المؤلفان بالشكر جانيت Rossant للبروتوكول الأصلي. وأيد هذه الدراسة من قبل المعهد الوطني للصحة منح CA106308 إلى WH.

في هذا البروتوكول ، ونحن تصف إعداد blastocysts الماوس وإنشاء خطوط الخلايا TS. التلاعب الماوس قبل عام لجمع blastocysts ، بما في ذلك إعداد لالتزاوج الطبيعي وتحريض الاباضة عظمى ، اتبع أساسا بروتوكول قياسي يتضح من ناجي وآخرون 2003 (pp146 - 150). الاشتقاق وصيانة خلايا TS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الإعداد عبر تكاثر الفئران بين المصالح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير الخلايا الليفية الماوس الجنينية (MEFs) والخلايا المغذية. قبل يومين من جمع blastocysts ، MEFs (2 × 10 6 خلايا) في 100 ومطلي الأطباق ملم. اليوم التالي ، ويتم التعامل مع هذه الخلايا مع 10 مل من المتوسط ​​TS تحتوي mitomycin C (20 ملغ / مل) للحصول على حضانة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO 2. ويتبع ذلك عن طريق غسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني. هي المصنفة C ثم mitomycin الخلايا المعالجة في 12 - جيدا لوحات (1 × 10 5 خلية / جيد). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يوم جمع الكيسة (3.5 DPC ، ويشار إلى يوم واحد) ، يتم استبدال MEF مستنبت بواسطة المتوسطة TS زائد 1X FGF4/Heparin (0.5 مل / جيد). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التحضير لجمع الرحم : الموت ببطء الماوس وحدد موقع الرحم (الشكل 1A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الرحم بواسطة ملقط مع الامساك بها في عنق الرحم (تقع خلف المثانة) وخفض عبر تقاطع الرحم وعنق الرحم (1B الشكل). سحب الرحم ، وتقليم الغشاء والأنسجة الدهنية بعيدا وقطع الرحم دون تقاطع مع قناة البيض (الشكل 1C). وضع الرحم (1D الشكل) في حجم صغير (0.2 مل) من المتوسط ​​TS في لوحة 60 ملم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مطاردة كل قرن الرحم مع 1 مل من المتوسط ​​TS باستخدام حقنة 1 مل مع إبرة قياس 26. ادخال الإبرة في قاعدة الرحم وتدفق ببطء في لوحة جديدة عيار 60 ملم مع 1 مل TS المتوسطة. وينبغي أن يكون مبالغا الرحم ومددت بالكامل خلال التنظيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع ونقل blastocysts بعناية في 12 لوحة تحتوي على تنظيف جيد TS المتوسطة باستخدام ماصة الفم التي تسيطر عليها. غسل blastocysts ثلاث مرات عن طريق التحويل من خلال المسلسل المتوسطة في 12 - TS جيدا لوحات. الكيسة مكان واحد لكل بئر (الشكل 2A) في صفيحة ال 12 كذلك يحتوي على mitomycin C - تعامل مغذيات MEF والثقافة في 37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سوف blastocysts يفقس من زونا الشفافة ونعلق على الآبار في 24 إلى 36 ساعة. سيكون ثمرة صغيرة وحظ بسهولة في اليوم 3. تغذية الثقافات مع 500 ميكرولتر المتوسطة TS الطازجة بالإضافة إلى FGF4/Heparin 1X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في يوم 4 أو 5 ، ينبغي أن ثمرة الكيسة يكون جاهزا للتصنيف تبعا لحجمها. ويتضح حجم مثالي للخلية تصنيفها TS 3B في الشكل. يغسل مرة واحدة مع الثقافات PBS مل 0.5. إضافة 100 مل 0.25 ٪ التربسين / EDTA واحتضان لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO 2. كسر ثمرة الى كتل صغيرة pipetting صعودا وهبوطا بقوة مع pipetteman P100. وقف trypsinization بإضافة TS - 70CM - 1.5F4H (TS المتوسطة 30 ٪ ، 70 ٪ زائد MEF - CM FGF4/Heparin 1.5x) في البئر. تغيير المتوسط ​​8 ساعات بعد تصنيفها والاستمرار في تغذية الخلايا كل يوم 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكن بين 6 و 10 يوما (متغير جدا) يمكن الملاحظة مستعمرات الخلايا TS. لديهم شقة ، ورقة الظهارية مثل التشكل مع حدود واضحة مستعمرة (الشكل 2C). تواصل الثقافات تغذية كل يوم 2 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما تصل الخلايا TS confluency 50 ٪ (عادة ما بين 15 يوما و 20) ، ويغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني وإضافة 100 مل 0.25 ٪ التربسين / EDTA. ماصة صعودا وهبوطا خلال trypsinization لضمان قرب وحيدة الخلية تعليق. وقف trypsinization بإضافة TS - 70CM - 1.5F4H ونقلها إلى لوحات جديدة 6 - 60mm جيدا أو التي تحتوي على mitomycin C - تعامل مغذيات MEF (2.5 × 10 5 أو 5 cells/6-well X10 وحة cells/60mm 5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغيير المتوسطة بعد مرور 8 ساعات ويستمر لإطعام كل الثقافات 2 يوما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد واحد أو اثنين من أكثر