Method Article
توضح هذه المقالة اختبارًا بسيطًا يستند إلى PCR لمراقبة نشاط الرجعية LINE-1 النشطة ولرسم خريطة للتبديل الرجعي في جينوم معين. باستخدام خط الخلية MCF7، نبين هنا كيف يمكن تطبيق هذا الأسلوب للكشف عن نشاط LINE-1 الموجود في 22q12.1.
العناصر النووية الطويلة المتداخلة 1 (LINE-1s) هي الأسرة الوحيدة من العناصر الوراثية المتنقلة في الجينوم البشري التي يمكن أن تتحرك بشكل مستقل. هم يتمّون أنّ بعملية يدعى [رتروترنبووووووت] حيث هم [تصّو] أن يشكّل [مرنا] متوسّطة أيّ يكون بعد ذلك أدخلت داخل الجينوم بنسخ عكسيّة. على الرغم من الصمت في الخلايا الطبيعية، LINE-1s نشطة للغاية في الأورام الظهارية المختلفة. دي نوفو يمكن أن تؤدي عمليات الإدراج في LINE-1 إلى حدوث تكوين الورم، وبالتالي من المهم دراسة خط-1 بصورة منهجية في السرطان. من بين حوالي 150 خط-1 من الالرجعية المختصة الموجودة في الجينوم البشري، فقط حفنة من LINE-1 loci، ويشار إليها أيضا باسم "الساخنة" LINE-1s، تمثل غالبية دي نوفو LINE-1 الإدراج في أنواع السرطان المختلفة. لقد قمنا بتطوير تفاعل متسلسل بوليميراز بسيط (PCR) القائم على طريقة لرصد نشاط الرجعية من هذه الخط الساخن-1s. هذه الطريقة، التي تستند إلى معكوس لمسافات طويلة (LDI)-PCR، تستفيد من 3 نقل، وهي آلية يقوم من خلالها خط-1 بتعبئة المنطقة غير المتكررة المحيطة بها، والتي يمكن استخدامها فيما بعد لتحديد أحداث الانتراب من خط -1-3 تنبع من خط ساخن معين-1.
العناصر النووية المتداخلة طويلة (LINE-1s) هي عائلة من العناصر الوراثية المتنقلة تسمى retrotransposons التي يمكن أن تتحرك بشكل مستقل من مكان إلى آخر عن طريق آلية النسخ ولصق تسمى الرجعية. على مدى الوقت التطوري، وقد تراكمت الجينوم البشري أكثر من 500،000 نسخة من LINE-1 يكرر1. ومع ذلك، فإن معظم النسخ LINE-1 الموجودة في الجينوم يتم تغييرها وبالتالي لا يمكن أن تتحرك عن طريق التحريك. فقط ~ 150 نسخة لديها نسخة سليمة من تسلسل الحمض النووي اللازمة بالنسبة لهم لنقل2. في الخلايا الجسدية العادية ، يتم تقييد حركة هذه الخط-1 من قبل عوامل المضيف المختلفة3. يتم تخفيف هذه القيود في الأورام الظهارية المختلفة، مما تسبب في إزالة الضغط على LINE-1s مما أدى إلى العديد من عمليات الإدراج دي نوفو في جينوم الورم4. وقد ثبت أن بعض هذه الإدراجات المرتبطة بالورم دي نوفو تسبب الطفرات الإدراجية في الجينات، وبالتالي قيادة تطور الورم5،6. لذلك، من المهم أن تكون قادرة على تعيين الإدراج اتلاف جديدة في جينوم الورم.
الأساليب القائمة للكشف عن عمليات الإدراج de novo LINE-1 استخدام (1) نهج تسلسل الجينوم الكامل4و7و8، حيث يتم استخدام خوارزميات حسابية مختلفة للعثور على عمليات الإدراج de novo LINE-1 من بيانات WGS، أو (2) تسلسل الجيل التالي الذي يستهدف نهاية 3 قمن الشباب، يحتمل أن تكون نشطة LINE-1s 9،10،11،12،13. ومع ذلك، فإن العثور على إدراجات جديدة بين عدة آلاف من النسخ شبه المتطابقة مع هذه الأساليب هو أبعد ما يكون عن تافهة، ويزداد التحدي تفاقما بسبب عدم تجانس الورم والتعديلات الجينية المرتبطة إدراج LINE-14.
وأظهرت الدراسات التي تستخدم هذه الأساليب القائمة أن عدد قليل فقط من LINE-1s تمثل غالبية عمليات الإدراج دي نوفو لاين-1 لوحظت في الأورام7،8. لذلك، للإجابة على ما إذا كانت عينة ورم معينة يعرض نشاط LINE-1، يكفي تعيين الأحداث الرجعية الناجمة عن هذه الحفنة من موضع LINE-1 النشط للغاية. في هذه المقالة، ونحن نصف تفاعل سلسلة بوليميراز بسيطة (PCR) القائم على طريقة14 التي يمكن استخدامها لرصد نشاط موقع خط-1 معين في الإنترون الأولى من الجين TTC28 في 22q12.1 التي تنشط بشكل كبير في سرطان القولون والمستقيم 7 , 8.سيتم الإشارة إلى هذا الموقع الخط-1 كما TTC28-LINE-1في جميع أنحاء المادة. هذا الاختبار يحدد على وجه التحديد دي نوفو LINE-1 الأحداث الرجعية التي تحشد تسلسل غير متكرر على المنطقة المحيطة 3 ق من مصدر LINE-1 من قبل آلية تسمى 3 € transduction15. 3 يحدث الانتراب بسبب ضعف إشارة تعدد الإنكار LINE-1 (PAS) التي تسبب الآلية النسخية لتخطيه وإنهاء النسخ بدلا ً من ذلك في المصب PAS أقوى، وبالتالي التقاط تسلسل غير متكرر المحيطة ( من الآن فصاعدا يشار إليها باسم "العلامة الفريدة") التي يتم إدراجها بعد ذلك في الموقع المستهدف جنبا إلى جنب مع تسلسل LINE-1. وقد أظهر فيليب وآخرون16 مؤخراً أن أنواع الخلايا المختلفة يمكن أن تعبر عن مواقع مختلفة من خط 1. في ضوء هذا الاستنتاج، يمكن تطبيق هذه الطريقة لرصد نشاط LINE-1 الأكثر وضوحا ً التي تحشد علامتها الفريدة في نوع السرطان من الاهتمام.
الخطوة الأولى في LDI-PCR هو هضم الحمض النووي الجينومي مع إنزيم تقييد الذي يولد جزء تقييد يحتوي على خط-1 يجري مقايسة (هنا، TTC28-LINE-1) وعلامته الفريدة (الشكل 1). ثم يتم تعميم الحمض النووي المهضوم عن طريق الربط الذاتي وPCR تضخيم باستخدام التمهيديات العكسية الموجودة داخل العلامة الفريدة. من خلال القيام بذلك، يتم تضخيم دائما مصدر كامل طول LINE-1 في موقعه "الأصلي" وجنبا إلى جنب مع ذلك، سيتم أيضا تضخيم النسل LINE-1 الإدراج في مكان هدف مختلف يحتوي على علامة فريدة من نوعها (الشكل1)، وبالتالي الإبلاغ نشاط الرجعية من LINE-1 في السؤال.
تمت الموافقة على هذا البحث من قبل مجلس المراجعة المؤسسية ولجنة الأخلاقيات في مستشفى جامعة هلسنكي. تم الحصول على موافقة مستنيرة موقعة من الموضوع لعينة الدم المستخدمة لإثبات هذا البروتوكول.
1. تصميم التمهيديات العكسية واختيار الإنزيمات المقيدة (المعلوماتية الحيوية)
2. صنع قوالب الحمض النووي الدائري لمسافات طويلة معكوس PCR
3. لمسافات طويلة معكوس PCR
4- تسلسل منتجات أقل البلدان نمواً - PCR للكشف عن هوية المواقع المستهدفة لـ LINE-1 3- transduction
في حالة TTC28-LINE-1، هناك أكثر من PAS واحد داخل إطار 1 كيلو بايت المصب من PAS cognate، وبالتالي فإن المنطقة بين TTC28-LINE-1PAS وأقوى PAS في 811 نقطة أساس المصب اعتبرت علامة فريدة لTTC28-LINE-1. تم تصميم ثلاثة أزواج التمهيدي PCR العكسي في هذه العلامة الفريدة التي تتوافق مع PASS مختلفة الحالية14. اخترنا ثلاثة إنزيمات تقييدية: (1) NsiI التي تقطع 5... وتولد هذه الأجزاء التقييدية من 288 10 نقطة أساس و 699 5 نقطة أساس و305 6 نقطة أساس على التوالي.
من أجل إظهار هذه الطريقة، قمنا بإجراء LDI-PCR على الحمض النووي المستخرج من خط الخلية MCF7. وقد تم الإبلاغ عن هذا الخط خلية سرطان الثدي سابقا لعرض TTC28-LINE-1 النشاط16. للبساطة، قمنا بإجراء قالب الحمض النووي الدائري باستخدام إنزيم تقييد واحد، ساكالأول، من أصل ثلاثة، وقمنا بإجراء LDI-PCR باستخدام زوج التمهيدي واحد من أصل ثلاثة (الجدول 1) للكشف عن عمليات الإدراج من جديد LINE-1 النابعة من TTC28- الخط 1
تم ضمان نوعية جيدة من الحمض النووي المستخرج من خط الخلية MCF7 من قبل الأوجاروز جل الكهربائي (الشكل2). الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي سليمة يظهر أن الحمض النووي الجينومي هو من الجودة المثلى لهذا التحليل. إذا كانت مسحة مرئية بدلا من ذلك، وهذا يشير إلى سوء نوعية الحمض النووي المستخرج، والتي بدورها سوف تعوق الإجراءات المصب.
ويبين الشكل 3 نتيجة تمثيلية لتجربة الـ PCR المتدرجة، التي تهدف إلى تحديد درجة حرارة الصلب المثلى للزوج التمهيدي العكسي TTC28-LINE-1. تم استخدام الحمض النووي الجينومي للدم المهضوم مع SacI، متبوعاً بالربط الذاتي لتشكيل قالب الحمض النووي الدائري، لهذا التفاعل. يظهر منتج PCR محدد للغاية من الحجم المتوقع (5,649 نقطة أساس) عند 62 و64 و66 درجة مئوية أن درجة الحرارة المثلى لهذا الزوج التمهيدي تقع ضمن نطاق 62-66 درجة مئوية.
لقد قمنا بتوليد قالب حمض نووي دائري من خلال هضم الحمض النووي الجينومي MCF7 مع إنزيم تقييد SacI متبوعاً بالربط الذاتي. ويبين الشكل 4 أن TTC28-LINE-13€ يحدث التحويل في خطوط الخلايا MCF7: يمكن الكشف عن عمليات الإدراج دي نوفو كمنتجات LDI-PCR من أحجام مختلفة جنبا إلى جنب مع منتج PCR الأصلي من الحجم المعروف (5,649 bp). ولتحديد الإحداثيات الجينية لمواقع الهدف de novo، يمكن تسلسل أمبوليكونات PCR (انظر قسم البروتوكول 4).
الشكل 1 نظرة عامة على LDI-PCR للكشف عن LINE-1 3 ... transduction. يتم إنشاء قالب الحمض النووي الدائري عن طريق الهضم الأول (I) مع إنزيم تقييد وذاتية الربط (II) عليه. ويلي هذه الخطوة PCR العكسي (III) مع التمهيديات PCR عكسية تستهدف العلامة الفريدة من الخط-1 من الفائدة (تسلسل بين PAS الأضعف الخط-1 الخاصة، باللون الوردي، وأقوى PAS المصب، باللون الأحمر). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2 تقييم جودة الحمض النووي المستخرج. 100 نانوغرام من الحمض النووي المستخرج من خط الخلية MCF7 والدم من فرد عادي، والتي سيتم استخدامها كعينة التحكم، تم تشغيلها جنبا إلى جنب مع 1 ميكرولتر و 2 ميكرولتر من الحمض النووي / HindIII علامة وصفت باسم M. يرجى انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3 التدرج PCR لتحديد درجة حرارة الصلب الأمثل لالتمهيديات PCR عكسي (الجدول 1). يُظهر الطراز LDI-PCR باستخدام أزواج التمهيدي العكسي في درجة حرارة صلب تتراوح بين 56 و66 درجة مئوية منتجPCR متميز عند 62-66 درجة مئوية. يشير السهم الأخضر إلى درجة حرارة الصلب المحددة للتجارب المستقبلية. قالب الحمض النووي الدائري الذي تم إنشاؤه عن طريق هضم الحمض النووي الجينومي للدم من فرد عادي مع SacI متبوعاً بالربط الذاتي تم استخدامه لهذه الخطوة التحسينية. M، علامة (1 كيلو بايت بالإضافة إلى سلم الحمض النووي). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4 LDI-PCR لتحديد خط-1 3 € transduction الناجمة عن TTC28 -خط-1. قوالب الحمض النووي الدائرية التي تم إنشاؤها عن طريق هضم MCF7 والدم (من الفرد العادي) الحمض النووي الجينومي مع الكيسالأول تليها الربط الذاتي تم تضخيمها من قبل التمهيديات العكسية في درجة حرارة الصلب الأمثل. وقد تم الكشف عن منتج PCR "الأصلي"، الذي يحمل علامة نجمية، من الحجم المتوقع (5649 نقطة أساس) في كل من الحمض النووي MCF7 والحمض النووي العادي للدم، في حين أنتجت MCF7 أيضا منتجات PCR إضافية من أحجام مختلفة، مما يشير إلى de novo LINE-1 retrotransposition. M، علامة (1 كيلو بايت سلم الحمض النووي). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
اسم التمهيدي | تسلسل (5 € → 3 € ) |
L1_001 (rev) | TTCACTAAGGTGTGTGTAAAAC |
L1_002 (fwd) | في هذا الـ401 |
الجدول 1: معكوس PCR التمهيدي الزوج مصممة لعلامة فريدة من نوعها من TTC28 -الخط-1 14 سنة .
ملف تكميلي. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.
هنا نقوم بوصف طريقة التي يمكن استخدامها لتحديد دي نوفو LINE-1 الإدراج اتّبأ من أيّ [لين-1] نشطة فائدة. لقد قمنا بتحسين هذه الطريقة لLINE-1 نشطة للغاية، وتقع في 22q12.1، وأثبتت سابقا أن تكون حساسة للغاية في الكشف عن الإدراج تحت كلونال في سرطان القولون والمستقيم14.
يعتمد نجاح LDI-PCR على جودة الحمض النووي الجينومي. ولذلك، أدرجنا خطوة إضافية لمراقبة الجودة لضمان وجود الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي في بداية البروتوكول (الخطوة 2-1-2). نوصي بتخزين الحمض النووي الجيني عند -20 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل، وإعداد aliquots من أجل تجنب دورات التجميد والذوبان. ينصح بشدة باستخدام الحمض النووي الجيني من الدم أو الأنسجة الطبيعية المتطابقة المريض للتمييز بين ما إذا كان خط-1 الرجعية الكشف عن هو جرثومة أو حدث جسدي. وبما أن مواقع القطع للأنزيمات المقيدة هي مؤشر الاستوكاستك في الجينوم، فمن الممكن أن موقع إدخال خاص من جديد من خط -1 قد لا يأوي أي مواقع قطع للإنزيم المقيد المستخدم في محيطه. وبالتالي لزيادة احتمال الكشف عن غالبية عمليات الإدراج دي نوفو LINE-1 في الحمض النووي الورم، ينبغي استخدام أكثر من إنزيم تقييد في ردود فعل منفصلة لتوليد مكتبات مختلفة من قالب الحمض النووي الدائري. وعلاوة على ذلك، إذا كانت العلامة الفريدة من الخط-1 ذات الأهمية لديها أكثر من PAS واحد، ثم استخدام أزواج التمهيدي المتاخمة لكل PAS يحسن فرص الكشف عن transductions اقتطاع هابا.
على الرغم من وجود طرق أنيقة للكشف على نطاق الجينوم من الإدراج دي نوفو LINE-1، فإنها يمكن أن تكون ساحقة إذا كان الهدف هو التحقيق في كفاءة رجعية من LINE-1 معين في سياق خلوي معين. ولهذا الغرض، يمكن أن يكون برنامج الـ LDI-PCR نهجاً غير مكلف وبسيط ولكنه قوي لتصور أحداث التحديث ية LINE-1. ويشبه نهج الاستهداف المستخدم في هذه الطريقة نهج TS-ATLAS22؛ ومع ذلك، LDI-PCR يتجنب استخدام oligonucleotides linker ويمكن تضخيم كل من 5 € و 3 € تقاطعات دي نوفو الخط-1 الإدراج في وقت واحد. يمكن الحصول على معلومات تتعلق بكل من تقاطعات 5 و 3 درجة من الإدراج LINE-1، الموقع المستهدف للتكامل، ذيل polyA والتعديلات في الموقع المستهدف، وكلها من السمات المميزة للتحديث LINE-1، عن طريق اقتران LDI-PCR مع جزيء واحد تقنيات التسلسل طويلة القراءة. تحتوي القراءات الطويلة التي تم إنشاؤها على تسلسل LINE-1 المدرج وعلامته الفريدة والتسلسلات المستهدفة في قراءة واحدة، والالتفاف على صعوبات تعيين القراءات القصيرة في المنطقة المتكررة.
هناك اثنين من القيود الرئيسية لاستخدام LDI-PCR للكشف عن نشاط LINE-1. الأول متأصل في PCR: فإنه يمكن فقط تضخيم أجزاء موثوق بها تصل إلى 10 كيلو بايت في الحجم. وينبغي مراعاة ذلك عند اختيار إنزيم (إنزيمات) تقييد، حيث يجب ألا يتجاوز الجزء الأصلي هذا الحد. ثانياً، يمكن لهذه الطريقة فقط الكشف عن أحداث التمركز الرجعية التي تحشد المنطقة المحيطة بالخط-1 من خلال 3 قنوات. وبالتالي، لن يتم الكشف عن نشاط تلك LINE-1s التي لا تعرض 3 ... بالإضافة إلى ذلك، على الرغم من أن يتم تضخيمها من قبل LDI-PCR، قد لا يتم الكشف عن بعض الأحداث الرجعية LINE-1 التي (أ) توليد هدف PCR من حجم مماثل للموقع "الأصلي" أو غيرها من الرجعية أو (ب) نادرة أو تحت النسيلة، قد لا يتم الكشف عنها بواسطة هلام أغاروز الكهربائي. ويمكن التقاط هذه الأحداث الرجعية LINE-1 عن طريق تسلسل المنتج LDI-PCR باستخدام جزيء واحد طويل القراءة تقنيات التسلسل14.
سير العمل الموضح هنا يمكن تعديلها بسهولة للكشف عن نشاط الأخرى "الساخنة" LINE-1s باستخدام إنزيم تقييد مناسبة وعن طريق تصميم التمهيديات العكسية التي تستهدف هذه LINE-1s. بالإضافة إلى الكشف عن LINE-1 بوساطة 3 - transduction، يمكن تكييف هذه الطريقة للكشف عن أقل تواترا LINE-1 بوساطة 5 € transductions23. وقد استخدمت طريقة مماثلة لتحديد موقع التكامل للصحفيين LINE-1 في الاختبارات القائمة على الخلايا24 ومواقع التكامل بروفيروسي في السرطان25. وإلى جانب عمليات الإدراج في الخط 1، يمكن أيضا استخدام هذه الطريقة للكشف عن الانحرافات الجينية الأخرى، مثل إعادة ترتيب الحمض النووي، حيث توجد المعلومات المتعلقة بالمنطقة المعرضة لإعادة الترتيب من قبل26.
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
نود أن نشكر جميع المؤلفين المشاركين لدينا في هذه المقالة حيث تم وصف هذه الطريقة لأول مرة14، وخاصة تاتيانا كاجوسو ، كيمو بالين ، أوتي Kilpivaara وإيسا Pitkänen لمناقشات قيمة في حين تطوير الأسلوب. وتمول أكاديمية فنلندا (أرقام المنح 25996 و 292789 و 306026 و 314394) ومؤسسة سيغريد جوسيليوس والجمعية الفنلندية للسرطان. حصل ب. ب. على درجة الدكتوراه من مؤسسة أبحاث جامعة هلسنكي، ومنحة أطروحة من جمعية السرطان الفنلندية، ومنحة بحثية للدكتوراه من إيدا مونتينين سانتيو. كما نشكر تيمو ماسالين (جامعة هلسنكي) وكول شريستا من مجموعة أبحاث إل كيه على مساعدتنا في إنتاج الفيديو.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1 Kb DNA Ladder | New England Biolabs | N3232L | |
10 mM dNTP | ThermoFisher Scientific | 18427013 | |
Acetic acid | ThermoFisher Scientific | 64-19-7 | Used to make TAE buffer |
Agarose | BioNordika | BN-50004 | |
Blood sample (frozen) | Blood sample from a healthy individual for control PCR | ||
ChemiDoc XRS+ System | Bio-rad | 1708265 | |
DNA Gel Loading Dye (6X) | ThermoFisher Scientific | R0611 | |
DNeasy Blood & Tissue Kits | Qiagen | 69504 | |
Ethidium Bromide | Bio-rad | 161-0433 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | ThermoFisher Scientific | 25102-12-9 | Used to make TAE buffer |
FastDigest buffer | ThermoFisher Scientific | B64 | |
FastDigest SacI | ThermoFisher Scientific | FD1133 | |
Generuler 1 Kb plus DNA Ladder | ThermoFisher Scientific | SM1331 | |
Generuler Lambda DNA/HindIII Marker, 2 | ThermoFisher Scientific | SM0103 | |
Mini-Sub Cell GT Cell | Bio-rad | 1704406 | |
Phusion Green Hot Start II High-Fidelity DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | F537L | |
PowerPac Basic Power Supply | Bio-rad | 1645050 | |
Quantus Fluorometer | Promega | E6150 | |
T4 DNA Ligase | ThermoFisher Scientific | EL0011 | |
Tear-A-Way 96/8, 96 Well PCR Plate | 4titude | 4ti-0750/TA | |
Tris(hydroxymethyl)aminomethane | ThermoFisher Scientific | 77-86-1 | Used to make TAE buffer |
Veriti Thermal Cycler | Applied Bioscience | 4375786 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved