JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يقدم هذا البحث طريقة جديدة لتخليق الهلاميات المائية للمصفوفة خارج الخلية الغضروفية (DC-ECM). تتمتع الهلاميات المائية DC-ECM بتوافق حيوي ممتاز وتوفر بيئة دقيقة فائقة لنمو الخلايا. لذلك ، يمكن أن تكون سقالات خلوية مثالية وأنظمة توصيل بيولوجية.

Abstract

تعد الهلاميات المائية للمصفوفة الغضروفية خارج الخلية (DC-ECM) مواد حيوية واعدة لهندسة الأنسجة والطب التجديدي نظرا لتوافقها الحيوي وقدرتها على تقليد خصائص الأنسجة الطبيعية. يهدف هذا البروتوكول إلى إنتاج الهلاميات المائية DC-ECM التي تحاكي عن كثب ECM الأصلي لأنسجة الغضاريف. يتضمن البروتوكول مزيجا من الاضطراب الفيزيائي والكيميائي والهضم الأنزيمي لإزالة المواد الخلوية مع الحفاظ على بنية وتكوين ECM. يتم ربط DC-ECM باستخدام عامل كيميائي لتشكيل هيدروجيل مستقر ونشط بيولوجيا. يتميز هيدروجيل DC-ECM بنشاط بيولوجي ممتاز ، وهيكل مكاني ، ووظيفة تحريض بيولوجي ، فضلا عن انخفاض المناعة. هذه الخصائص مفيدة في تعزيز التصاق الخلايا وتكاثرها وتمايزها وهجرتها ولخلق بيئة دقيقة فائقة لنمو الخلايا. يوفر هذا البروتوكول موردا قيما للباحثين والأطباء في مجال هندسة الأنسجة. يمكن أن تعزز الهلاميات المائية المحاكية بيولوجيا تطوير استراتيجيات فعالة لهندسة الأنسجة لإصلاح الغضروف وتجديده.

Introduction

هندسة أنسجة الغضاريف هي مجال سريع التطور يسعى إلى تجديد أنسجة الغضاريف التالفة أو المريضة1. يتمثل أحد التحديات الرئيسية في هذا المجال في تطوير سقالات محاكاة حيوية يمكنها دعم نمو وتمايز الخلايا الغضروفية ، وهي الخلايا المسؤولة عن إنتاج الغضروف2. يلعب ECM لأنسجة الغضاريف دورا مهما في تنظيم سلوك الخلايا الغضروفية. DC-ECM هو سقالة فعالة لتطبيقات هندسة الأنسجة3.

تم تطوير عدد من التقنيات لإنتاج DC-ECM من أنسجة الغضاريف ، بما في ذلك الطرق الكيميائية والأنزيمية والفيزيائية. ومع ذلك ، غالبا ما تؤدي هذه الطرق إلى توليد الهلاميات المائية ECM التي لا تحاكي حيويا بشكل كاف ، مما يحد من إمكانية استخدامها في تطبيقات هندسة الأنسجة 4,5. وبالتالي ، هناك حاجة إلى طريقة أكثر فعالية لإنتاج الهلاميات المائية DC-ECM.

يعد تطوير هذه التقنية أمرا مهما لأنه يمكن أن يطور مجال هندسة الأنسجة من خلال توفير نهج جديد لإنشاء سقالات محاكاة حيوية يمكنها دعم تجديد الأنسجة وإصلاحها. علاوة على ذلك ، يمكن تكييف هذه التقنية بسهولة لإنتاج الهلاميات المائية ECM من الأنسجة الأخرى ، وبالتالي توسيع تطبيقاتها المحتملة.

في المجموعة الأوسع من الأدبيات ، كان هناك اهتمام متزايد باستخدام DC-ECM كسقالة لتطبيقات هندسة الأنسجة6. أظهرت العديد من الدراسات فعالية الهلاميات المائية DC-ECM في تعزيز نمو الخلايا والتمايز في الأنسجة المختلفة ، بما في ذلك الغضروف 7,8. لذلك ، فإن تطوير بروتوكول لإنتاج الهلاميات المائية DC-ECM التي تحاكي عن كثب ECM الطبيعي لأنسجة الغضاريف هو مساهمة كبيرة في هذا المجال.

