Scientific Journal Video about Intravital Microscopy of the Mouse Brain Microcirculation using a Closed Cranial Window at JoVE.com

Intravital Microscopy of the Mouse Brain Microcirculation using a Closed Cranial Window

Intravital المجهري لمتابعة الأحداث الزمانية والمكانية الدورة الدموية والتهابات في دوران الأوعية الدقيقة حنوني.

Intravital المجهري للماوس دوران الأوعية الدقيقة الدماغ باستخدام نافذة مغلقة القحف

This experimental model was designed to assess the mouse pial microcirculation during acute and chronic, physiological and pathophysiological hemodynamic, ...

intravital-microscopy-mouse-brain-microcirculation-using-closed

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

17.3K Views.  University of California, San Diego. Intravital المجهري لمتابعة الأحداث الزمانية والمكانية الدورة الدموية والتهابات في دوران الأوعية الدقيقة حنوني.

Video: Intravital Microscopy of the Mouse Brain Microcirculation using a Closed Cranial Window

Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments (dendrite, dendritic spine, axon, axon terminal, perikaryon), as well as their intracellular organelles and cytoskeleton, in the central nervous system at high spatial resolution. Combined with TEM, pre-embedding immunocytochemistry allows the discrimination of cellular elements with few distinctive features and identification criteria (e.g., microglial perikarya and processes, when using an antibody against the microglia-specific marker Iba1 (ionized calcium binding adaptor molecule 1; as presented here)), identifying the neurotransmitter contents of cellular elements (e.g., serotonergic) and their ultrastructural localization of soluble or membrane-bound proteins (e.g., 5 HT1A and EphA4 receptors). Here, we describe a protocol for transcardiac perfusion of mice with acrolein fixative, removal and sectioning of the brain, as well as immunoperoxidase-diaminobenzidine (DAB) staining, resin embedding, and ultrathin sectioning of the brain sections. Upon completion of these procedures, the immunostained material is ready for examination with TEM. When rigorously performed, this technique provides an excellent compromise between optimal ultrastructural preservation and immunocytochemical detection.

We describe a protocol for transcardiac perfusion of mice, removal and sectioning of the brain, as well as immunoperoxidase staining, resin embedding, and ultrathin sectioning of the brain sections. Upon completion of these procedures, the immunostained material is ready for examination with transmission electron microscopy.

إعداد أنسجة المخ فأرة للالميكروسكوب Immunoelectron

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments ...

A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse Brain

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form a polished and reinforced thinned skull (PoRTS) window in the mouse skull that spans several millimeters in diameter and is stable for months. The skull is thinned to 10 to 15 &mu;m in thickness with a hand held drill to achieve optical clarity, and is then overlaid with cyanoacrylate glue and a cover glass to: 1) provide rigidity, 2) inhibit bone regrowth and 3) reduce light scattering from irregularities on the bone surface. Since the skull is not breached, any inflammation that could affect the process being studied is greatly reduced. Imaging depths of up to 250 &mu;m below the cortical surface can be achieved using two-photon laser scanning microscopy. This window is well suited to study cerebral blood flow and cellular function in both anesthetized and awake preparations. It further offers the opportunity to manipulate cell activity using optogenetics or to disrupt blood flow in targeted vessels by irradiation of circulating photosensitizers.

We present a method to form an imaging window in the mouse skull that spans millimeters and is stable for months without inflammation of the brain. This method is well suited for longitudinal studies of blood flow, cellular dynamics, and cell/vascular structure using two-photon microscopy.

مصقول وعززت ضعيفة، جمجمة نافذة على المدى الطويل التصوير من مخ الفأر

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form ...

Multiphoton Microscopy of Cleared Mouse Brain Expressing YFP

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the organ before imaging.1,2 However, for organs that contain fluorescent proteins such as GFP and YFP, optical clearing protocols that use methanol dehydration and clear using benzyl alcohol:benzyl benzoate (BABB) while unprotected from light3 do not preserve the fluorescent signal. The protocol presented here is a novel way in which to perform whole organ optical clearing on mouse brain while preserving the fluorescence signal of YFP expressed in neurons. Altering the optical clearing protocol such that the organ is dehydrated using an ethanol graded series has been found to reduce the damage to the fluorescent proteins and preserve their fluorescent signal for multiphoton imaging.4 Using an optimized method of optical clearing with ethanol-based dehydration and clearing by BABB while shielded from light, we show high-resolution multiphoton images of yellow fluorescent protein (YFP) expression in the neurons of a mouse brain more than 2 mm beneath the tissue surface.

Multiphoton microscopy of whole mouse organs is possible by optically clearing the organ before imaging, but not all protocols preserve the fluorescent signal of fluorescent proteins. Using an optical clearing method with ethanol-based dehydration and benzyl alcohol:benzyl benzoate clearing, we show high-resolution multiphoton images of whole mouse brain expressing YFP.

Multiphoton المجهر من مخ الفأر مسح تعرب عن YFP

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the ...

Extinction Training During the Reconsolidation Window Prevents Recovery of Fear

Fear is maladaptive when it persists long after circumstances have become safe. It is therefore crucial to develop an approach that persistently prevents the return of fear. Pavlovian fear-conditioning paradigms are commonly employed to create a controlled, novel fear association in the laboratory. After pairing an innocuous stimulus (conditioned stimulus, CS) with an aversive outcome (unconditioned stimulus, US) we can elicit a fear response (conditioned response, or CR) by presenting just the stimulus alone1,2 . Once fear is acquired, it can be diminished using extinction training, whereby the conditioned stimulus is repeatedly presented without the aversive outcome until fear is no longer expressed3. This inhibitory learning creates a new, safe representation for the CS, which competes for expression with the original fear memory4. Although extinction is effective at inhibiting fear, it is not permanent. Fear can spontaneously recover with the passage of time. Exposure to stress or returning to the context of initial learning can also cause fear to resurface3,4.
Our protocol addresses the transient nature of extinction by targeting the reconsolidation window to modify emotional memory in a more permanent manner. Ample evidence suggests that reactivating a consolidated memory returns it to a labile state, during which the memory is again susceptible to interference5-9. This window of opportunity appears to open shortly after reactivation and close approximately 6hrs later5,11,16, although this may vary depending on the strength and age of the memory15. By allowing new information to incorporate into the original memory trace, this memory may be updated as it reconsolidates10,11. Studies involving non-human animals have successfully blocked the expression of fear memory by introducing pharmacological manipulations within the reconsolidation window, however, most agents used are either toxic to humans or show equivocal effects when used in human studies12-14. Our protocol addresses these challenges by offering an effective, yet non-invasive, behavioral manipulation that is safe for humans.
By prompting fear memory retrieval prior to extinction, we essentially trigger the reconsolidation process, allowing new safety information (i.e., extinction) to be incorporated while the fear memory is still susceptible to interference. A recent study employing this behavioral manipulation in rats has successfully blocked fear memory using these temporal parameters11. Additional studies in humans have demonstrated that introducing new information after the retrieval of previously consolidated motor16, episodic17, or declarative18 memories leads to interference with the original memory trace14. We outline below a novel protocol used to block fear recovery in humans.

Conditioned fear can be diminished through an inhibitory process called extinction, but can resurface under conditions such as the passage of time or exposure to stress. Our protocol presents a novel way of preventing fear recovery by introducing extinction during the reconsolidation window (the re-storage phase of a reactivated memory).

التدريب الانقراض خلال فترة الانتقالات إعادة الوحدة يمنع استرداد الخوف

Fear is maladaptive when it persists long after circumstances have become safe. It is therefore crucial to develop an approach that persistently prevents ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

التلاعب الجيني للمخيخي الحبيبة الخلايا العصبية<em&gt; في المختبر</em&gt; و<em&gt; في فيفو</em&gt; لدراسة مورفولوجيا الخلايا العصبية والهجرة

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

النظام الشمي كنموذج لدراسة أنماط نمو محور عصبي ومورفولوجيا<em&gt; في فيفو</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Closed-loop Neuro-robotic Experiments to Test Computational Properties of Neuronal Networks

Information coding in the Central Nervous System (CNS) remains unexplored. There is mounting evidence that, even at a very low level, the representation of a given stimulus might be dependent on context and history. If this is actually the case, bi-directional interactions between the brain (or if need be a reduced model of it) and sensory-motor system can shed a light on how encoding and decoding of information is performed. Here an experimental system is introduced and described in which the activity of a neuronal element (i.e., a network of neurons extracted from embryonic mammalian hippocampi) is given context and used to control the movement of an artificial agent, while environmental information is fed back to the culture as a sequence of electrical stimuli. This architecture allows a quick selection of diverse encoding, decoding, and learning algorithms to test different hypotheses on the computational properties of neuronal networks.

In this paper, an experimental framework to perform closed-loop experiments is presented, in which information processing (i.e., coding and decoding) and learning of neuronal assemblies are studied during the continuous interaction with a robotic body.

حلقة مغلقة العصبية الروبوتية تجارب لاختبار خصائص الحاسوبية من الشبكات العصبية

Information coding in the Central Nervous System (CNS) remains unexplored. There is mounting evidence that, even at a very low level, the representation ...

A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila

Traumatic brain injury (TBI) affects millions of people each year, causing impairment of physical, cognitive, and behavioral functions and death. Studies using Drosophila have contributed important breakthroughs in understanding neurological processes. Thus, with the goal of understanding the cellular and molecular basis of TBI pathologies in humans, we developed the High Impact Trauma (HIT) device to inflict closed head TBI in flies. Flies subjected to the HIT device display phenotypes consistent with human TBI such as temporary incapacitation and progressive neurodegeneration. The HIT device uses a spring-based mechanism to propel flies against the wall of a vial, causing mechanical damage to the fly brain. The device is inexpensive and easy to construct, its operation is simple and rapid, and it produces reproducible results. Consequently, the HIT device can be combined with existing experimental tools and techniques for flies to address fundamental questions about TBI that can lead to the development of diagnostics and treatments for TBI. In particular, the HIT device can be used to perform large-scale genetic screens to understand the genetic basis of TBI pathologies.

A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila

Here we describe a method to inflict closed head traumatic brain injury (TBI) in Drosophila. This method provides a gateway to investigate the cellular and molecular mechanisms that underlie TBI pathologies using the vast array of experimental tools and techniques available for flies.

طريقة لإلحاق رئيس مقفلة إصابات الدماغ في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em

Traumatic brain injury (TBI) affects millions of people each year, causing impairment of physical, cognitive, and behavioral functions and death. Studies ...

Piezo High Accuracy Surgical Osteal Removal (PHASOR): A Technique for Improved Cranial Window Surgery in Mice

Multiphoton microscopy has been widely adapted for imaging neurons in vivo. Repeated imaging requires implantation of a cranial window or repeated thinning of the skull. Cranial window surgery is typically performed with a high speed rotary drill, and many investigators find it challenging to prevent the drill from damaging the delicate dura and blood vessels. Extensive training and practice is required to remove the bone without damage to underlying tissue and thus cranial window surgery can be difficult, time consuming, and produce tissue damage. Piezoelectric surgery, which is extensively used for maxillofacial and dental surgery, utilizes ultrasonic vibrations to remove bone without damaging soft tissues. We have developed a method applying piezoelectric surgery to improve cranial window surgery in mice in preparation for multiphoton imaging. Comparisons within our lab find that the method requires less surgery time and has a lower average rate of complications due to dural bleeding than cranial window surgery with a rotary drill.

Piezo High Accuracy Surgical Osteal Removal PHASOR: A Technique for Improved Cranial Window Surgery in Mice

Piezoelectric surgery has led to improvements in human maxillofacial and dental surgery. We have developed a protocol to optimize piezoelectric surgery for cranial window surgery in mice.

بيزو عالية الدقة العظام الاستئصال الجراحي (مطوار): تقنية لتحسين الإطار الجمجمة جراحة في الفئران

Multiphoton microscopy has been widely adapted for imaging neurons in vivo. Repeated imaging requires implantation of a cranial window or repeated ...

Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated digital vaporizer is utilized to achieve a stable plane of anesthesia at a low-flow rate of isoflurane. A single vertebral spine is removed, and a commercially available cover-glass is overlaid on a thin agarose bed. A 3D-printed plastic backplate is then affixed to the adjacent vertebral spines using tissue adhesive and dental cement. A stabilization platform is used to reduce motion artifact from respiration and heartbeat. This rapid and clamp-free method is well-suited for acute multi-photon fluorescence microscopy. Representative data are included for an application of this technique to two-photon microscopy of the spinal cord vasculature in transgenic mice expressing eGFP:Claudin-5 &#8212; a tight junction protein.

This protocol describes implantation of a glass window onto the spinal cord of a mouse to facilitate visualization by intravital microscopy.

استئصال الصفيحة الفقرية وغرس نافذه الحبل الشوكي في الماوس

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated ...