Sintesi di idrogel di matrice extracellulare della cartilagine decellularizzata

Questo articolo introduce un nuovo metodo per la sintesi di idrogel di matrice extracellulare di cartilagine decellularizzata (DC-ECM). Gli idrogel DC-ECM hanno un'eccellente biocompatibilità e forniscono un microambiente superiore per la crescita cellulare. Pertanto, possono essere scaffold cellulari ideali e sistemi di rilascio biologico.

Gli idrogel della matrice extracellulare della cartilagine decellularizzata (DC-ECM) sono biomateriali promettenti per l'ingegneria tissutale e la medicina rigenerativa grazie alla loro biocompatibilità e alla capacità di imitare le proprietà naturali dei tessuti. Questo protocollo mira a produrre idrogel DC-ECM che imitano da vicino l'ECM nativo del tessuto cartilagineo. Il protocollo prevede una combinazione di disgregazione fisica e chimica e digestione enzimatica per rimuovere il materiale cellulare preservando la struttura e la composizione dell'ECM. Il DC-ECM è reticolato utilizzando un agente chimico per formare un idrogel stabile e biologicamente attivo. L'idrogel DC-ECM ha un'eccellente attività biologica, struttura spaziale e funzione di induzione biologica, nonché una bassa immunogenicità. Queste caratteristiche sono utili per promuovere l'adesione, la proliferazione, la differenziazione e la migrazione cellulare e per creare un microambiente superiore per la crescita cellulare. Questo protocollo fornisce una risorsa preziosa per ricercatori e clinici nel campo dell'ingegneria tissutale. Gli idrogel biomimetici possono potenzialmente migliorare lo sviluppo di efficaci strategie di ingegneria tissutale per la riparazione e la rigenerazione della cartilagine.

L'ingegneria tissutale della cartilagine è un campo in rapido sviluppo che cerca di rigenerare il tessuto cartilagineo danneggiato o malato¹. Una sfida chiave in questo campo è lo sviluppo di scaffold biomimetici in grado di supportare la crescita e la differenziazione dei condrociti, le cellule responsabili della produzione di cartilagine². L'ECM del tessuto cartilagineo svolge un ruolo fondamentale nella regolazione del comportamento dei condrociti. DC-ECM è un'impalcatura efficace per applicazioni di ingegneria tissutale³.

Sono state sviluppate diverse tecniche per produrre DC-ECM dal tessuto cartilagineo, inclusi metodi chimici, enzimatici e fisici. Tuttavia, questi metodi spesso portano alla generazione di idrogel ECM che non sono sufficientemente biomimetici, il che limita il loro potenziale per l'uso in applicazioni di ingegneria tissutale ^4,5. Pertanto, è necessario un metodo più efficace per la produzione di idrogel DC-ECM.

Lo sviluppo di questa tecnica è importante perché può far progredire il campo dell'ingegneria tissutale fornendo un nuovo approccio per la creazione di scaffold biomimetici in grado di supportare la rigenerazione e la riparazione dei tessuti. Inoltre, questa tecnica potrebbe essere facilmente adattata per produrre idrogel ECM da altri tessuti, ampliando così le sue potenziali applicazioni.

Nel più ampio corpus della letteratura, c'è stato un crescente interesse per l'utilizzo di DC-ECM come impalcatura per applicazioni di ingegneria tissutale⁶. Numerosi studi hanno dimostrato l'efficacia degli idrogel DC-ECM nel promuovere la crescita e la differenziazione cellulare in vari tessuti, tra cui la cartilagine ^7,8. Pertanto, lo sviluppo di un protocollo per la produzione di idrogel DC-ECM che imitano da vicino l'ECM naturale del tessuto cartilagineo è un contributo significativo al campo.

Il protocollo presentato in questo documento risponde a questa esigenza fornendo un nuovo metodo per la produzione di idrogel DC-ECM che imitano da vicino l'ECM naturale del tessuto cartilagineo. Il protocollo prevede la decellularizzazione del tessuto cartilagineo, l'isolamento dell'ECM risultante e la creazione di un idrogel reticolando l'ECM con un polimero biocompatibile. L'idrogel risultante ha mostrato risultati promettenti nel sostenere la crescita e la differenziazione dei condrociti.

Questo studio è stato approvato dal Comitato Etico dell'Ospedale di Tongde della provincia di Zhejiang.

1. Preparazione dell'idrogel DC-ECM

NOTA: In questo studio, la cartilagine è stata ottenuta dalle articolazioni del ginocchio di maiali in miniatura Bama di 12 mesi, evitando la raccolta di tessuto osseo.

1. Prendete la cartilagine raccolta, bloccatela e tagliatela in^{1-2 mm 3} pezzi con un bisturi.
2. Mettere 20 g di cartilagine tritata in una provetta da centrifuga da 50 mL e aggiungere 20 ml di tampone Tris-HCl ipotonico (10 mM Tris-HCl, pH 8,0) per immergere completamente il tessuto. Mettere la provetta da centrifuga in un congelatore a -80 °C per 3 ore e poi in un forno a 37 °C per 3 ore. Ripetere la fase di congelamento e riscaldamento sei volte. In questa fase, il tampone ipotonico Tris-HCl non deve essere sostituito.
3. Agitare la provetta da centrifuga per 30 s utilizzando un miscelatore a vortice a una velocità di 1.000 giri/min. Posizionare un setaccio in acciaio inossidabile (dimensione dei pori: ~250 μm) su una nuova provetta da centrifuga da 50 mL.
4. Decantare lentamente la cartilagine decellularizzata nel setaccio in acciaio inossidabile, lavare il tessuto tre volte con PBS sterile e raccogliere la cartilagine.
5. Aggiungere 10 mL di soluzione di tripsina (0,25% di tripsina in PBS) e posizionare la provetta su uno shaker a 37 °C per 24 ore. Durante questo periodo, sostituire la tripsina ogni 4 ore. Filtrare la sospensione con il setaccio in acciaio inossidabile e conservare il tessuto. La tripsina può essere trattata durante la notte durante uno dei processi di digestione e questo non influirà sulla digestione finale.
6. Lavare il tessuto tripsinizzato con tampone ipertonico (1,5 M NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,6).
7. Aggiungere 10 mL di soluzione di nucleasi (50 U/mL di desossiribonucleasi e 1 U/mL di ribonucleasi in 10 mM di Tris-HCl, pH 7,5) e posizionare la provetta su uno shaker a 37 °C per 4 ore.
8. Rimuovere la soluzione di nucleasi, lavare la cartilagine tre volte con PBS sterile e aggiungere una soluzione ipotonica di Tris-HCl. Posizionare la provetta da centrifuga su uno shaker e risciacquare per 20 ore a temperatura ambiente (RT).
9. Rimuovere la soluzione ipotonica di Tris-HCl, lavare la cartilagine tre volte con PBS sterile e aggiungere una soluzione di Triton X-100 all'1% per immergere il tessuto per 24 ore.
10. Rimuovere la soluzione Triton X-100 e sciacquare accuratamente la cartilagine decellularizzata con acqua distillata per 3 giorni, cambiando l'acqua distillata ogni 12 ore.
11. Immergere la cartilagine in una soluzione di acido peracetico (0,1% PAA in 4% etanolo) per 4 ore. Rimuovere la soluzione di acido peracetico e lavare la cartilagine tre volte con acqua distillata sterile.
12. Posizionare il setaccio in acciaio inossidabile (dimensione dei pori: ~250 μm) su una provetta da centrifuga da 50 mL. Decantare lentamente la cartilagine decellularizzata nel setaccio in acciaio inossidabile e raccogliere la cartilagine. Testare il grado di decellularizzazione e la ritenzione della matrice della cartilagine stimando il contenuto di DNA, collagene e glicosaminoglicani (GAG).
13. Metti la cartilagine decellularizzata in una ciotola di macinazione, aggiungi azoto liquido e macina la cartilagine decellularizzata per formare una polvere. Prendere 2 g di polvere di cartilagine decellularizzata, aggiungere 80 ml di acido acetico 0,5 M e 20 mg di pepsina e digerire per 24 ore. Centrifugare a 400 x g per 10 min; scartare il sedimento e raccogliere la soluzione surnatante (soluzione DC-ECM).
14. Decantare 1 mL di soluzione DC-ECM per pozzetto in piastre da 6 pozzetti. Mettere le piastre a 6 pozzetti in un liofilizzatore. Congelare la soluzione DC-ECM. Una volta che la temperatura nel liofilizzatore scende a -40 °C, accendere la pompa del vuoto e mantenere il grado di vuoto a 10 Pa per 22 ore.
15. Estrarre la soluzione DC-ECM liofilizzata, metterla in provette da centrifuga e conservarla a -20 °C. Il periodo minimo di conservazione della soluzione DC-ECM liofilizzata supera la metà dell'anno.
16. Aggiungere 1 mL di acqua distillata sterile per sciogliere 20 mg di soluzione DC-ECM liofilizzata nella provetta da centrifuga. Agitare per 1 minuto utilizzando un miscelatore a vortice a una velocità di 1.000 giri/min a RT. Aggiungere 1 mg di vitamina B2 (0,1% p/v) alla soluzione DC-ECM, incubare a 37 °C per 60 minuti e irradiare con luce UV (370 nm, 3,5 mW/cm²) per 3 minuti per formare un idrogel (idrogel DC-ECM).

2. Rilevamento della cartilagine decellularizzata

1. Rilevamento del contenuto di DNA della cartilagine decellularizzata
   NOTA: Estrarre il DNA utilizzando il kit DNEasy Blood & Tissue.
   1. Per prima cosa, prendi 20 mg di cartilagine DC-ECM in una provetta da centrifuga. Aggiungere 180 μL di Buffer GTL e 20 μL di Proteinasi K mediante oscillazione del vortice e incubare la cartilagine a 56 °C per 4 ore fino a quando non è completamente disciolta.
   2. Agitare la provetta da centrifuga per 15 secondi utilizzando un miscelatore a vortice a una velocità di 1.000 giri/min a RT. Successivamente, aggiungere 200 μL di Buffer GL ed etanolo anidro e mescolare accuratamente mediante vibrazione a vortice. Centrifugare i campioni per 1 minuto a una velocità di 6.000 x g a 4 °C.
   3. Aggiungere 500 μL di tampone GW1 alla colonna di adsorbimento e centrifugare i campioni per 1 minuto a una velocità di 12.000 x g a 4 °C. Aggiungere 500 μL di tampone GW2 alla colonna di adsorbimento e centrifugare a 20.000 x g a 4 °C per 1 minuto. Infine, aggiungere 50 μL di acqua sterilizzata alla colonna di adsorbimento e centrifugare per 1 minuto a una velocità di 6.000 x g a 4 °C per raccogliere la soluzione di DNA. Determinare il contenuto di DNA utilizzando uno spettrofotometro.
2. Rilevamento del contenuto di collagene nella cartilagine decellularizzata
   1. Per rilevare il contenuto di collagene nella cartilagine decellularizzata, utilizzare l'idrossiprolina come marcatore di aminoacidi del collagene. Acidificare 5 mg di cartilagine decellularizzata con 5 mL di acido cloridrico 6 M a 100 °C per 20 min, quindi neutralizzarli con 5 mL di una soluzione di idrossido di sodio 6 M.
   2. Calcolare il contenuto di idrossiprolina misurando l'assorbanza del campione a 570 nm con uno spettrofotometro. Ottenere una regressione lineare concentrazione-assorbimento utilizzando il campione standard di idrossiprolina.
3. Rilevamento del contenuto di GAG nella cartilagine decellularizzata
   NOTA: Il contenuto di GAG nella cartilagine DC-ECM è stato rilevato utilizzando un kit di rilevamento quantitativo colorimetrico GAG tissutale. Tutti i reagenti riportati di seguito sono disponibili nel kit.
   1. Prelevare 200 mg di polvere di cartilagine DC-ECM e aggiungere 500 μL di reagente A mediante oscillazione a vortice. Incubare il campione a 4 °C per 16 ore, quindi centrifugare a 14.000 x g per 10 minuti.
   2. Prelevare 50 mL di soluzione campione e aggiungere 50 μL di soluzione ad alto contenuto salino (reagente B) e 50 μL di soluzione acida (reagente C) mediante oscillazione a vortice. Incubare il campione per 10 min.
   3. Aggiungere 750 μL di soluzione colorante (reagente D) mediante oscillazione a vortice e incubare il campione per 30 minuti in condizioni di oscurità. Centrifugare il campione a 14.000 x g per 10 minuti, quindi scartare il surnatante.
   4. Aggiungere 1 μL di soluzione detergente (reagente E) e mescolare bene. Centrifugare il campione a 14.000 x g per 10 minuti ed eliminare il surnatante.
   5. Aggiungere 1 μL di soluzione di dissociazione (reagente F) al campione e mescolare bene. Incubare il campione per 30 minuti in condizioni di oscurità. Infine, determinare il contenuto di GAG utilizzando uno spettrofotometro a 600 nm.
4. Analisi al microscopio elettronico a scansione (SEM) e al microscopio elettronico a trasmissione (TEM) della cartilagine decellularizzata
   1. Confronta la cartilagine decellularizzata e il tessuto cartilagineo normale. Porre il campione in una soluzione di glutaraldeide al 2,5%, incubare a 4 °C per una notte e poi lavare con PBS tre volte.
   2. Fissare il campione all'1% di OsO4 per 1 ora, quindi lavare tre volte con PBS.
   3. Disidratare il campione mediante immersione sequenziale in etanolo al 50%, 70%, 90% e 100% e acetone al 100% per 15 minuti ciascuno. Porre il campione in una soluzione mista di esametildisilazano ed etanolo (1:1) per 15 minuti, seguito da immersione in esametildisilazano puro per 15 minuti.
   4. Mettere il campione in un essiccatore HCP-2, quindi asciugare con azoto liquido. Quindi, rivestire il campione completamente essiccato con un sottile strato di oro-palladio utilizzando il rivestimento sputter e l'immagine utilizzando SEM. Il rivestimento sputtering è stato eseguito ad una potenza di 120 W per 5 min. L'esperimento è stato condotto nelle seguenti condizioni: una tensione di lavoro di 15 kV e un grado di vuoto inferiore a 5 x 10⁻⁵ Pa.
   5. Per l'analisi TEM, porre il campione in una miscela di acetone anidro e resina (1:1) per 1 ora, seguita da una miscela di acetone anidro e resina (1:3) per 3 ore. Quindi, metti il campione nella resina per una notte.
      1. Porre il campione in capsule riempite di terreno e riscaldare a 70 °C per 9 ore.
      2. Dopo l'inclusione, tagliare il campione in fette sottili da 70 nm utilizzando un microtomo ultrafine e posizionarlo su una rete di rame.
      3. Pipettare 20 μL di soluzione colorante con acetato di uranile sulla rete di rame e colorare per 15 minuti a RT. Rimuovere la soluzione colorante lavando delicatamente la rete due volte con acqua distillata.
      4. Quindi, pipettare 20 μL di soluzione colorante di citrato di piombo sulla rete di rame e colorare per 15 minuti a RT. Lavare la rete tre volte con acqua distillata.
      5. Posizionare la rete di rame su una capsula di Petri pulita rivestita di carta da filtro. Dopo l'asciugatura all'aria, fotografare le sezioni utilizzando TEM. La sonda è stata applicata con una forza verso il basso di 500 nN, scansionata a una velocità di 1 Hz e aveva una costante elastica (valore k) di 40 ^Nm-1. Il raggio della punta della sonda è stato misurato in 8 nm.

Per preparare un migliore idrogel di cartilagine DC-ECM, abbiamo studiato e rivisto la letteratura precedente e confrontato i vari protocolli di decellularizzazione in termini di rapporto di decellularizzazione, immunogenicità e funzionalità meccanica⁹.

Su questa base, abbiamo preparato l'idrogel di cartilagine DC-ECM e abbiamo esplorato l'effetto di una matrice estrattiva orientata radialmente/bio-inchiostro di esosomi di cellule staminali mesenchimali nel trattamento dei difetti osteocondrali. I risultati hanno mostrato che l'idrogel di cartilagine DC-ECM aveva una bassa immunogenicità e poteva migliorare la migrazione cellulare e promuovere la riparazione della cartilagine¹⁰.

Negli ultimi anni abbiamo ottimizzato la preparazione della cartilagine DC-ECM. Abbiamo preparato la cartilagine decellularizzata utilizzando i passaggi sperimentali di cui sopra. I risultati hanno mostrato che il contenuto di DNA è stato eliminato nella cartilagine decellularizzata rispetto a quello nella cartilagine nativa (p < 0,001, Figura 1A). Il test dell'idrossiprolina ha indicato che il contenuto di collagene era simile tra le cartilagini native e quelle decellularizzate (p = 0,48, Figura 1B). Il test DMMB ha mostrato che il glicosaminoglicano era ben trattenuto nella cartilagine decellularizzata rispetto alla cartilagine nativa (p = 0,68, Figura 1C). Inoltre, SEM e TEM sono stati utilizzati per osservare l'ultrastruttura della DC-ECM (Figura 1D).

Per preparare un idrogel DC-ECM, la soluzione DC-ECM liofilizzata è stata solubilizzata per una concentrazione finale del 2% in peso. Inoltre, la soluzione DC-ECM è stata miscelata con VB2, seguita da reticolazione indotta da UVA (370 nm) (Figura 2A). Abbiamo posizionato la soluzione DC-ECM e l'idrogel DC-ECM in provette per microcentrifuga (Figura 2B). Quando i tubi erano invertiti, l'idrogel nei tubi non scorreva sul fondo, il che era un segno di gelificazione. Il tempo di gelificazione per la soluzione DC-ECM basata sull'autoassemblaggio del collagene a 37 °C senza un agente reticolante è stato di circa 15 minuti (Figura 2C). Sono stati testati la viscosità e il modulo dinamico della soluzione DC-ECM e dell'idrogel. Abbiamo scoperto che la viscosità della soluzione dell'idrogel DC-ECM era superiore a quella della soluzione DC-ECM e che velocità di taglio più elevate erano associate a una viscosità della soluzione inferiore (Figura 2D). Inoltre, il modulo di conservazione sia della soluzione DC-ECM che dell'idrogel era molto più alto del modulo di perdita, indicando che entrambi avevano le proprietà di un gel piuttosto che di un liquido (Figura 2E). In particolare, dopo la reticolazione e la liofilizzazione, le dimensioni dei pori della soluzione DC-ECM e dell'idrogel DC-ECM, misurate con SEM, sono diminuite da 137,672 μm a 37,936 μm (p < 0,00195, Figura 2F,G).

Figura 1: Preparazione e caratterizzazione della cartilagine decellularizzata. La cartilagine decellularizzata è stata confrontata con la cartilagine nativa. (A-C) Quantificazione del contenuto di DNA, collagene e glicosaminoglicani (GAG). n = 5, ***p < 0,001 (test t di Student). Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti almeno tre volte. (D) Strutture microscopiche della cartilagine nativa e della cartilagine decellularizzata fotografate con SEM e TEM. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Preparazione e caratterizzazione dell'idrogel DC-ECM. Sotto la luce ultravioletta, la soluzione DC-ECM e VB2 si sono reticolati e hanno formato un idrogel DC-ECM. (A) Strutture molecolari e sintesi dell'idrogel DC-ECM. L'aspetto, la caratterizzazione e le proprietà meccaniche sono stati confrontati tra la soluzione DC-ECM e l'idrogel DC-ECM. (B) Le immagini della soluzione DC-ECM e dell'idrogel DC-ECM in provette di microcentrifuga. (C) Il tempo di gelificazione dell'idrogel DC-ECM e dell'idrogel DC-ECM/VB2. n = 3, ***p < 0,001 (test t di Student). (D) La viscosità e (E) il modulo dinamico della soluzione DC-ECM e dell'idrogel DC-ECM. (F) Strutture microscopiche della soluzione DC-ECM e dell'idrogel (basso e alto ingrandimento). Barre di scala = 100 μm. (G) Dimensioni dei pori della soluzione DC-ECM e dell'idrogel. n = 5, ***p < 0,001 (test t di Student). Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti almeno tre volte. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Questo protocollo fornisce un approccio sistematico per la preparazione di idrogel di matrice extracellulare della cartilagine decellularizzata che imitano da vicino l'ECM nativa del tessuto cartilagineo. Il protocollo prevede una combinazione di disgregazione fisica, chimica ed enzimatica per rimuovere il materiale cellulare preservando la struttura e la composizione dell'ECM. I passaggi critici del protocollo includono la regolazione del tempo e dei metodi di decellularizzazione e la garanzia di una decellularizzazione completa.

Rispetto ad altri metodi esistenti per l'ingegneria tissutale e la medicina rigenerativa, questo protocollo offre diversi vantaggi. Gli idrogel DC-ECM hanno un'eccellente attività biologica, struttura spaziale e funzione di induzione biologica, nonché una bassa immunogenicità, e queste caratteristiche sono utili nel promuovere l'adesione, la proliferazione, la differenziazione e la migrazione cellulare¹¹. Gli idrogel DC-ECM possono essere utilizzati anche per la somministrazione di farmaci e il trattamento dei difetti della cartilagine¹².

Una modifica che può essere apportata a questo protocollo è l'uso di diversi agenti reticolanti per migliorare le proprietà meccaniche dell'idrogel. Ad esempio, i materiali nanometallici possono essere utilizzati per migliorare le proprietà meccaniche dell'idrogel¹³. Inoltre, la concentrazione di riboflavina e i tempi di esposizione ai raggi UV possono essere ottimizzati per controllare le resistenze alla compressione e alla trazione dell'idrogel.

Nonostante i suoi numerosi vantaggi, questa tecnica presenta alcuni limiti che dovrebbero essere considerati. Una limitazione è che il processo di decellularizzazione può causare alcuni danni all'ECM, portando a cambiamenti nelle sue proprietà meccaniche¹⁴. Un'altra limitazione è che il processo di decellularizzazione potrebbe non rimuovere completamente tutto il materiale antigenico, portando a una potenziale risposta immunitaria¹⁵. Inoltre, è importante notare che il protocollo descritto in questo documento è specifico per il tessuto cartilagineo e altri tipi di tessuto possono richiedere aggiustamenti al metodo di decellularizzazione.

In termini di applicazioni future, questo protocollo può essere ulteriormente ottimizzato per sviluppare idrogel DC-ECM con diverse resistenze alla compressione e alla trazione. Inoltre, questa tecnica può essere applicata ad altri tessuti per sviluppare idrogel biomimetici per applicazioni di ingegneria tissutale e medicina rigenerativa. Nel complesso, il protocollo presentato in questo documento fornisce una risorsa preziosa per ricercatori e clinici nel campo dell'ingegneria tissutale e ha il potenziale per migliorare lo sviluppo di strategie efficaci di ingegneria tissutale per la riparazione e la rigenerazione della cartilagine.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo lavoro è stato sponsorizzato dal Piano di Medicina e Tecnologia Sanitaria della Provincia di Zhejiang (2019KY050), dal Piano di Scienza e Tecnologia della Medicina Tradizionale Cinese della Provincia di Zhejiang (2019ZA026), dal Piano di Ricerca e Sviluppo Chiave nella Provincia di Zhejiang (Grant No.2020C03043), dal Piano di Scienza e Tecnologia della Medicina Tradizionale Cinese della Provincia di Zhejiang (2021ZQ021) e dalla Fondazione Provinciale di Scienze Naturali della Cina di Zhejiang (LQ22H060007).