يعالج البروتوكول المقدم في هذه الورقة هذه الحاجة من خلال توفير طريقة جديدة لإنتاج الهلاميات المائية DC-ECM التي تحاكي عن كثب ECM الطبيعي لأنسجة الغضاريف. يتضمن البروتوكول إزالة الخلايا من أنسجة الغضاريف ، وعزل ECM الناتج ، وإنشاء هيدروجيل عن طريق ربط ECM ببوليمر متوافق حيويا. أظهر الهيدروجيل الناتج نتائج واعدة في دعم نمو وتمايز الخلايا الغضروفية.

Protocol

تمت الموافقة على هذه الدراسة من قبل لجنة الأخلاقيات في مستشفى تونغده بمقاطعة تشجيانغ.

1. تحضير هيدروجيل DC-ECM

ملاحظة: في هذه الدراسة ، تم الحصول على الغضروف من مفاصل الركبة لخنازير باما المصغرة البالغة من العمر 12 شهرا ، وتجنب جمع الأنسجة العظمية.

  1. خذ الغضروف الذي تم جمعه ، وقم بحظره وتقطيعه إلى 1-2 مم3 قطع بمشرط.
  2. ضع 20 جم من الغضروف المفروم في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل ، وأضف 20 مل من المخزن المؤقت Tris-HCl منخفض التوتر (10 mM Tris-HCl ، درجة الحموضة 8.0) لغمر الأنسجة تماما. ضع أنبوب الطرد المركزي في فريزر -80 درجة مئوية لمدة 3 ساعات ثم في فرن 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعات. كرر خطوة التجميد والتسخين ست مرات. في هذه الخطوة ، لا يحتاج المخزن المؤقت Tris-HCl منخفض التوتر إلى استبدال.
  3. هز أنبوب الطرد المركزي لمدة 30 ثانية باستخدام خلاط دوامة بسرعة 1000 دورة في الدقيقة. ضع غربالا من الفولاذ المقاوم للصدأ (حجم المسام: ~ 250 ميكرومتر) على أنبوب طرد مركزي جديد سعة 50 مل.
  4. صب ببطء الغضروف منزوع الخلايا في غربال الفولاذ المقاوم للصدأ ، واغسل الأنسجة ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني معقم ، واجمع الغضروف.
  5. أضف 10 مل من محلول التربسين (0.25٪ تربسين في برنامج تلفزيوني) ، وضع الأنبوب على شاكر عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. خلال هذه الفترة ، استبدل التربسين كل 4 ساعات. قم بتصفية التعليق باستخدام غربال الفولاذ المقاوم للصدأ ، وحافظ على الأنسجة. يمكن علاج التربسين بين عشية وضحاها خلال إحدى عمليات الهضم ، وهذا لن يؤثر على عملية الهضم النهائية.
  6. اغسل الأنسجة التربسينية بمحلول مفرط التوتر (1.5 م كلوريد الصوديوم ، 50 مللي متر Tris-HCl ، درجة الحموضة 7.6).
  7. أضف 10 مل من محلول النيوكلياز (50 وحدة / مل ديوكسي ريبونوكلياز و 1 وحدة / مل ريبونوكلياز في 10 مللي مول Tris-HCl ، درجة الحموضة 7.5) ، وضع الأنبوب على شاكر عند 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات.