الممرات (3-5 يوما بين الممرات) على مغذيات MEF ، قد تكون الخلايا المستزرعة TS بدونها. لأن MEFs نعلق على لوحة الثقافة أسرع بكثير من الخلايا TS trypsinization بعد ، يمكن أن تستخدم مثل هذه الفرق في معدل ملتصق لفصل الخلايا TS من مغذيات MEF. بعد مرور الخلايا المستزرعة ، احتضان لهم في 37 ° C CO ، 5 2 ٪ لمدة 30 دقيقة. ومعظم MEFs نعلق على لوحة والسكان TS يبقى في التعليق. طاف لنقل لوحة جديدة. كرر هذه العملية عدة مقاطع للحصول على السكان TS النقي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على خلايا في TS - TS - 70CM 1.5F4H وتمرير لهم كل يوم 4 (1:10 حتي 1:20 انقسام) أو عندما يصل إلى ثقافة confluency 70 ٪. تمر الخلايا مع كثافة عالية (أعلى من الانقسام 1:5) أو زرع لهم عندما متموجة بشكل مفرط قد يؤدي التمايز بهم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن التأكد من هوية الخلايا التي TS immunostaining من علامة الخلية ، Cdx2 (الشكل 3). </li></ol> تجميد الخلايا TS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 2X تجميد المتوسطة (50 ٪ FBS ، 30 ٪ والمتوسطة TS DMSO 20 ٪). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شاركالخلايا التي TS llect trypsinization ، تليها الطرد المركزي في 450g لمدة 6 دقائق. Resuspend منهم في المتوسط ​​على قدم المساواة مع حجم TS المتوسطة تجميد 2X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميد الخلايا باستخدام ببطء وغرفة ايزوبروبيل في -70 درجة مئوية ، ونقل إلى النيتروجين السائل بعد 24-48 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وعادة ما يتم الاحتفاظ صفيحة 60 ملم (70 ٪ متموجة) في 2 قنينة. </li></ol> ذوبان الخلايا TS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الجليد بسرعة القارورة في 37 درجة مئوية ، وجمعها في 10 مل الإعلام TS بواسطة الطرد المركزي (450g ، 6 دقائق) ، وبنسبة 30 ٪ في resuspend TS وسائل الإعلام ، 70CM - 1.5F4H. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غير المصنفة قنينة واحدة من الخلايا في لوحة 60 ملم. </li></ol> TS تمايز الخلايا في TGC يمكن أن يتسبب تمايز الخلايا إلى خلايا TS العملاقة الأرومة الغاذية (TGCs) من قبل انسحاب MEF - CM ، FGF4 والهيبارين. ويمكن الكشف عن النمط الظاهري TGC (نوى كبير) بعد اربعة ايام من الحث (تاناكا وآخرون ، 1998 وتشيو وآخرون 2008). Immunostaining p450scc من الكشف عن التعبير عن هذه العلامة TGC في ثقافة مختلفة (الشكل 4A). تحليل تدفق cytometric من PI (propidium يوديد) خلايا ملون يظهر كذلك وجود خلايا متمايزة تحتوي على أعلى محتوى الحمض النووي (الشكل 4B). هذه النتائج تشير الى ان خلايا TS تنسخ داخلي يخضع لتصبح TGCs المتعددة الصبغيات. ممثل النتائج <img src="/files/ftp_upload/1964/1964fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. تشريح الرحم الماوس. (A) هو مبين في الصورة من الرحم بواسطة الأسهم. (ب) قص عبر تقاطع الرحم وعنق الرحم كما هو مبين. (C) قطع الرحم أسفل قناة البيض (OD) تحت المبيض (OV). (D) صورة للرحم. <img src="/files/ftp_upload/1964/1964fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> صور الممثل الشكل 2. توضيح الكيسة الماوس ، وثمرة الكيسة مستعمرة الأرومة الغاذية. (A) ويرد الكيسة الماوس جمعها في E3.5. ICM ، كتلة الخلية الداخلية ؛ طن متري ، الأديم الظاهر الغاذي جدارية ؛ PT ، الأديم الظاهر الغاذي القطبية. (ب) ويرد على مغذيات ثمرة الأرومة الغاذية MEF. TS ، الأرومة الغاذية الخلايا الجذعية. (ج) والخلايا الجذعية مستعمرة الأرومة الغاذية يظهر واضحا على حافة مغذيات MEF. تشير الأسهم في حدود الخلية. <img src="/files/ftp_upload/1964/1964fig3.jpg" alt="الشكل 3" /> الشكل 3. تحديد الخلايا التي TS immunostaining التحليل. TS (AD) وفاق (السيطرة ، EH) الخلايا تخضع لتحديد علامة. وimmunostained الخلايا مع أجسام مضادة للاعتراف Oct4 (A ، E) أو Cdx2 (B ، F) ، وcounterstained بواسطة دابي (C ، G) عرضت في الصور المدمجة (D ، H). مقياس بار ، و 50 ميكرومتر. <img src="/files/ftp_upload/1964/1964fig4.jpg" alt="الشكل 4" /> الشكل 4. تمايز الخلايا في المختبر TS. counterstained p450scc (الأخضر) ، (A) ودرست غير متمايزة (Undiff) أو متمايزة (فرق) والخلايا في الثقافة للتعبير عن علامة TGC ، مع دابي (الحمراء). (ب) تحليل تدفق cytometric من الخلايا المتمايزة ، ملطخة PI والتدابير محتويات الحمض النووي (M1 ، 2-4 النسخ ؛ M2 ، أكثر من أربع نسخ). السكان M2 يمثل خلايا الأرومة الغاذية المتعددة الصبغيات.

<ol>
	<li>Chiu, S. Y., Asai, N., Costantini, F. &. a. m. p. ;. a. m. p., Hsu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO-specific+protease+2+is+essential+for+modulating+p53-Mdm2+in+development+of+trophoblast+stem+cell+niches+and+lineages.">SUMO-specific protease 2 is essential for modulating p53-Mdm2 in development of trophoblast stem cell niches and lineages.</a> PLoS Biol. 6, E310-E310 (2008).</li><li>Kunath, T., Arnaud, D., Uy, D. G., Okamoto, I., Chureau, C., Yamanaka, Y., Heard, E., Gardner, R. L., Avner, P., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imprinted+X-inactivation+in+extra-embryonic+endoderm+cell+lines+from+mouse+blastocysts.">Imprinted X-inactivation in extra-embryonic endoderm cell lines from mouse blastocysts.</a> Development. 132, 1649-1661 (2005).</li><li>Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the Mouse Embryo: The Laboratory Manual. , (2003).</li><li>Tanaka, S., Kunath, T., Hadjantonakis, A. K., Nagy, A., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promotion+of+trophoblast+stem+cell+proliferation+by+FGF4.">Promotion of trophoblast stem cell proliferation by FGF4.</a> Science. 282, 2072-2075 (1998).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

في هذا الفيديو ، ونحن لشرح عملية جمع E3.5 blastocysts من إجراءات الرحم والتجريبية لإنشاء خطوط الخلايا TS. كما وصفنا شرط للحفاظ على الخلايا stemness TS وللحث على التمايز إلى خلايا متمايزة. اثنين من الخطوات الحاسمة للحصول على خطوط خلايا نقي TS هي ثمرة توقيت التفكيك (الخطوة 9) ، وتجهيز مرور الأول (الخطوة 11). وقد أفيد بأن البدائية الأديم الباطن الخلايا المشتقة يمكن أن تنشأ في ثقافة واسعة بعد الكيسة تتفوق في الخطوة 9 أو فرط نمو المستعمرات TS (&gt; 50 ٪ confluency) في الخطوة 11 (Kunath وآخرون ، 2005). على الرغم من أن يمكن التعرف على الأديم الباطن البدائي المستمدة من الخلايا عن طريق التشكل المتميزة مع شكل خلية تقريب وانخفاض خلية الاتصال خلية بالمقارنة مع الخلايا TS ، فمن الصعب إزالتها من ثقافة لأنها تنمو بشكل جيد على المدى المتوسط ​​وليس TS ويبدو أن تتطلب مغذيات أو MEF FGF4. قد تنشأ باستمرار TGCs متباينة في الثقافة TS حتى في وجود MEF - CM وFGF4. إذا كان المطلوب من السكان TS نقية ، قد يكون فصل هذه الخلايا المتمايزة على أساس معدلات ملتصقة التفاضلية. مشابهة لMEFs ، TGCs نعلق على لوحات ثقافة أسرع من الخلايا TS ، وتوفير الاجراءات الممكنة للحصول على السكان TS نقية كما هو موضح في الخطوة 13. بدلا من ذلك ، لأن TGCs هي ملتصقة جدا وأكثر مقاومة للtrypsinization ، بلغ عدد السكان TS نقية ويمكن أيضا أن يحصل عليها trypisinization السريع (3 دقائق) ، تليها مجموعة من الخلايا TS مع وقف التنفيذ.

الكواشف TS المتوسط ​​: RPMI - 1640 ، FBS 20 ٪ ، 1 البيروفات الصوديوم مم ، 100 مم المركابتويثانول بيتا و 100 ملغ / مل الستربتوميسين البنسلين. Mitomycin C : حل 2 ملغ mitomycin C (سيغما M - 0503) في برنامج تلفزيوني 2 مل وإضافة هذا الخليط 2 مل الى 200 مل المتوسطة TS (10 نانوغرام / مل). جعل aliquots 20 (10 مل) ، ومخزن في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام. إضافة واحد في لوحة قسامة 100 ملم. الفأر الجنينية الليفية ، شرط المتوسطة (MEF - CM) : لوحة لوحات MEFs في 100 ملم (1 × 10 6 / لوحة). اليوم التالي ، وإضافة 10 مل TS المتوسطة في صحن والاستمرار في الثقافة لمدة 48 ساعة. جمع مستنبت تصفية منهم (0.45 ملم) وتخزينها في -20 درجة مئوية في aliquots مل 35. أذاب كل قسامة عند الحاجة التي يمكن تخزينها في 4 درجات مئوية. يمكن استخدام MEFs للتحضير لاثنين من أكثر دفعات من CM قبل أن تصبح متموجة. PBS / جيش صرب البوسنة : حل جيش صرب البوسنة ، والخامس الكسر (سيغما A3311 ، 0.1 ٪ (W / V)) في برنامج تلفزيوني (10 مل) ، وتصفيتها من خلال تصفية 0.45 ملم حقنة وجعل 1 aliquots مل في 1.5 مل من الأنابيب. المحل في -70 درجة مئوية ، وذوبان الجليد أنبوب واحد عند الحاجة لإعداد FGF4. FGF4 (1000x) : Resuspend مجفد FGF4 (سيغما F8424 ، 25 ملغ) مع 1 مل من محلول PBS / جيش صرب البوسنة. مزيج جيد وجعل 10 aliquots (100 مل) إلى 1.5 مل وتخزين أنابيب في -70 درجة مئوية. أذاب كل أنبوب عند الحاجة وتخزين المتبقي في 4 درجات مئوية ، لا إعادة التجميد. تمييع 1000 مرة في المتوسط ​​في الحصول على TS 1X FGF4 (25 نانوغرام / مل). الهيبارين (1000x) : Resuspend الهيبارين (سيغما H3149 ، 10000 وحدة) في برنامج تلفزيوني لتركيز النهائي من 1 ملغ / مل (1000x). 100 مل جعل aliquots إلى 1.5 مل وتخزين أنابيب في -70 درجة مئوية. aliquots ذوبان الجليد عند الحاجة وتخزين المتبقي في 4 درجات مئوية ، لا إعادة التجميد. الوقت في تمييع 1000 TS المتوسطة للحصول على 1X الهيبارين (1 نانوغرام / مل).

derivation of mouse trophoblast stem cells from blastocysts

مواصفات الأديم الظاهر الغاذي هي واحدة من أقرب الأحداث تمايز التنمية الثدييات. نسب الأرومة الغاذية المستمدة من الأديم الظاهر الغاذي يتوسط الزرع ويولد الجنين جزء من المشيمة. نتيجة لذلك ، تطور هذه النسب ضرورية لبقاء الجنين. وكان أول وصف اشتقاق خلايا الأرومة الغاذية (TS) تنبع من blastocysts الماوس بواسطة تاناكا<em&gt; وآخرون.</em&gt; 1998. قدرة الخلايا TS للحفاظ على الممتلكات الخاصة والأرومة الغاذية التعبير عنها نوع من علامات محددة ومرحلة الخلية بعد التحفيز السليم يوفر نظام نموذجا قيما للتحقيق في الأرومة الغاذية التنمية النسب حيث تلخص أحداث المشيمة المبكر. وعلاوة على ذلك ، وخلايا الأرومة الغاذية هي واحدة من الأنواع القليلة الخلايا الجسدية الطبيعية التي تمر التضخيم الجينوم. على الرغم من أن المسارات الجزيئية الكامنة وراء polyploidization الأرومة الغاذية قد بدأت في الانهيار ، ودور الفسيولوجية والاستفادة من التضخيم الجينوم الأرومة الغاذية لا يزال بعيد المنال الى حد كبير. تطوير الخلايا الجذعية إلى خلايا الأرومة الغاذية ضعفاني المتعددة الصبغيات في الثقافة يجعل هذا<em&gt; خارج الحي</em&gt; النظام أداة ممتازة لتوضيح آلية تنظيمية من النسخ المتماثل الجينوم وعدم الاستقرار في الصحة والمرض. نحن هنا وصف بروتوكول استنادا إلى التقارير السابقة مع تعديل نشرت في تشيو<em&gt; وآخرون.</em&gt; 2008.

Watch this Scientific Journal Video about Derivation of Mouse Trophoblast Stem Cells from Blastocysts at JoVE.com

Derivation of Mouse Trophoblast Stem Cells from Blastocysts

في هذا الفيديو ، ونظهر عزلة blastocysts الماوس واشتقاق الخلايا الجذعية من الأرومة الغاذية blastocysts. وصفنا أيضا الظروف الملائمة لصيانة الممتلكات الخلايا الجذعية ، وكذلك الحث التمايز في الثقافة.

اشتقاق الخلايا الجذعية من الأرومة الغاذية Blastocysts

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the ...

derivation-of-mouse-trophoblast-stem-cells-from-blastocysts

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

18.1K Views.  University of Rochester. في هذا الفيديو ، ونظهر عزلة blastocysts الماوس واشتقاق الخلايا الجذعية من الأرومة الغاذية blastocysts. وصفنا أيضا الظروف الملائمة لصيانة الممتلكات الخلايا الجذعية ، وكذلك الحث التمايز في الثقافة.

Video: Derivation of Mouse Trophoblast Stem Cells from Blastocysts

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are derived from the blastocyst of the early embryo and are pluripotent in differentiative ability.  Their vast differentiative potential has made them the focus of much research centered on deducing how to coax them to generate clinically useful cell types.  The successful derivation of hematopoietic stem cells (HSC) from mouse ESC has recently been accomplished and can be visualized in this video protocol.  HSC, arguably the most clinically exploited cell population, are used to treat a myriad of hematopoietic malignancies and disorders.  However, many patients that might benefit from HSC therapy lack access to suitable donors.  ESC could provide an alternative source of HSC for these patients.  The following protocol establishes a baseline from which ESC-HSC can be studied and inform efforts to isolate HSC from human ESC.  In this protocol, ESC are differentiated as embryoid bodies (EBs) for 6 days in commercially available serum pre-screened for optimal hematopoietic differentiation.  EBs are then dissociated and infected with retroviral HoxB4.  Infected EB-derived cells are plated on OP9 stroma, a bone marrow stromal cell line derived from the calvaria of  M-CSF-/- mice, and co-cultured in the presence of hematopoiesis promoting cytokines for ten days.  During this co-culture, the infected cells expand greatly, resulting in the generation a heterogeneous pool of 100s of millions of cells.  These cells can then be used to rescue and reconstitute lethally irradiated mice.

This protocol details the derivation of transplantable hematopoietic stem cells from mouse embryonic stem cells (ESC) and their subsequent injection into lethally irradiated recipient mice. Briefly, ESC are differentiated as embryoid bodies, which are then infected with retroviral HoxB4 and co-cultured with OP9 stromal cells and hematopoietic cytokines.

اشتقاق خلايا الجذعية المكونة للدم من الفئران خلايا الجذعية الجنينية

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass. 


The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass.

اشتقاق الخلايا الجذعية الجنينية البشرية التي Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

العزلة واشتقاق خلايا الفأر الجنينية بيرشوت

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of non-pigmented inner and pigmented outer cell layers, and the clonal RSC colonies that arise from a single pigmented cell from the CE are made up of both pigmented and non-pigmented cells which can be differentiated to form all the cell types of the neural retina and the RPE. There is some controversy about whether all the cells within the spheres all contain at least some pigment4; however the cells are still capable of forming the different cell types found within the neural retina1-3. In some species, such as amphibians and fish, their eyes are capable of regeneration after injury5, however; the mammalian eye shows no such regenerative properties. We seek to identify the stem cell in vivo and to understand the mechanisms that keep the mammalian retinal stem cells quiescent6-8, even after injury as well as using them as a potential source of cells to help repair physical or genetic models of eye injury through transplantation9-12. Here we describe how to isolate the ciliary epithelial cells from the mouse eye and grow them in culture in order to form the clonal retinal stem cell spheres. Since there are no known markers of the stem cell in vivo, these spheres are the only known way to prospectively identify the stem cell population within the ciliary epithelium of the eye.

In this video, we will demonstrate how to isolate retinal stem cells from the ciliary epithelium of the mouse eye and grow them in culture to form clonal retinal spheres. The spheres that are isolated possess the cardinal properties of stem cells: self-renewal and multipotentiality.

عزل الخلايا الجذعية من شبكية العين بالعين ماوس

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of saliva into the oral cavity. Serous and mucous acinar cells are the protein and mucous producing factories of the gland respectively, and represent the origin of saliva production. Once synthesised, the various enzymatic and other proteinaceous components of saliva are secreted through a series of ductal cells bearing epithelial-type morphology, until the eventual expulsion of the saliva through one major duct into the cavity of the mouth. The composition of saliva is also modified by the ductal cells during this process.
In the manifestation of diseases such as Sj&ouml;gren's syndrome, and in some clinical situations such as radiotherapy treatment for head and neck cancers, saliva production by the glands is dramatically reduced 1,2. The resulting xerostomia, a subjective feeling of dry mouth, affects not only the ability of the patient to swallow and speak, but also encourages the development of dental caries and can be socially debilitating for the sufferer.
The restoration of saliva production in the above-mentioned clinical conditions therefore represents an unmet clinical need, and as such several studies have demonstrated the regenerative capacity of the salivary glands 3-5. Further to the isolation of stem cell-like populations of cells from various tissues within the mouse and human bodies 6-8, we have shown using the described method that stem cells isolated from mouse salivary glands can be used to rescue saliva production in irradiated salivary glands 9,10. This discovery paves the way for the development of stem cell-based therapies for the treatment of xerostomic conditions in humans, and also for the exploration of the salivary gland as a microenvironment containing cells with multipotent self-renewing capabilities.

An optimized protocol for the isolation of stem cells from the mouse salivary gland is described. The method employs enzymatic and mechanical digestion, and permits isolation of salispheres containing cells with characteristics of stem cells.

عزل الخلايا الجذعية ماوس اللعابية الغدة

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of ...

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes. 
Thus, defects in placental development have important consequences for the fetus and mother, and are a major cause of embryonic lethality. The major cell type of the 
fetal portion of the placenta is the trophoblast. Primary mouse placental trophoblast cells are a useful tool for studying normal and abnormal placental development, 
and unlike cell lines, may be isolated and used to study trophoblast at specific stages of pregnancy. In addition, primary cultures of trophoblast from transgenic
mice may be used to study the role of particular genes in placental cells. The protocol presented here is based on the description by Thordarson et al.1, in which a 
percoll gradient is used to obtain a relatively pure trophoblast cell population from isolated mouse placentas. It is similar to the more widely used methods for 
human trophoblast cell isolation2-3. Purity may be assessed by immunocytochemical staining of the isolated cells for cytokeratin 74. Here, the isolated cells are 
then analyzed using a matrigel invasion assay to assess trophoblast invasiveness in vitro5-6. The invaded cells are analyzed by immunocytochemistry and stained 
for counting.

In this protocol, we describe the dissection of placentae from the mouse on pregnancy d10.5, followed by isolation of trophoblast cells using a Percoll gradient. We then demonstrate use of the isolated cells in a matrigel invasion assay.

عزل خلايا الأرومة الغاذية الابتدائية ماوس والأرومة الغاذية الفحص الغزو

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes.  
Thus, defects ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based transplantation or by cardiac tissue engineering1-3. Cardiomyocytes become terminally-differentiated soon after birth and lose their ability to proliferate. There is no evidence that stem/progenitor cells derived from other sources, such as the bone marrow or the cord blood, are able to give rise to the contractile heart muscle cells following transplantation into the heart1-3. The need to regenerate or repair the damaged heart muscle has not been met by adult stem cell therapy, either endogenous or via cell delivery1-3. The genetically stable human embryonic stem cells (hESCs) have unlimited expansion ability and unrestricted plasticity, proffering a pluripotent reservoir for in vitro derivation of large supplies of human somatic cells that are restricted to the lineage in need of repair and regeneration4,5. Due to the prevalence of cardiovascular disease worldwide and acute shortage of donor organs, there is intense interest in developing hESC-based therapies as an alternative approach. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity6-8 (see a schematic in Fig. 1A). In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic9-11. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules12 (see a schematic in Fig. 1B). After screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered nicotinamide (NAM) sufficient to induce the specification of cardiomesoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to cardioblasts that generated human beating cardiomyocytes with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of cardioblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human cardiac cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of cardioblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human cardiac progenitors and functional cardiomyocytes for cardiovascular repair.

كفاءة اشتقاق السلائف القلب البشري وافرة القوة العضلية من خلايا المنشأ الجنينية البشرية التعريفي مع جزيء صغير

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

جيل من الفئران المستمدة من الخلايا الجذعية المحفزة المستحثة

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells (SSCs) in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines

Spermatogonial stem and progenitor cells (SSCs) of the testis represent a classic example of adult mammalian stem cells and preserve fertility for nearly the lifetime of the animal. While the precise mechanisms that govern self-renewal and differentiation in vivo are challenging to study, various systems have been developed previously to propagate murine SSCs in vitro using a combination of specialized culture media and feeder cells1-3.
Most in vitro forays into the biology of SSCs have derived cell lines from neonates, possibly due to the difficulty in obtaining adult cell lines4. However, the testis continues to mature up until ~5 weeks of age in most mouse strains. In the early post-natal period, dramatic changes occur in the architecture of the testis and in the biology of both somatic and spermatogenic cells, including alterations in expression levels of numerous stem cell-related genes. Therefore, neonatally-derived SSC lines may not fully recapitulate the biology of adult SSCs that persist after the adult testis has reached a steady state.
Several factors have hindered the production of adult SSC lines historically. First, the proportion of functional stem cells may decrease during adulthood, either due to intrinsic or extrinsic factors5,6. Furthermore, as with other adult stem cells, it has been difficult to enrich SSCs sufficiently from total adult testicular cells without using a combination of immunoselection or other sorting strategies7. Commonly employed strategies include the use of cryptorchid mice as a source of donor cells due to a higher ratio of stem cells to other cell types8. Based on the hypothesis that removal of somatic cells from the initial culture disrupts interactions with the stem cell niche that are essential for SSC survival, we previously developed methods to derive adult lines that do not require immunoselection or cryptorchid donors but rather employ serial enrichment of SSCs in culture, referred to hereafter as SESC2,3.
The method described below entails a simple procedure for deriving adult SSC lines by dissociating adult donor seminiferous tubules, followed by plating of cells on feeders comprised of a testicular stromal cell line (JK1)3. Through serial passaging, strongly adherent, contaminating non-germ cells are depleted from the culture with concomitant enrichment of SSCs. Cultures produced in this manner contain a mixture of spermatogonia at different stages of differentiation, which contain SSCs, based on long-term self renewal capability. The crux of the SESC method is that it enables SSCs to make the difficult transition from self-renewal in vivo to long-term self-renewal in vitro in a radically different microenvironment, produces long-term SSC lines, free of contaminating somatic cells, and thereby enables subsequent experimental manipulation of SSCs.

Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells SSCs in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines

A simple method to derive and maintain spermatogonial stem and progenitor cell lines from adult mice is presented here. The method utilizes feeder cells originating from the somatic cell compartment of the adult mouse testis. This technique is applicable to common mouse strains, including transgenic, knock-out, and knock-in mice.

مسلسل إثراء الجذعية والخلايا الاولية الظروف المناسبة (جان معايير الأمان) في الثقافة لاشتقاق على المدى الطويل الكبار ماوس خطوط SSC

Spermatogonial stem and progenitor cells (SSCs) of the testis represent a classic example of adult mammalian stem cells and preserve fertility for nearly ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

الاستقراء وتحليل الظهارية الوسيطة الانتقالية ل

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...