في تطبيق نظام التحكم عن بعد "التلاعب بالتعبير الجيني الذاتية" فيفو

هذا البروتوكول يحدد الخطوات اللازمة لإنشاء نظام نموذجي الذي النسخ من الجينات الذاتية لمصلحة يمكن التحكم في شروط في الحيوانات الحية أو الخلايا باستخدام قامع المحسن أمريكا اللاتينية والكاريبي و/أو نظم المنشط تيت .

هنا يمكننا وصف بروتوكول لتنفيذ نظام التحكم عن بعد (إعادةفيرسيبلي مأنيبوليشن سو تيرانسكريبشن في هندوجينوس المكاني)، الذي يسمح للسيطرة على التعبير عكسها والانضباطي نموذج الجينات الذاتية للاهتمام بالمعيشة النظم. نظام التحكم عن بعد تستخدم أنظمة التنشيط القمع و تيت المحسن لاك تحقيقا لأسفل أو upregulation من الجينات المستهدفة داخل نظام بيولوجي واحد. القمع ضيق يمكن أن يتحقق من قامع ملزم مواقع مرونة يقع المصب من موقع بدء النسخ عن طريق تثبيط استطالة النسخ. أوبريجولاتيون قوية لا يمكن تحقيقه بتعزيز النسخ من الجينات الذاتية باستهداف تيت المنشط النسخي للمروج المشابهة. ويمكن تطبيق عنصر التحكم هذا التعبير عكسها والانضباطي وسحبت مرارا وتكرارا في الكائنات الحية. بفاعلية وبراعة للنظام، كما هو موضح للذاتية Dnmt1 هنا، سوف تسمح أدق التحليلات الفنية المجراة في تمكين تحقيق وظيفة الجينات التعبير على مختلف المستويات والتجارب إمكانية الرجوع من النمط الظاهري.

خروج المغلوب الوراثية أو النهج المعدلة وراثيا كانت وسيلة فعالة لدراسة وظيفة الجينات في نماذج حيوانية. ومع ذلك، تنظيم التعبير بهذه النهج التفرع (تشغيل/إيقاف)، غير الزمان، وبالتالي غير قادر على الكشف عن الطيف الكامل من الجينات الوظيفية. الشرطي Cre/لترأوكسب تكنولوجيات أتاحت المنظمة الزمانية أو تنشيط وظيفة الجينات، ولكن طبيعتها التفرع لا تزال تشكل القيود، مثل هلاك الخلية وعدم الرجعة^{1،2 , 3}-من أجل ملء هذا الفراغ، وضعت نهوج ضربة قاضية الشرطي استخدام تيت-ينظم شرنا أو ميرنا⁴. بيد أن آثار خارج الهدف يظل مصدر قلق بالنسبة [رني]⁵ وقد تم الطعن في التحكم في الحية. في الآونة الأخيرة، قد قدم نهجاً أكثر تنوعاً لتحقيق كل من أعلى-و downregulation التعبير الجيني الذاتية كريسبر/Cas-بوساطة النسخي لمراقبة تكنولوجيات وأثبتت تلك المرافق^6،7 . ولكن فعالية مراقبة النسخي كريسبر/Cas-بوساطة من غير الواضح حتى الآن في فيفو، وتظل إمكانية الرجوع للقمع على أساس KRAB أن ينظر إليها، كما قوي القمع من جانب KRAB وقد ثبت البروتين التفاعل KAP1 لحمل الدائمة الجينات إسكات^8،9.

بغية معالجة أوجه القصور هذه، قمنا بتطوير نظام تنظيمي النسخي رواية قادرة على السيطرة على شروط التعبير الجيني الذاتية في عكسها وطريقة الانضباطي في الفئران باستخدام هندسة النسخي بدائية ثنائي ¹⁰من اللوائح التنظيمية. بدائية الأنظمة التنظيمية النسخي ثنائي مع يغاندس التنظيمية، مثل أمريكا اللاتينية والكاريبي و تيت، وقد مكنت هذه عكسها والانضباطي التعبير التحكم^11،،من^{1213، 14}. ومع ذلك، أعاق فاعلية القمع عدم كفاية النظم الثنائية الحالية على اعتماد واسع النطاق للتحكم في التعبير الجيني الذاتية في الثدييات. ونحن وضعت نظام قمع لاك المحسن قوية بما فيه الكفاية لقمع الجينات الذاتية وتوظيف استراتيجية رواية استهداف تيت المنشط النسخي مباشرة إلى مروج المشابهة الجينات الذاتية لتحقيق ¹⁰من أوبريجوليشن قوية (الشكل 1). مع هذه التكنولوجيا، فقد حققنا تقريبا اثنين من حيث الحجم تحكم تعبير الجينات Dnmt1 الذاتية في طريقة الانضباطي، وإيندوسيبلي، وعكسها¹⁰. هنا يمكننا توفير إرشادات خطوة بخطوة لتطبيق المجراة في الجينات والكائنات باستخدام الفئران كأحد أنواع نموذجية الأخرى.

الشكل 1 : نظرة عامة على نظام التحكم عن بعد- يمكن أن تنظم النسخ من الجينات المستهدفة الذاتية استخدام قامع هندسيا أمريكا اللاتينية والكاريبي ونظم تيت المنشط. المروج الجينات المستهدفة أو إنترون هو إجراء هندسة عكسية لاحتواء المشغلين قامع لاسيجي ضيق الملزمة و/أو rtالمنشط تا-M2. R يشير إلى ريبرون (Repريثيون عنترعلى)، التي تحتوي على 12 لاك متماثل العوامل (S) بالإضافة إلى إنترون بيتا جلوبين أرنب جزئي. T تشير إلى المشغل تيت . قامع و/أو المنشط ويتم التعبير عنها من مروج الأنسجة على حدة. التعبير عن الجينات المستهدفة يمكن ثم عكسية ضبطها إلى المستوى المطلوب من التعبير بإدارة إيبتج (الأيزوبروبيل β-د-1-ثيوجالاكتوبيرانوسيدي، خصم من قامع لاسيجي) أو الدوكسيسيكلين (دوكس). وقد تم تعديل هذا الرقم من لي et al.¹⁰الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

قبل البدء بهذا البروتوكول، استعراض الجدول 1 تحديد الخطوات ذات الصلة لعنصر التحكم المطلوب من التعبير الجيني. على سبيل المثال، لمهندس ماوس تمكن downregulation عكسها للجينات "X"، أكمل المقاطع 1 و 3 و 4 من دون البروتوكول. ويلخص الجدول 1 أيضا المكونات اللازمة لنظام التحكم عن بعد.

الجدول 1: نظرة عامة على مكونات جهاز التحكم عن بعد.

وأجريت جميع الإجراءات الحيوان مع الموافقة على "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) من جامعة كاليفورنيا الجنوبية ومعهد البحوث فإن اندل وامتثالا للدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية من المعاهد الوطنية للصحة¹⁵.

1-تعديل الجينات للفائدة للقمع من جانب جهاز التحكم عن بعد

1. باستخدام الإرشادات أدناه، التعرف إنترون ترانسكريبتيونالي خاملة تجاه 5 'نهاية جين الفائدة للإدراج في التسلسل ريبرون ("intr ريسيونمندوبفي"؛ 12 شركات أمريكا اللاتينية والكاريبي متماثلة بالإضافة إلى إنترون بيتا جلوبين أرنب جزئي). يكون على بينه من المروجين بديلة للجينات للفائدة، واختر إنترون وفقا transcript(s) التحكم في (أي إنترون تتقاسمها جميع النصوص أو واحدة محددة لنسخة المطلوب).
   ملاحظة: للجينات منها نحو 3 ' نهاية مع أو بدون إنترون، إدراج تسلسل ريبرون في المروج (انظر لي، وآخرون¹⁰ لإجراء مفصل).
   1. الحصول على تسلسل الجينوم للجينات للفائدة.
      1. انتقل إلى "مستعرض الجينوم التسخن"^16،17، وحدد آخر صيغة لمشروع الجينوم الماوس (الماوس GRCm38/mm10 في وقت النشر)، وحاليا تحت علامة التبويب الجينوم .
      2. أدخل اسم أو رمز من الجينات للفائدة في شريط البحث لعرض النصوص للجينات. انقر فوق الانتقال.
      3. حدد الخيار المطلوب نسخة للجينات للفائدة.
      4. انقر فوق الرمز الجيني إلى جانب البديل نسخة من الفائدة (سيكون رمزاً للنص المحدد مسبقاً في مربع الظلام).
      5. تحت رأيه التسلسل ووصلات إلى قواعد بيانات وأدوات ، انقر فوق الارتباط تسلسل الجينوم .
      6. تسلسل استرجاع المنطقة خيارات، حدد فقط Exons (5 'UTR، الأقراص المدمجة، و 3' UTR)، إينترونس، والافتراضي سجل FASTA واحدة لكل الجينات. للحصول على خيارات تنسيق التسلسل، حدد Exons في حالة العلوي، كل شيء آخر في حالة انخفاض و يكرر القناع إلى N (لإخفاء تسلسلات متكررة). ثم انقر فوق إرسال.
      7. حفظ هذا التسلسل، الحفاظ على العلوي-وأحرف صغيرة التنسيقات في المستند أو البرنامج الذي يمكن المشروح.
   2. تجنب انقطاع جزر البد، مما قد يدل على المناطق مع الوظيفة التنظيمية الجينات.
      ملاحظة: على الرغم من إنترون 5 ' الأفضل للإدراج في التسلسل ريبرون، إنترون الأولى قد تحتوي على العناصر التنظيمية النسخي مثل جزر البد (بحث في هذه الخطوة) أو عناصر محسن (بحث في الخطوة 1.1.4)، والتي ينبغي تجنبها ريبرون الإدراج.
      1. تحت رأيه التعبير والتنظيم "المتصفح المجين التسخن"، حدد إظهار المسار جزر البد ، وانقر فوق تحديث.
      2. التكبير في إينترونس 5 '، انقر فوق في كل جزيرة البد (يظهر باللون الأخضر في وقت النشر إذا كان موجوداً)، وحدد عرض الحمض النووي لهذه الميزة.
      3. بعد تحديد قناع يكرر إلى N, حدد الحصول على الحمض النووي للحصول على التسلسل الجزيرة البد.
      4. تراكب هذه التسلسلات مع ملف التسلسل الأصلي، وتعليم هذه المناطق إينترونيك تجنب بسبب الجينات ممكن الوظائف التنظيمية.
   3. تجنب انقطاع غير الترميز الكشف، في حال لديهم وظيفة تنظيمية.
      1. تحت رأيه الجينات والجينات التنبؤات مستعرض الجينوم التسخن، حدد إظهار المسار جينكودي (انسيمبل) ، وانقر فوق تحديث.
      2. التكبير في إينترونس 5 '، انقر فوق كل غير الترميز الحمض النووي الريبي (يظهر باللون الأخضر في وقت النشر إذا كان موجوداً)، والحصول على تسلسل الحمض النووي لكل واحد بالنقر فوق إحداثياته الصبغية.
      3. في القائمة المنسدلة، حدد الحمض النووي، وانقر فوق تكرار القناع إلى N. ثم انقر فوق الحصول على الحمض النووي.
      4. تراكب هذه التسلسلات مع ملف التسلسل الأصلي، وتعليم هذه المناطق إينترونيك تجنب بسبب الجينات ممكن الوظائف التنظيمية.
   4. تجنب مناطق إينترونيك مع التوقيعات محسن في tissue(s) الاهتمام، مثل H3K4me1 و H3K27ac والدناز أنا فرط^18،19،،من²⁰²¹، فضلا عن ربط كتكف المواقع، والتي تنظم حلقات^22،23محسن.
      1. انتقل إلى ترميز قاعدة البيانات^24،25، وحدد رمز التجارب .
      2. لنوع الفحص، حدد شريحة seq أو seq الدناز، وتعبئة الفئات الأخرى (الكائن الحي، و نوع العينة البيولوجية، إلخ) وفقا للخلايا ليتم إجراء هندسة عكسية.
      3. بعد تحديد الميزة، تحوم فوق الصور التوضيحية باللون الأزرق، وقم بتحديد الإصدار الذي يظهر عرض النتائج كقائمة (أقصى يسار الرسم التخطيطي في وقت النشر).
      4. حدد مجموعات البيانات لأهداف H3K4me1، H3K27ac، الدناز أنا، وكتكف الأكثر تطابقاً في الخلايا ليتم إجراء هندسة عكسية.
      5. داخل كل مجموعة من البيانات ذات الصلة، قم بالتمرير إلى المقطع الملفات والتحقق من أن mm10 (أو الإصدار الأحدث الجينوم) والتسخن المحددة، وانقر فوق الزر تصور .
      6. الآن في "مستعرض الجينوم التسخن" والتكبير في إينترونس 5 ' للجينات للفائدة، انقر على كل H3K4me1، H3K27ac، الدناز أنا، وذروة كتكف في ذروة المشروح كل المسارات.
      7. الحصول على تسلسل الحمض النووي لكل منطقة الذروة بالنقر فوق إحداثياته الكروموسومات.
      8. في القائمة المنسدلة، حدد الحمض النووي، وانقر فوق تكرار القناع إلى N. ثم انقر فوق الحصول على الحمض النووي.
      9. تراكب هذه التسلسلات مع ملف التسلسل الأصلي، وتعليم هذه المناطق إينترونيك تجنب بسبب الجينات ممكن الوظائف التنظيمية.
   5. تجنب انقطاع الربط متواليات، حتى لا يؤدي إلى التدخل مع الربط المناسبة من exons توافق الآراء.
      ملاحظة: على الرغم من أن تسلسل المطلوبة للربط تقتصر إلى حد كبير إلى حوالي ست قواعد في 5 'نهاية إنترون²⁶ وأسس حوالي 60 في 3' نهاية²⁷، فمن المستحسن أن حدد إنترون كبيرة، مما يسمح لهوامش أوسع كثيرا من هذه توافق المناطق للتقليل من احتمال التأثير على الربط. ينصح باستخدام أدوات تحليل إنترون، مثل SVM-ببفيندير²⁸، بإجراء تحليل أكثر دقة لإمكانية لصق متواليات.
2. بعد تحديد منطقة إينترونيك التي تفي المعايير المذكورة أعلاه (ومثال ذلك ل Dnmt1 في البيانات التكميلية)، الشاشة التسلسل سجرنا على شبكة إنترنت استخدام تصميم أداة للتعرف سجرنا في المنطقة مع خصوصية عالية وتوقع درجات الكفاءة.
   1. انتقل إلى أداة تصميم سجرنا عبر إنترنت لاختيار، مثل كريسبور²⁹.
   2. أدخل تسلسل منطقة إينترونيك للفائدة وتحديد الجينوم المرجعية ذات الصلة وحدد المطلوب بروتوسباسير المتاخمة عزر (بام). انقر فوق إرسال.
   3. فرز سجرناس تنبأ بدرجة خصوصية، وقم بتحديد واحد أو أكثر من سجرناس التي لها أيضا كفاءة المتوقعة عالية نقاط²⁹.
      1. اختياري: إلى أقصى حد احتمال استخدام سجرنا فعالة، أولاً اختبار كفاءة الانقسام سجرناس سجل أعلى عدد في فحص في المختبر³⁰، والمضي قدما في سجرنا أكفأ المجراة.
3. تصميم قالب الحمض النووي يحتوي على بيت (المستندة إلى حقن برونوكلير ترانسجينيسيس المستهدفة) الهبوط تسلسل لوحة، كما يتضح في "الشكل التكميلية" 1A، ب، تساندها الأسلحة 60-قاعدة التماثل التي تتوافق مع سجرنا قطع الموقع^{31 من الجانبين} .
   ملاحظة: المهبط يحتوي على اثنين من مواقع الغيروية لوكسب (JT15 و Lox2272) وتمكن الإدراج المستهدفة من تسلسلات كبيرة من خلال اتباع نهج من مرحلتين؛ تأكد من أن الوصلات لهذا الإدراج لا تقم بإنشاء مواقع لصق خفي. وبدلاً من ذلك، يمكن استخدام خلايا الجذعية جنينية (ESC)-أساس تدق-في استراتيجية لإدراج تسلسل ريبرون مباشرة.
4. إعداد سجرنا والبروتين Cas9 وقالب الحمض النووي (سدنى) الذين تقطعت بهم السبل--واحد للمهبط، وميكروينجيكت في البيض المخصب (من B6C3F1/ياء الفئران أو غيرها السلالة المرغوبة) وفقا للبروتوكولات المعمول بها^32،33.
5. الشاشة للفئران مع الهبوط لوح تدق.
   1. تصميم [بكر] كبسولة تفجير مكملة لمحور الجينوم ولكن خارج المناطق التي استهدفت بالأسلحة التماثل، كما يدل على Dnmt1 في التكميلية الرقم 1. تجنب تكرار تسلسل الجينوم عند تصميم الإشعال.
   2. استخراج الحمض النووي من مقاطع ذيل الفئران وفقا للبروتوكولات المعمول بها³⁴.
   3. استخدام PCR وهلام التفريد لتحديد الفئران مع إدراج منصة هبوط.
   4. تأكيد أن تدق في كانت ناجحة بالتسلسل منتجات PCR.
      ملاحظة: الحذف الكبيرة غير المرغوب فيها وترتيبات جديدة يمكن أن تكون قدمه كريسبر/Cas9³⁵، حذراً لذا ينصح بالفحص للتحرير خارج الهدف قبل المضي^35،،من³⁶³⁷.
6. استخدام البويضات المخصبة من الفئران منصة الهبوط، ميكروينجيكت الجماعات مرناً³⁸ وبلازميد محوره وراثيا تحتوي على تسلسل ريبرون محاط ب JTZ17 و Lox2272 جزئ مواقع^31،،من^3940، وأنشأت ⁴¹ وفقا للأساليب^38،،من⁴²⁴³.
7. الشاشة للفئران مع الإدراج ريبرون.
   1. تصميم [بكر] كبسولة تفجير مكملة لمحور الجينوم، خارج إدراج ريبرون. تجنب تكرار تسلسل الجينوم عند تصميم الإشعال.
   2. استخراج الحمض النووي من مقاطع ذيل الفئران وفقا للبروتوكولات المعمول بها³⁴.
   3. استخدام PCR وهلام التفريد لتحديد الفئران مع إدراج ريبرون.
   4. تأكيد تدق في كانت ناجحة بالتسلسل منتجات PCR.

2-تعديل الجينات ذات أهمية بالنسبة أوبريجولاتيون بجهاز التحكم عن بعد

1. باستخدام الإرشادات أدناه، تحديد منطقة في المروج لجينات الفائدة التي من غير المحتمل أن التشويش المروج الدالة عند الإدراج تيت المشغل متواليات. يكون على بينه من المروجين بديلة للجينات للفائدة، واختر أحد المروجين وفقا transcript(s) يمكن التحكم (أي مروج تتقاسمها جميع النصوص أو واحدة محددة لنسخة المطلوب).
   1. الحصول على تسلسل الجينوم للمروج للفائدة.
      1. انتقل إلى "مستعرض الجينوم التسخن"^16،17، وحدد آخر صيغة لمشروع الجينوم الماوس (الماوس GRCm38/mm10 في وقت النشر)، وحاليا تحت علامة التبويب الجينوم .
      2. أدخل اسم أو رمز من الجينات للفائدة في شريط البحث لعرض النصوص للجينات. انقر فوق الانتقال.
      3. حدد الخيار المطلوب نسخة للجينات للفائدة.
      4. انقر فوق الرمز الجيني إلى جانب البديل نسخة من الفائدة (سوف يكون الرمز الجيني للنسخة المحددة سابقا في مربع الظلام).
      5. تحت رأيه التسلسل ووصلات إلى قواعد بيانات وأدوات ، انقر فوق الارتباط تسلسل الجينوم .
      6. استرجاع تسلسل المنطقة خيارات، حدد فقط المروج/Upstream من 1000 قواعد. للحصول على خيارات تنسيق التسلسل، حدد تكرار القناع إلى N (لإخفاء تسلسلات متكررة). ثم انقر فوق إرسال.
      7. حفظ هذا التسلسل المروج في المستند أو البرنامج الذي يمكن المشروح.
   2. حدد مناطق خالية من مواقع الربط عامل النسخ المفترضة، كمقاطعة هذه التسلسلات قد يغير التعبير الجيني الذاتية.
      1. انتقل إلى "مستعرض الجينوم التسخن"، وفتح الإصدار الأحدث من جينوم الفأر.
      2. فوق شعار رسم الخرائط، وتسلسلها ، حدد المسار محاور.
      3. انقر فوق mm10 الموجودة بجوار اسم لوحة الوصل TFBS 2018 جاسبر (أو الإصدار الأحدث جاسبر).
      4. أدخل اسم أو رمز من الجينات للفائدة في شريط البحث لعرض النصوص للجينات. انقر فوق الانتقال.
      5. حدد الخيار المطلوب نسخة للجينات للفائدة.
      6. قم بالتمرير لأسفل الشعار جاسبر 2018 TFBS ، وانقر فوق سهم القائمة المنسدلة لتحديد خيار عرض المطلوب للمسار، مثل اسحق. انقر فوق تحديث.
      7. تكبير/تصغير إلى منطقة المروج من الجينات للفائدة، وتحديد المناطق التي يتم مجاناً (أو حرة نسبيا) من مواقع الربط عامل النسخ وفقا للمسار جاسبر. تسجيل إحداثيات الصبغية لهذه المناطق.
      8. الحصول على تسلسل الجينوم هذه الإحداثيات صبغية بكتابتها في شريط البحث والنقر فوق الانتقال. في القائمة المنسدلة، حدد الحمض النووي، وانقر فوق تكرار القناع إلى N. ثم انقر فوق الحصول على الحمض النووي.
      9. تراكب هذه التسلسلات مع ملف التسلسل الأصلي، وتعليم هذه كمناطق المروج مثالية لاستهداف بسبب عدم توفر النسخ عامل ملزم.
   3. داخل هذه التسلسلات، حدد منطقة مروج بيرتوربابل التي المنبع ولكن قرب موقع بدء النسخ من الجينات للفائدة.
      ملاحظة: إدراج التي قريبة جداً من الموقع ابدأ النسخ قد تزيد من فرصة لعرقلة نشاط المروج، ولكن إدراج بعيدة جداً قد خفض مستوى أوبريجوليشن. إدراج تسلسل المشغل تيت باسيبيرس حوالي 200 المنبع لموقع بدء النسخ أدى upregulation قوية من المروجين هما اختبار (انظر مناقشة)¹⁰.
2. شاشة منطقة المروج المحدد باستخدام أداة تصميم سجرنا على شبكة إنترنت للتعرف سجرنا في المنطقة مع خصوصية عالية ودرجات الكفاءة المتوقعة.
   1. انتقل إلى أداة تصميم سجرنا عبر إنترنت لاختيار، مثل كريسبور²⁹.
   2. أدخل تسلسل منطقة اهتمام وتحديد الجينوم المرجعية ذات الصلة وحدد المطلوب بروتوسباسير المتاخمة عزر (بام). انقر فوق إرسال.
   3. فرز سجرناس تنبأ بدرجة خصوصية، وقم بتحديد واحد أو أكثر من سجرناس التي لها أيضا كفاءة المتوقعة عالية نقاط²⁹.
      1. اختياري: إلى أقصى حد احتمال استخدام سجرنا فعالة، أولاً اختبار كفاءة الانقسام لعدة سجرناس في فحص في المختبر³⁰، والمضي قدما في سجرنا أكفأ المجراة.
3. تصميم قالب الحمض النووي يحتوي على مشغلي تيت تساندها الأسلحة 60-قاعدة التماثل التي تتوافق مع سجرنا قطع الموقع^31،33على كلا الجانبين.
   ملاحظة: عدد المتعهدين تيت قابل للتخصيص؛ الإدراج من اثنين إلى أربعة تيت المشغل متواليات بالترادف ثبت سابقا أن تكون فعالة، ولكن في المبدأ مشغلي أكثر مرغوب فيه للقيادة العليا التعبير. بدلاً من ذلك، يمكن استخدام المستندة إلى ESC استراتيجية تدق في إدراج مشغلي تيت .
   1. اختياري: للأدلة التجريبية أن التعديلات المقترحة سوف المرجح أن عدم تعطيل نشاط الجينات التي تهم النسخي الذاتية، استنساخ تسلسل المروج هندسيا إلى ناقل لوسيفراس اليراع (مثل أساسية-pGL3)، و مقارنة فعاليته بالمروج الأصلي باستخدام الإنزيم لوسيفراس.
4. إعداد سجرنا والبروتين Cas9 وقالب سدنى التي تحتوي على تسلسلات المشغل تيت ، وميكروينجيكت في البيض المخصب (من B6C3F1/ياء الفئران أو غيرها السلالة المرغوبة) وفقا للبروتوكولات المعمول بها^32،33.
   ملاحظة: نظراً للطابع المعقد لتجميع تسلسل متكررة، يوصي نهج القائم على النسخ في المختبر نسخ/عكس توليف قالب سدنى من بلازميد الحمض النووي (dsDNA) مزدوجة-الذين تقطعت بهم السبل⁴⁴. بدلاً من ذلك، قد تستخدم قالب دسدنا ل microinjection، ولكن قد تكون كفاءة تدق في انخفاض⁴⁵.
5. الشاشة للفئران خبط في مشغلي تيت .
   1. تصميم [بكر] كبسولة تفجير مكملة لمحور الجينوم، خارج المناطق المستهدفة بالأسلحة التماثل. تجنب تكرار تسلسل الجينوم عند تصميم الإشعال.
   2. استخراج الحمض النووي من مقاطع ذيل الفئران وفقا للبروتوكولات المعمول بها³⁴.
   3. استخدام PCR وهلام التفريد لتحديد الفئران بإدراج مشغلي تيت .
   4. تأكيد أن تدق في كانت ناجحة بالتسلسل منتجات PCR.
      ملاحظة: الحذف الكبيرة غير المرغوب فيها وترتيبات جديدة يمكن أن تكون قدمه كريسبر/Cas9³⁵، حذراً لذا ينصح بالفحص للتحرير خارج الهدف قبل المضي^35،،من³⁶³⁷.

3-وضع المنشط--و/أو التعبير عن قامع الفئران

1. تحديد مروج تعرب عن قوة للخلايا أو tissue(s) نوع (أنواع) للفائدة.
   ملاحظة: بحث أدب و الأنسجة على حدة "المروج قاعدة"⁴⁶ قد تكون مفيدة في تحديد هذه مروج.
2. ضع قامع المحسنة قدمت أمريكا اللاتينية والكاريبي أو تسلسل المنشط تيت المصب المروج المطلوب لتوليد بنية المعدلة وراثيا.
3. إنتاج خط (خطوط) الماوس المحورة وراثيا باستخدام الإجراءات المعدلة وراثيا القياسية^42،،من⁴³⁴⁷. وبدلاً من ذلك، يمكن استخدام نهج ترانسجينيسيس الخاصة بالموقع لتجنب آثار الموقف والسماح للتحوير نسخة واحدة الإدراج^31،48.
4. نشر المؤسسين، وتحديد نمط التعبير ومستوى التحوير في ذرية كل مؤسس. حدد خطوط مع تعبير قوي في أنواع الأنسجة المقصودة لتربية المزيد.
   1. سلالة المؤسسين للفئران wildtype.
   2. تصميم كبسولة تفجير بكر أنه سيتم الكشف عن الإدراج المنشط و/أو قامع.
   3. استخراج الحمض النووي من مقاطع ذيل ذرية وفقا للبروتوكولات المعمول بها³⁴.
   4. استخدام PCR وهلام التفريد لتحديد الفئران مع الإدراج.
   5. تأكيد الإدراج التحوير بتسلسل منتجات PCR.
   6. نشر البنود المعدلة وراثيا.
   7. التضحية الجراء قليلة من كل سطر، وجمع أنسجة الفائدة قرت PCR وإيمونوهيستوتشيميستري النشاف الغربية لتحليل التعبير الجيني/البروتين الاهتمام بأنواع الأنسجة المستهدفة.
   8. حدد الأسطر مع التعبير أقوى في الأنسجة للفائدة للاستخدام في القسم 4.

4-التلاعب بالجينات الحية

1. تتكاثر الفئران بالجينات المعدلة للفائدة (القسم 1 أو 2) مع الفئران المعدلة وراثيا من الباب 3 ووفقا للممارسات المتبعة في تربية⁴⁹. لمراقبة التعبير القصوى، تولد الفئران إلى هوموزيجوسيتي اليل معدلة.
2. للعودة أو التكيف لقمع الجينات المستهدفة، إدارة إيبتج في مياه الشرب.
   1. لتحديد جرعة إيبتج لاستخدام تجريبيا، علاج الفئران الوراثي المناسب وعناصر التحكم مع واحد من مجموعة من الجرعات (يوصي ببدء مجموعة: 0 – 400 ملم إيبتج) لأسبوع واحد على الأقل^50،51. تشمل الفئران ثلاثة على الأقل من كل مجموعة العلاج، وتحديد العمر والجنس من الفئران التي الأكثر ملاءمة للتجارب المستقبلية المخطط لها. ملاحظة: يمكن علاجها تربية زوج من الفئران بالماء إيبتج على التعرض التنموية من إيبتج إلى ذرية إذا رغبت في¹³، أو الفئران يمكن أن يبدأ العلاج في أي وقت بعد الولادة.
      1. حل الشامل المنشود من إيبتج في الماء المقطر المعقم اليوم من الإدارة، ويحرك مع شريط يقلب لمدة 5 دقائق أو حتى يذوب تماما.
      2. لف الزجاجة بإحباط، وإدارة المياه إيبتج في زجاجة محمية من الضوء. استبدال مرتين في أسبوع. توفر نفس مصدر المياه لتلقي 0 ملم إيبتج الفئران.
      3. بعد أسبوع واحد على الأقل، التضحية بالفئران، وتحليل تعبير الجينات من الفائدة في tissue(s) المستهدفة باستخدام PCR قرت و immunohistochemistry النشاف الغربية.
      4. تحديد الجرعة التي يعيد التعبير عن الجينات للفائدة لأن الضوابط wildtype، واستخدام هذه الجرعات لتحقيق التعبير العادي للجينات في التجارب المستقبلية.
3. لتحريض الجينات upregulation، إدارة الدوكسي (دوكس) في النظام الغذائي.
   1. لتحديد تركيز دوكس لإدارة تجريبيا، علاج الفئران الوراثي المناسب وعناصر التحكم مع أحد تركيزات تتراوح من دوكس (يوصي ببدء مجموعة: 0-5000 ملغ/كغ هيكلاتي الدوكسيسيكلين) لأسبوع واحد على الأقل^{52 ،53}، بما في ذلك الفئران ثلاثة على الأقل من كل مجموعة العلاج. شراء دوكس المحتوية على الغذاء الماوس من مورد تجاري.
      ملاحظة: تربية زوج من الفئران يمكن أن يعاملوا معاملة دوكس من الغذاء لتوفير التنمية تعرض دوكس لذرية إذا رغبت^54،55، أو الفئران يمكن أن يبدأ العلاج في أي وقت بعد الولادة.
   2. استبدال النظام الغذائي مرة واحدة في الأسبوع. توفير نفس قاعدة النظام الغذائي للفئران تلقي أغذية خالية دوكس.
   3. بعد أسبوع واحد على الأقل، التضحية بالفئران، وتحليل تعبير الجينات من الفائدة في tissue(s) المستهدفة باستخدام qRT PCR و immunohistochemistry النشاف الغربية.
   4. تحديد الجرعة التي يرفع التعبير عن جينات الفائدة إلى المستوى المطلوب، وتستخدم هذه الجرعات لتحقيق overexpression الجينات في التجارب المقبلة.

قد تجلى قدرة القمع لنظام التحكم في نهجين مختلفين حتى الآن. في النهج الأول، أدرجت مواقع الربط قامع في أمريكا اللاتينية والكاريبي في مروج الجين Dnmt1 الذاتية. وفي النهج الثاني، الذي يوصي بهذا البروتوكول، تم إدراج مواقع الربط قامع في إنترون المتلقين للمعلومات لتجنب المخاطر المحتملة لتؤثر على وظيفة المروج بالإدراج ومن ثم تبسيط تطبيق جهاز التحكم عن بعد- النظام. كلا النهجين أدى نجاح القمع (الشكل 2أ وب ، و الشكل 3 ألف-ج)¹⁰. وكان قمع التعبير Dnmt1 إلى 15 في المائة المستويات غير المنظم باستخدام النهج القائم على مروج (الشكل 2أ). وانعكس هذا القمع ضيق بطريقة تعتمد على الجرعة بعلاج الفئران بكميات متفاوتة من إيبتج (الشكل 2أ). على مستوى البروتين يقرها إيمونوستينينج (الشكل 2ب) القمع Dnmt1 الملاحظة. ونحن لم يلاحظ أي اختلاف ملحوظ في التعبير Dnmt1 بين Dnmt1^{+ +} والفئران Dnmt1^LO/لو ، مما يؤكد أن لدينا الإدراج المشغل في أمريكا اللاتينية والكاريبي قد لم تنقطع المروج الطبيعية ¹⁰من الدالة. على النهج القائم على إنترون حققت أكثر من القمع 90% من مشغلي الموقع كيلوبس عدة مجرى النهر في موقع بدء النسخ بتخفيف النسخ استطالة (الشكل 3أ وب)¹⁰. كذلك تم التحقق من صحة هذا النهج القائم على إنترون على سبع قوي إضافية المروجين (الشكل 3ج). وقد تحقق القمع دائماً ضيقة من كل من المروجين اختبار. ولوحظ أي ارتباط بين مستويات التعبير المتبقية ومواطن القوة للمروجين، مما يوحي بأن يتجاوز قدرة نظامنا على أساس إنترون القمع القمع النسخي فاعلية كل من المروجين قوية اختبرنا ( الشكل 3 ج).

كما تجلى قدرة upregulation المجراة في نظام التحكم في الجينات Dnmt1 . قمنا بعرض نسختين من المشغل تيت في مروج Dnmt1 ، جنبا إلى جنب مع أمريكا اللاتينية والكاريبي المشغل متواليات، للسماح لأوبريجوليشن أو downregulation تبعاً للمستجيب فيها البروتين موجود. أوبريجوليشن قوية و downregulation التعبير Dnmt1 ، ما يقرب من اثنين للحجم (10% إلى 650%)، وقد تحققت في بتوليدا التي تحتوي على اليل Dnmt1 الذاتية المعدلة (Dnmt1LGT) (الشكل 4أ)¹⁰ . كل الأنظمة كانت عكسها تماما وإيندوسيبلي بالعلاجات إيبتج ودوكس، على التوالي (الشكل 4أ). القادم ادخلنا التعديل Dnmt1LGT في germline الماوس اختبار قدرة upregulation المجراة في نظام التحكم عن بعد. لوحظ upregulation قوية من Dnmt1 من الكبد، والطحال، والكلى، بينما لا يمكن كشفها upregulation في القلب لوحظ (الشكل 4ب)⁷. وقد تكمن وراء نمط التعبير دورة الخلية تعتمد على Dnmt1 وندرة الخلايا التكاثري في القلب هذه الملاحظة^10،56. فإنه يبقى أن نرى ما إذا كان يمكن التغلب على هذا القيد عن طريق زيادة مستوى التعبير المنشط أو العدد من مواقع الربط.

الشكل 2 : في فيفو القمع Dnmt1 قامع لاسيجي- الفئران (A) مع شركات أمريكا اللاتينية والكاريبي (لو) إدراجها في مروج Dnmt1 ، مع أو بدون التعبير عن لاسيجي، كانت تعالج بجرعات مختلفة من إيبتج. يبين تحليل qRT PCR التعبير Dnmt1 عكس تعتمد على جرعة Dnmt1 القمع المجراة في المعاملة إيبتج. يمثل كل شريط بيانات من ماوس مختلفة. وتمثل البيانات يعني ± ووزارة شؤون المرأة (n = 3). (ب) إيمونوستينينج Dnmt1 البروتين في أقبية colonic الفئران وفرت مياه الشرب مع أو بدون 160 مم إيبتج لمدة 3 أسابيع. وقد تم تعديل هذا الرقم من لي et al.¹⁰الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 3 : في فيفو والقمع في المختبر لمروجي مختلف بنظام التحكم عن بعد. (أ) إصدار مبكر من تسلسل ريبرون (R *) تم إدراجه في إنترون اتجاه مجرى النهر من المروج بيلين في ماوس المعدلة وراثيا بيلين-mKate2 (VilmKate2). ويبين تحليل PCR قرت التعبير mKate2 في الأمعاء الدقيقة من الفئران مع أو بدون قامع لاسيجي . يمثل كل شريط بيانات من ماوس مختلفة. (ب) الصور mKate2 [كنفوكل] من الأمعاء الدقيقة مع أو بدون لاسيجي التعبير. (ج) ستة متعهدين متماثل أمريكا اللاتينية والكاريبي (S) أدرجت بين مروجي مختلف وهو مراسل لوسيفراس. وأدخلت في المعاهد الوطنية للصحة/3T3 الخلايا بنسبة 1:1 ضرس عابر الصحفيين (50 نانوغرام/أيضا في لوحة 96-جيدا) وقامع والبلازميدات. وكانت القيم لوسيفراس ح 24 المقررة بعد تعداء. وهذه وتمثل البيانات في المختبر في المئة من التعبير لوسيفراس في لاسيجي-الإعراب عن الخلايا بالنسبة للذين يعبرون عن غير وظيفية ﻻسي (نفلاسي). واستخدمت تي-اختبارات لتحديد دلالة إحصائية. وتمثل البيانات يعني ± ووزارة شؤون المرأة (n = 3). P ≤ 0.05، * *P ≤ 0.01. وقد تم تعديل هذا الرقم من لي et al.¹⁰الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 4 : أسفل-و/أو upregulation من التعبير Dnmt1 في المختبر والمجراه في. (أ) تم تصميم نظام التحكم الكامل في بتوليدا المستزرعة باستهداف الجين والنهوج انهانسر. وقد تحقق القمع القصوى للتعبير Dnmt1 مع عدم المعالجة بينما تحقق تفعيل قصوى بالعلاج إيبتج ودوكس. وتمثل البيانات يعني ± ووزارة شؤون المرأة (n = 3). P ≤ 0.05، * *P ≤ 0.01 (وولش تي-الاختبارات). (ب) المجراة في تفعيل Dnmt1 بنظام التحكم عن بعد، كما تجلى immunostaining Dnmt1 البروتين في أنسجة مختلفة من الفئران جهاز التحكم عن بعد. اليل LGT يمثل تعديل مروج Dnmt1 تحتوي على مواقع الربط المنشط المشغل و تيت أمريكا اللاتينية والكاريبي . وعولج الفئران مع اتباع نظام غذائي عادي أو المحتوية على دوكس (5000 ملغ/كغ هيكلاتي الدوكسيسيكلين) لمدة شهر واحد. وقد تم تعديل هذا الرقم من لي et al.¹⁰الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

التكميلية رقم 1 : مثال للهبوط لوحة الإدخال إلى مورين إنترون Dnmt1 1- (أ) التخطيطي لقالب الحمض النووي لهبوط الإدراج لوح، مقتبس من ذلك et al. (2015)³¹. مواقع الغيروية لوكسب ، JT15، و Lox2272، مفصولة بواسطة فاصلة قصيرة تسلسل (sp) وتساندها 60-بي بي للحمض النووي الذي مثلى للمنطقة المستهدفة الجينوم على كل جانب. (ب) عينة الحمض النووي قالب للهبوط لوحة الإدخال إلى إنترون Dnmt1 باستخدام سجرنا التالية: كتاجتاككاكتككتجتاككج (الذي يستهدف حبلا العكسية). المنطقة المحددة إينترونيك بيوينفورماتيكالي أبلغ من الخطوة 1، 1، وحددت سجرنا استخدام كريسبور²⁹. (ج) مثال على بكر التصميم التمهيدي لتقييم إدراج منصة الهبوط. صممت [بكر] كبسولة تفجير خارج الأسلحة التماثل من القالب للتأكد من إدماج الذاتية Dnmt1. أمبليكون بكر wildtype هو 213 bp؛ عند الإدراج، يصبح 291 هناك الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الخطوة الحاسمة، والقيد المحتملة من نظام التحكم هو التحدي المرتبطة بالإدراج قامع و/أو مواقع ربط المنشط دون التأثير على الجينات المستهدفة. لدينا نهج القمع الأصلي، كما هو مطبق على الجينات Dnmt1 ، تشارك إدراج مواقع الربط قامع لاك داخل المناطق الحرجة ترانسكريبتيونالي من مروج. من أجل الحد من المخاطر التي تؤثر على وظيفة المروج ومن ثم تحسين التطبيق العام لنظام التحكم عن بعد، وقمنا بتطوير نهج القائم على إنترون قمع. فاعلية نظامنا المحسن لاك سمح لنا بأحكام قمع النسخ جميع المروجين القوى اختبرنا في مشغلي الموقع مئات إلى عدة كيلوبس المصب من النسخ بدء تشغيل مواقع (الشكل 3أ – ج) ¹⁰-الأهم من ذلك، كانت مستويات القمع مستقلة من مواطن قوة النسخي المروجين (الشكل 3أ – ج)¹⁰. وهذا يوحي بأن يتجاوز قدرة نظامنا على أساس إنترون القمع القمع القوام النسخي المروجين اختبارها. في هذا النهج القائم على إنترون، فمن المرجح أن القمع هو يتوسط من خلال التدخل المادي بين عنصرين واستطالة النسخ إليه و ريبريسورس في أمريكا اللاتينية والكاريبي⁵⁷. هذه الآلية البسيطة القمع وأظهرت متانة الأسلوب القائم على إنترون، قد تجعل هذا النهج المطبقة عموما على جينات مختلفة، والأنسجة، والكائنات الحية.

أوبريجوليشن بنظام التحكم عن بعد يتطلب تسلسل الملزمة ترانساكتيفاتور لتكون على مقربة من المروج الجينات المستهدفة، التي تنطوي على خطر التأثير على وظيفة المروج. ومع ذلك، وجدنا أن موقف ملزم تسلسل يمكن أن تكون خارج المنطقة الحرجة ترانسكريبتيونالي. وكانت المروجين Dnmt1 و EF1α قوة upregulated من مشغلي تيت تقع بضع مئات القواعد المنبع ل مواقع بدء النسخ¹⁰. هذا القيد استرخاء يقلل كثيرا من فرصة التأثير على مروج وظيفة الجينات المستهدفة في غياب ترانساكتيفاتور. زيادة عدد ربط تسلسل و/أو استخدام ترانساكتيفاتورس أقوى يمكن أن يساعد على زيادة خفض الخطر عن طريق تمكين upregulation من مواقع بعيداً عن موقع بدء النسخ.

لدينا نظام التحكم عن بعد يوفر تحكم أنيقة مستوى وتوقيت وموقع التعبير الجيني الذاتية، مما يسمح لاختبار إمكانية الرجوع من النمط الظاهري والمترتبة على مستويات مختلفة من التعبير، التي لا يسهل تحقيقها الحالي في تكنولوجيات التحكم تعبير الجينات فيفو. من المهم ملاحظة أن قيم التعبير في معظم التحليلات التعبير الجيني، بما في ذلك بلدنا، يمثل متوسط عدد سكان خلايا بينها تباين كبير ويمكن الاطلاع على. قد يؤثر هذا التغاير الخلوية عمليات صنع القرار، مثل التفريق أو المبرمج⁵⁸. على الرغم من أن يمكن المحتمل أن زيادة تحسين الدقة في التعبير الجيني التحكم بالدائرة الوراثية الإضافية هندسة⁵⁹، لوحظت فاعلية نظامنا الحالي سيسمح التحقيق مفيدة لوظيفة الجينات في العديد من السياقات البيولوجية. وبالإضافة إلى ذلك، من المتوقع بدرجة عالية من الدقة المستهدفة بسبب تعقيد تسلسل عامل، فضلا عن المسافة تطورية كبيرة بين الثدييات والأنواع الأصلية من المكونات التنظيمية⁶⁰. وعلاوة على ذلك، يمكن وضع خطوط الماوس المعدلة وراثيا ريبريسورس والمنشطات وتوظيفهم لأي الجينات الذاتية. على سبيل المثال، يمكن تكييفها مع نماذج الماوس ترانساكتيفاتور تيت الحالية لإنجاز upregulation الجينات المستهدفة في أنسجة الماوس المطلوب. ونحن مؤخرا بوضع خط المعدلة وراثيا التي يمكن أن تدفع قوي الأنسجة على حدة التعبير عن قامع لاك تعزيز جهودنا في العديد من أنواع الأنسجة عندما جنبا إلى جنب مع الخطوط العرقية القائمة بإدخال الجين لاسيجي في محور Hipp11 ⁴⁸ الخاضعة لسيطرة عنصر لوكس-توقف-لوكس (غير منشور). هذا الخط سيسهل إلى حد كبير تطبيق نظام التحكم عن بعد الخاصة بالانسجة.

أوبريجوليشن الجينات بنظام التحكم عن بعد يوفر العديد من المزايا مقارنة بالنهج الحالية المعدلة وراثيا إيندوسيبلي. أنها لا تتطلب جيل من عدة أسطر المحورة وراثيا لاختبار تأثيرات الموقف من الإدراج، كما أنه يستخدم محور الذاتية. بالإضافة إلى ذلك، هذا النهج مناسبة تماما ل upregulation جينات مع التعبير الأساس القوى لأنه يعزز التعبير من مروج الفعل قوية، بينما النماذج المعدلة وراثيا التقليدية تعتمد على الحد الأدنى من المروجين الفيروسية. وأخيراً، الأنسجة خصوصية ومراقبة دورة الخلية، وذو المتغيرات الجينات المستهدفة قد يكون الاحتفاظ عند upregulation من نهجنا، كما أنه يحافظ على عناصر التنظيم الطبيعي مثل الفطرية رابطة الدول المستقلة-العناصر التنظيمية. ظهور كريسبر/Cas-بوساطة تكنولوجيا الجينات استهداف سيسهل تطبيق هذه التكنولوجيا في نظم نموذجية متنوعة.

PWL عضو في المجالس الاستشارية العلمية أنتشوردكس وبروجينيتي، وشركة

ونحن نشكر الراحل الدكتور هايدي سكرابل لها هدية سخية لبناء الجينات ﻻسي الثدييات (كلينك، روتشستر، مينيسوتا)، الدكتور دانيال لوفارد (معهد كوري، باريس، فرنسا) لتوفير المروج بيلين، والدكتور لوري جاكسون-جروسبي (مستشفى للأطفال، بوسطن، ماجستير) لاسهاماتها في المراحل المبكرة من هذا التطور التكنولوجي. ونحن ممتنون للدكتورة نانسي وو، والدكتور روبرت ماكسسون لمساعدتها في توليد الفئران المحورة وراثيا والضربة القاضية. ونشكر أعضاء المختبر ليرد لإجراء مناقشات مفيدة ودعم. وأيد هذا العمل "المعاهد الوطنية للصحة" [R01 CA75090 R01 DA030325، R01 CA157918 و R01 CA212374 إلى P.W.L. و 1F31CA213897-01A1 إلى N.A.V.S].