  8. قم بإزالة محلول النيوكلياز ، واغسل الغضروف ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني معقم ، وأضف محلول Tris-HCl منخفض التوتر. ضع أنبوب الطرد المركزي على شاكر ، واشطفه لمدة 20 ساعة في درجة حرارة الغرفة (RT).
  9. قم بإزالة محلول Tris-HCl منخفض التوتر ، واغسل الغضروف ثلاث مرات باستخدام PBS المعقم ، وأضف محلول Triton X-100 بنسبة 1٪ لغمر الأنسجة لمدة 24 ساعة.
  10. قم بإزالة محلول Triton X-100 ، وشطف الغضروف المنزوع الخلايا جيدا بالماء المقطر لمدة 3 أيام ، مع تغيير الماء المقطر كل 12 ساعة.
  11. نقع الغضروف في محلول حمض الخليك (0.1 ٪ PAA في 4 ٪ الإيثانول) لمدة 4 ساعات. قم بإزالة محلول حمض البيراسيتيك ، واغسل الغضروف ثلاث مرات بالماء المقطر المعقم.
  12. ضع غربال الفولاذ المقاوم للصدأ (حجم المسام: ~ 250 ميكرومتر) على أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل. صب ببطء الغضروف منزوع الخلايا في غربال الفولاذ المقاوم للصدأ ، وجمع الغضروف. اختبر درجة إزالة الخلايا والاحتفاظ بالمصفوفة للغضروف عن طريق تقدير محتوى الحمض النووي والكولاجين والجليكوزامينوجليكان (GAG).
  13. ضع الغضروف منزوع الخلايا في وعاء طحن ، وأضف النيتروجين السائل ، وطحن الغضروف منزوع الخلايا لتشكيل مسحوق. خذ 2 غرام من مسحوق الغضروف المنزوع الخلايا ، أضف 80 مل من 0.5 متر من حمض الخليك و 20 ملغ من البيبسين ، واهضمه لمدة 24 ساعة. أجهزة الطرد المركزي في 400 × غرام لمدة 10 دقائق ؛ تخلص من الرواسب واجمع محلول الطافية (محلول DC-ECM).
  14. صب 1 مل من محلول DC-ECM لكل بئر في ألواح 6 آبار. ضع الألواح المكونة من 6 آبار في مجفف بالتجميد. قم بتجميد محلول DC-ECM. بمجرد انخفاض درجة الحرارة في مجفف التجميد إلى -40 درجة مئوية ، قم بتشغيل مضخة التفريغ ، وحافظ على درجة الفراغ عند 10 باسكال لمدة 22 ساعة.
  15. أخرج محلول DC-ECM المجفف بالتجميد ، وضعه في أنابيب طرد مركزي ، واحفظه في درجة حرارة -20 درجة مئوية. يتجاوز الحد الأدنى لفترة تخزين محلول DC-ECM المجفف بالتجميد نصف عام.
  16. أضف 1 مل من الماء المقطر المعقم لإذابة 20 مجم من محلول DC-ECM المجفف بالتجميد في أنبوب الطرد المركزي. رج العبوة لمدة دقيقة واحدة باستخدام خلاط دوامة بسرعة 1000 دورة في الدقيقة عند RT. أضف 1 ملغ من فيتامين B2 (0.1٪ وزن / حجم) إلى محلول DC-ECM ، واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة ، وقم بالإشعاع بضوء الأشعة فوق البنفسجية (370 نانومتر ، 3.5 ميجاوات / سم2) لمدة 3 دقائق لتشكيل هيدروجيل (هيدروجيل DC-ECM).

2. الكشف عن الغضروف المنزوع الخلايا

  1. الكشف عن محتوى الحمض النووي للغضروف منزوع الخلايا
    ملاحظة: استخرج الحمض النووي باستخدام مجموعة DNEasy Blood and Tissue Kit.
    1. أولا ، خذ 20 ملغ من غضروف DC-ECM في أنبوب طرد مركزي. أضف 180 ميكرولتر من Buffer GTL و 20 ميكرولتر من Proteinase K عن طريق تذبذب الدوامة ، واحتضان الغضروف عند 56 درجة مئوية لمدة 4 ساعات حتى يذوب تماما.
    2. هز أنبوب الطرد المركزي لمدة 15 ثانية باستخدام خلاط دوامة بسرعة 1000 دورة في الدقيقة في RT. بعد ذلك ، أضف 200 ميكرولتر من Buffer GL والإيثانول اللامائي ، واخلطه جيدا عن طريق اهتزاز الدوامة. أجهزة الطرد المركزي العينات لمدة 1 دقيقة بسرعة 6000 × غرام عند 4 درجات مئوية.
    3. أضف 500 ميكرولتر من Buffer GW1 إلى عمود الامتزاز ، وقم بطرد العينات لمدة دقيقة واحدة بسرعة 12000 × جم عند 4 درجات مئوية. أضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت GW2 إلى عمود الامتزاز ، وأجهزة الطرد المركزي عند 20000 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 1 دقيقة. أخيرا ، أضف 50 ميكرولتر من الماء المعقم إلى عمود الامتزاز ، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة بسرعة 6000 × جم عند 4 درجات مئوية لجمع محلول الحمض النووي. تحديد محتوى الحمض النووي باستخدام مقياس الطيف الضوئي.
  2. الكشف عن محتوى الكولاجين في الغضروف منزوع الخلايا
    1. للكشف عن محتوى الكولاجين في الغضروف المنزوع الخلايا ، استخدم هيدروكسي برولين كعلامة للأحماض الأمينية للكولاجين. تحمض 5 ملغ من الغضروف منزوع الخلايا مع 5 مل من حمض الهيدروكلوريك 6 M عند 100 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة ، ثم تحييده ب 5 مل من محلول هيدروكسيد الصوديوم 6 M.
    2. احسب محتوى هيدروكسي برولين عن طريق قياس امتصاص العينة عند 570 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي. احصل على انحدار خطي لامتصاص التركيز باستخدام عينة هيدروكسي برولين القياسية.
  3. كشف محتوى GAG في الغضروف المنزوع الخلايا
    ملاحظة: تم الكشف عن محتوى GAG في غضروف DC-ECM باستخدام مجموعة الكشف الكمي اللوني GAG الأنسجة. جميع الكواشف أدناه متوفرة في المجموعة.
    1. خذ 200 ملغ من مسحوق الغضروف DC-ECM ، وأضف 500 ميكرولتر من الكاشف A عن طريق تذبذب الدوامة. احتضان العينة عند 4 درجات مئوية لمدة 16 ساعة ، ثم أجهزة الطرد المركزي عند 14000 × جم لمدة 10 دقائق.
    2. خذ 50 مل من محلول العينة ، وأضف 50 ميكرولتر من محلول عالي الملح (الكاشف B) و 50 ميكرولتر من محلول الحمض (الكاشف C) عن طريق تذبذب الدوامة. احتضان العينة لمدة 10 دقائق.
    3. أضف 750 ميكرولتر من محلول الصبغة (الكاشف D) عن طريق تذبذب الدوامة ، واحتضان العينة لمدة 30 دقيقة في الظروف المظلمة. قم بطرد العينة عند 14000 × جم لمدة 10 دقائق ، ثم تخلص من المادة الطافية.
    4. أضف 1 ميكرولتر من محلول التنظيف (الكاشف E) ، واخلطه جيدا. قم بطرد العينة عند 14000 × جم لمدة 10 دقائق ، وتخلص من المادة الطافية.
    5. أضف 1 ميكرولتر من محلول التفكك (الكاشف F) إلى العينة ، واخلطها جيدا. احتضان العينة لمدة 30 دقيقة في ظل ظروف مظلمة. أخيرا ، حدد محتوى GAG باستخدام مقياس الطيف الضوئي عند 600 نانومتر.
  4. تحليل المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) والمجهر الإلكتروني النافذ (TEM) للغضروف المنزوع الخلايا
    1. قارن بين الغضروف منزوع الخلايا وأنسجة الغضاريف الطبيعية. ضع العينة في محلول غلوتارالدهيد 2.5٪ ، واحتضنها عند 4 درجات مئوية طوال الليل ثم اغسلها باستخدام برنامج تلفزيوني ثلاث مرات.
    2. ثبت العينة في 1٪ OsO4 لمدة 1 ساعة ، ثم اغسلها ثلاث مرات باستخدام PBS.
    3. قم بتجفيف العينة عن طريق الغمر المتسلسل في 50٪ و 70٪ و 90٪ و 100٪ إيثانول ، بالإضافة إلى 100٪ أسيتون لمدة 15 دقيقة لكل منهما. ضع العينة في محلول مختلط من سداسي ميثيل ديسيلازان والإيثانول (1: 1) لمدة 15 دقيقة ، متبوعا بالغمر في سداسي ميثيل ديسيلازان النقي لمدة 15 دقيقة.
    4. ضع العينة في مجفف HCP-2 ، ثم جففها باستخدام النيتروجين السائل. بعد ذلك ، قم بتغطية العينة المجففة بالكامل بطبقة رقيقة من البلاديوم الذهبي باستخدام طلاء الرش ، والصورة باستخدام SEM. تم تنفيذ طلاء الرش بقوة 120 واط لمدة 5 دقائق. أجريت التجربة في ظل الظروف التالية: جهد عمل 15 كيلو فولت ، ودرجة فراغ أقل من 5 × 10−5 باسكال.
    5. لتحليل TEM ، ضع العينة في خليط من الأسيتون اللامائي والراتنج (1: 1) لمدة ساعة واحدة ، متبوعا بمزيج من الأسيتون اللامائي والراتنج (1: 3) لمدة 3 ساعات. ثم ضع العينة في الراتنج طوال الليل.
      1. ضع العينة في كبسولات مملوءة متوسطة ، وقم بتسخينها عند 70 درجة مئوية لمدة 9 ساعات.
      2. بعد التضمين ، قم بتقطيع العينة إلى شرائح رفيعة 70 نانومتر باستخدام ميكروتوم متناهي الصغر ، وضعها على شبكة نحاسية.
      3. ماصة 20 ميكرولتر من محلول تلطيخ أسيتات اليورانيل على الشبكة النحاسية ، وصمة عار لمدة 15 دقيقة في RT. قم بإزالة محلول التلوين عن طريق غسل الشبكة برفق مرتين بالماء المقطر.
      4. بعد ذلك ، قم بسحب 20 ميكرولتر من محلول تلطيخ سترات الرصاص على الشبكة النحاسية ، وصمة عار لمدة 15 دقيقة في RT. اغسل الشبكة ثلاث مرات بالماء المقطر.
      5. ضع الشبكة النحاسية على طبق بتري نظيف مبطن بورق الترشيح. بعد التجفيف بالهواء ، قم بتصوير الأقسام باستخدام TEM. تم تطبيق المسبار بقوة هابطة تبلغ 500 nN ، وتم مسحه ضوئيا بمعدل 1 هرتز ، وكان له ثابت مرن (قيمة k) يبلغ 40 Nm-1. تم قياس نصف قطر طرف المسبار ليكون 8 نانومتر.

النتائج

لإعداد هيدروجيل غضروفي DC-ECM أفضل ، قمنا بدراسة ومراجعة الأدبيات السابقة وقارنا بروتوكولات إزالة الخلايا المختلفة من حيث نسبة إزالة الخلايا ، والمناعة ، والوظائف الميكانيكية9.

على هذا الأساس ، قمنا بإعداد هيدروجيل الغضروف DC-ECM واستكشفنا تأثير مصفوفة استخراجية موجهة شعاعيا / حبر حيوي خارجي للخلايا الجذعية الوسيطة في علاج عيوب العظم الغضروفي. أظهرت النتائج أن هيدروجيل الغضروف DC-ECM لديه مناعة منخفضة ويمكن أن يعزز هجرة الخلايا ويعزز إصلاح الغضروف10.

في السنوات الأخيرة ، قمنا بتحسين إعداد غضروف DC-ECM. قمنا بإعداد الغضروف منزوع الخلايا باستخدام الخطوات التجريبية المذكورة أعلاه. أظهرت النتائج أن محتوى الحمض النووي قد تم التخلص منه في الغضروف منزوع الخلايا مقارنة بالمحتوى الموجود في الغضروف الأصلي (p < 0.001 ، الشكل 1 أ). أشار اختبار هيدروكسي برولين إلى أن محتوى الكولاجين كان مشابها بين الغضاريف الأصلية والغضاريف منزوعة الخلايا (p = 0.48 ، الشكل 1B). أظهر فحص DMMB أن الجليكوزامينوجليكان تم الاحتفاظ به جيدا في الغضروف منزوع الخلايا مقارنة بالغضروف الأصلي (p = 0.68 ، الشكل 1C). علاوة على ذلك ، تم استخدام SEM و TEM لمراقبة البنية التحتية ل DC-ECM (الشكل 1D).

لتحضير هيدروجيل DC-ECM ، تم إذابة محلول DC-ECM المجفف بالتجميد بتركيز نهائي قدره 2٪ بالوزن. علاوة على ذلك ، تم خلط محلول DC-ECM مع VB2 ، متبوعا بالربط المتقاطع الناجم عن UVA (370 نانومتر) (الشكل 2A). وضعنا حل DC-ECM وهيدروجيل DC-ECM في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة (الشكل 2B). عندما تم قلب الأنابيب ، لم يتدفق الهيدروجيل الموجود في الأنابيب إلى القاع ، وهو ما كان علامة على الهلام. كان وقت الهلام لمحلول DC-ECM القائم على التجميع الذاتي للكولاجين عند 37 درجة مئوية بدون عامل ربط متقاطع حوالي 15 دقيقة (الشكل 2C). تم اختبار اللزوجة والمعامل الديناميكي لمحلول DC-ECM والهيدروجيل. وجدنا أن لزوجة محلول هيدروجيل DC-ECM كانت أعلى من لزوجة محلول DC-ECM ، وارتبطت معدلات القص الأعلى بلزوجة محلول أقل (الشكل 2D). بالإضافة إلى ذلك ، كان معامل التخزين لكل من محلول DC-ECM وهيدروجيل أعلى بكثير من معامل الفقد ، مما يشير إلى أن كلاهما لهما خصائص هلام بدلا من سائل (الشكل 2E). والجدير بالذكر أنه بعد الربط المتقاطع والتجفيف بالتجميد ، انخفضت أحجام المسام لمحلول DC-ECM وهيدروجيل DC-ECM ، المقاس باستخدام SEM ، من 137.672 ميكرومتر إلى 37.936 ميكرومتر (p < 0.00195 ، الشكل 2F ، G).

figure-results-2718
الشكل 1: تحضير وتوصيف الغضروف منزوع الخلايا. تمت مقارنة الغضروف منزوع الخلايا مع الغضروف الأصلي. (أ-ج) القياس الكمي لمحتوى الحمض النووي والكولاجين والجليكوزامينوجليكان (GAG). n = 5 ، *** p < 0.001 (اختبار t للطالب). تم إجراء جميع التجارب ثلاث مرات على الأقل. (د) الهياكل المجهرية للغضروف الأصلي والغضروف منزوع الخلايا المصور ب SEM و TEM. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3474
الشكل 2: تحضير وتوصيف هيدروجيل DC-ECM. تحت الأشعة فوق البنفسجية ، تم ربط حل DC-ECM و VB2 عبر وشكل هيدروجيل DC-ECM. (أ) هياكل الجزيئات وتخليق هيدروجيل DC-ECM. تمت مقارنة المظهر والتوصيف والخواص الميكانيكية بين محلول DC-ECM وهيدروجيل DC-ECM. (ب) صور محلول DC-ECM وهيدروجيل DC-ECM في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة. (ج) زمن الهلام لهيدروجيل DC-ECM وهيدروجيل DC-ECM / VB2. n = 3 ، *** p < 0.001 (اختبار t للطالب). (د) اللزوجة و(ه) المعامل الدينامي لمحلول DC-ECM والهلام المائي DC-ECM. (F) الهياكل المجهرية لمحلول DC-ECM والهيدروجيل (التكبير المنخفض والعالي). قضبان المقياس = 100 ميكرومتر. (G) أحجام المسام لمحلول DC-ECM والهيدروجيل. n = 5 ، *** p < 0.001 (اختبار t للطالب). تم إجراء جميع التجارب ثلاث مرات على الأقل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

يوفر هذا البروتوكول نهجا منهجيا لإعداد الهلاميات المائية خارج الخلية للغضروف المنزوعة الخلايا والتي تحاكي عن كثب ECM الأصلي لأنسجة الغضاريف. يتضمن البروتوكول مزيجا من الاضطراب الفيزيائي والكيميائي والأنزيمي لإزالة المواد الخلوية مع الحفاظ على بنية وتكوين ECM. تشمل الخطوات الحاسمة للبروتوكول ضبط وقت وطرق إزالة الخلايا وضمان إزالة الخلايا بالكامل.

بالمقارنة مع الطرق الأخرى الموجودة لهندسة الأنسجة والطب التجديدي ، يقدم هذا البروتوكول العديد من المزايا. تتميز الهلاميات المائية DC-ECM بنشاط بيولوجي ممتاز ، وبنية مكانية ، ووظيفة تحريض بيولوجي ، فضلا عن انخفاض المناعة ، وهذه الخصائص مفيدة في تعزيز التصاق الخلايا وانتشارها والتمايز والهجرة11. يمكن أيضا استخدام الهلاميات المائية DC-ECM لتوصيل الدواء وعلاج عيوب الغضروف12.

أحد التعديلات التي يمكن إجراؤها على هذا البروتوكول هو استخدام عوامل ربط متقاطعة مختلفة لتعزيز الخواص الميكانيكية للهيدروجيل. على سبيل المثال ، يمكن استخدام المواد المعدنية النانوية لتحسين الخواص الميكانيكية للهيدروجيل13. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تحسين تركيز الريبوفلافين وأوقات التعرض للأشعة فوق البنفسجية للتحكم في قوة الضغط والشد للهيدروجيل.

على الرغم من مزاياها العديدة ، فإن هذه التقنية لها بعض القيود التي يجب مراعاتها. أحد القيود هو أن عملية إزالة الخلايا قد تسبب بعض الضرر ل ECM ، مما يؤدي إلى تغييرات في خواصها الميكانيكية14. هناك قيد آخر وهو أن عملية إزالة الخلايا قد لا تزيل جميع المواد المستضدية تماما ، مما يؤدي إلى استجابة مناعية محتملة15. علاوة على ذلك ، من المهم ملاحظة أن البروتوكول الموصوف في هذه الورقة خاص بأنسجة الغضاريف ، وقد تتطلب أنواع أخرى من الأنسجة تعديلات على طريقة إزالة الخلايا.

من حيث التطبيقات المستقبلية ، يمكن تحسين هذا البروتوكول بشكل أكبر لتطوير الهلاميات المائية DC-ECM ذات قوة ضغط وشد مختلفة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تطبيق هذه التقنية على الأنسجة الأخرى لتطوير الهلاميات المائية للمحاكاة الحيوية لهندسة الأنسجة وتطبيقات الطب التجديدي. بشكل عام ، يوفر البروتوكول المقدم في هذه الورقة موردا قيما للباحثين والأطباء في مجال هندسة الأنسجة ولديه القدرة على تعزيز تطوير استراتيجيات هندسة الأنسجة الفعالة لإصلاح الغضروف وتجديده.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

تم رعاية هذا العمل من قبل خطة الطب والتكنولوجيا الصحية لمقاطعة تشجيانغ (2019KY050) ، وخطة علوم وتكنولوجيا الطب الصيني التقليدي لمقاطعة تشجيانغ (2019ZA026) ، وخطة البحث والتطوير الرئيسية في مقاطعة تشجيانغ (المنحة رقم 2020C03043) ، وخطة علوم وتكنولوجيا الطب الصيني التقليدي لمقاطعة تشجيانغ (2021ZQ021) ، ومؤسسة العلوم الطبيعية لمقاطعة تشجيانغ الصينية (LQ22H060007).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1 M Tris-HCl, pH7.6BeyotimeST776-100 mL
1 M Tris-HCl, pH8.0BeyotimeST780-500 mL
-80 °C FreezerEppendorfF440340034
DeoxyribonucleaseAladdinD128600-80KU
DNEasy Blood &Tissue KitQiagenNo. 69506
GAG colorimetric quantitative detection kitShanghai HalingHL19236.2
HCP-2 dryer HitachiN/A
Nanodrop8000Thermo FisherN/ASpectrophotometer
PBS (10x)Gibco70011044
RibonucleaseAladdinR341325-100 mg
Sigma500ZIESSN/AScanning electron microscope
Spectra SThermo FisherN/ATransmission electron microscope
Stainless steel sieveSHXB-Z-1Shanghai Xinbu
Triton X-100BeyotimeP0096-500 mL
Trypsin Gibco15050065
Ultraviolet lampOmnicure 2000N/A
Vitamin B2GibcoR4500-5G
Vortex mixerShanghai Qiasen78HW-1 

References

  1. Vega, S. L., Kwon, M. Y., Burdick, J. A. Recent advances in hydrogels for cartilage tissue engineering. European Cells & Materials. 33, 59-75 (2017).
  2. Yang, J., Zhang, Y. S., Yue, K., Khademhosseini, A. Cell-laden hydrogels for osteochondral and cartilage tissue engineering. Acta Biomaterialia. 57, 1-25 (2017).
  3. Bejleri, D., Davis, M. E. Decellularized extracellular matrix materials for cardiac repair and regeneration. Advanced Healthcare Materials. 8 (5), e1801217 (2019).
  4. Brown, M., Li, J., Moraes, C., Tabrizian, M., Li-Jessen, N. Y. K. Decellularized extracellular matrix: New promising and challenging biomaterials for regenerative medicine. Biomaterials. 289, 121786 (2022).
  5. Barbulescu, G. I., et al. Decellularized extracellular matrix scaffolds for cardiovascular tissue engineering: Current techniques and challenges. International Journal of Molecular Sciences. 23 (21), 13040 (2022).
  6. Zhang, W., Du, A., Liu, S., Lv, M., Chen, S. Research progress in decellularized extracellular matrix-derived hydrogels. Regenerative Therapy. 18, 88-96 (2021).
  7. Zhu, W., et al. Cell-derived decellularized extracellular matrix scaffolds for articular cartilage repair. International Journal of Artificial Organs. 44 (4), 269-281 (2021).
  8. Li, T., Javed, R., Ao, Q. Xenogeneic decellularized extracellular matrix-based biomaterials for peripheral nerve repair and regeneration. Current Neuropharmacology. 19 (12), 2152-2163 (2021).
  9. Xia, C., et al. Decellularized cartilage as a prospective scaffold for cartilage repair. Materials Science & Engineering C-Materials for Biological Applications. 101, 588-595 (2019).
  10. Chen, P., et al. Desktop-stereolithography 3D printing of a radially oriented extracellular matrix/mesenchymal stem cell exosome bioink for osteochondral defect regeneration. Theranostics. 9 (9), 2439-2459 (2019).
  11. Saldin, L. T., Cramer, M. C., Velankar, S. S., White, L. J., Badylak, S. F. Extracellular matrix hydrogels from decellularized tissues: Structure and function. Acta Biomaterialia. 49, 1-15 (2017).
  12. Yuan, X., et al. Stem cell delivery in tissue-specific hydrogel enabled meniscal repair in an orthotopic rat model. Biomaterials. 132, 59-71 (2017).
  13. Zheng, L., et al. Intensified stiffness and photodynamic provocation in a collagen-based composite hydrogel drive chondrogenesis. Advanced Science. 6 (16), 1900099 (2019).
  14. Young, J. L., Holle, A. W., Spatz, J. P.Nanoscale and mechanical properties of the physiological cell-ECM microenvironment. Experimental Cell Research. 343 (1), 3-6 (2016).
  15. Abdolghafoorian, H., et al. Effect of heart valve decellularization on xenograft rejection. Experimental and Clinical Transplantation. 15 (3), 329-336 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

ECM

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved