البروتينات التحليل المناعي من الداخلية والخارجية السنترومير-الحيز الحركي

Here we report protocols to detect endogenous and exogenous centromere-kinetochore proteins in human cells and quantify these protein levels at centromeres-kinetochores by indirect immunofluorescent staining through the use of fixation (paraformaldehyde, acetone, or methanol fixation).

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of centromere-kinetochore proteins during the cell cycle remains a fundamental tool in investigating the mechanism(s) of these proteins. Advanced imaging methods in fluorescence microscopy provide remarkable resolution of centromere-kinetochore components and allow direct observation of specific molecular components of the centromeres and kinetochores. In addition, methods of indirect immunofluorescent (IIF) staining using specific antibodies are crucial to these observations. However, despite numerous reports about IIF protocols, few discussed in detail problems of specific centromere-kinetochore proteins.^1-4 Here we report optimized protocols to stain endogenous centromere-kinetochore proteins in human cells by using paraformaldehyde fixation and IIF staining. Furthermore, we report protocols to detect Flag-tagged exogenous CENP-A proteins in human cells subjected to acetone or methanol fixation. These methods are useful in detecting and quantifying endogenous centromere-kinetochore proteins and Flag-tagged CENP-A proteins, including those in human cells.

وحددت "القسيم" الكلاسيكي كما مناطق إعادة التركيب الانتصافي قمعت في مجال علم الوراثة واعترف فيما بعد انقباض الأساسي من الكروموسومات الإنقسامية، والتي تلعب دورا أساسيا في فصل كروموسوم دقيقة أثناء الانقسام. وصفت "Kinetochores" مثل الهياكل متعددة الطبقات التي ترتبط الأنابيب الدقيقة على سطح القسيم، كما يتضح من المجهر الإلكتروني. تم تعريف "kinetochores" فيما بعد باسم معقد جزيء أن يموضع في السنترومير من الكروموسومات الإنقسامية. وعلى الرغم من الاختلاف الكبير في تسلسل الحمض النووي القسيم المركزي بين الفقاريات، هيكل الحيز الحركي والتكوين يتم حفظها للغاية. مطلوب التفاعل الديناميكي بين ميكروتثبول المغزل والحيز الحركي للفصل المؤمنين من الصبغيات أثناء الانقسام، والعيوب في السنترومير-الحيز الحركي وظيفة يؤدي إلى عدم توازن الصبغيات وبالتالي السرطان.

السنترومير في معظم حقيقيات النوىلا يوجد لديه تسلسل الحمض النووي محددة، ولكن يتكون من صفائف كبيرة (0،3-5 ميجا بايت) من الحمض النووي alphoid المتكررة التي تتكون من 171-BP الحمض النووي α قنوات فضائية. إلا في مهدها الخميرة، ويتحقق هوية السنترومير وليس عن طريق تسلسل الحمض النووي ولكن من خلال وجود جسيم نووي الخاصة التي تحتوي على هيستون H3 البديل CenH3 (السنترومير البروتين A [CENP-A] في البشر). ⁵ CENP-A جسيم نووي توطين ل لوحة الداخلية kinetochores الثدييات ⁷ و ربط على الحمض النووي α-الأقمار الصناعية 171-BP. تتطلب القسيم النشطة CENP المحتوية على وجسيم نووي لتوجيه توظيف شبكة التأسيسية المرتبطة السنترومير (CCAN) والبروتينات الحيز الحركي، التي تنظم معا المرفق من الكروموسومات إلى المغزل الإنقسامية وتقدم دورة لاحقة عبر حاجز المغزل.

في ضوء الأدلة أعلاه، فقد اقترح CENP-A ليكون علامة جينية من السنترومير ^8؛ ومع ذلك، فإن العملية التي يتم تضمينها CENP-A طn لالحمض النووي القسيم المركزي والعوامل المسؤولة عن هذا التأسيس حتى الآن لم يتم توصيفه جيدا. ونطاق استهداف السنترومير قصيرة (CATD) يقيم في هيستون أضعاف منطقة CENP-A، واستبدال المنطقة المقابلة من H3 مع CATD كافية لH3 المباشر إلى السنترومير، واقترحت ⁹ دراسات عدة أدوار وظيفية لمرحلة ما بعد متعدية تعديل (PTM) من CENP-A ^12-16. ومع ذلك، لم يتم بعد إجمال الآليات الجزيئية لهذه PTMs من CENP-A في التوظيف لالقسيم. ذكرنا سابقا أن CUL4A-RBX1-COPS8 E3 النشاط يغاز مطلوب للCENP-A K124 ubiquitylation وتوطين CENP-A إلى القسيم ¹⁷

وقد أدى اكتشاف وتوصيف البروتينات الحيز الحركي إلى رؤية جديدة بشأن العزل الصبغي. وقد تم تحديد ¹⁸ أكثر من 100 من عناصر الحيز الحركي في خلايا الفقاريات التي كتبها نهج مختلف. ^19،20 وكيلمكانة كيفية تجميع kinetochores وظيفة تأتي أيضا من توصيف الوظائف الخلوية من كل شبكة البروتينات الحيز الحركي-السنترومير والبروتين البروتين داخل الخلايا. ¹⁹ التصور المباشر والتصوير المتقدمة الأساليب في مضان المجهري توفر قرار ملحوظا من مكونات السنترومير الحيز الحركي وتسمح الملاحظة المباشرة من مكونات جزيئية معينة من القسيم وkinetochores. وبالإضافة إلى ذلك، أساليب مناعي غير مباشر (معهد التمويل الدولي) تلطيخ باستخدام أجسام مضادة محددة ذات أهمية حاسمة لهذه الملاحظات. ومع ذلك، على الرغم من العديد من التقارير حول بروتوكولات معهد التمويل الدولي، وعدد قليل مناقشتها في مشاكل التفاصيل بروتينات معينة، السنترومير الحيز الحركي ^1-4 وهكذا، وتطوير وسائل معهد التمويل الدولي تلطيخ وفحص معهد التمويل الدولي الكمي التقارير إلى تحليل تحديدا كل من البروتين السنترومير الحيز الحركي أمر مهم للغاية. في معهد التمويل الدولي تلطيخ، ينبغي للمرء أن المضي قدما في بروتوكول تلطيخ لتجنب فقدان البروتين في المصالح أوبقية الخلية. ومع ذلك، تثبيت يدمر مواقع المستضدات في بعض الأحيان، ومختلف مجموعات الضد مستضد عمل سيئة مع تثبيتي واحد، ولكن بشكل جيد جدا مع آخر، ²¹ واختيار تثبيتي يعتمد إلى حد كبير على البروتين (ق) من الفائدة. لذلك، وأساليب مختلفة تثبيتي حاسمة في تلطيخ معهد التمويل الدولي من البروتينات السنترومير الحيز الحركي.

وقد تم تطوير أساليب هنا الأمثل للمناعي غير مباشر (معهد التمويل الدولي) تلطيخ ومقايسة لمعالجة توطين البروتينات السنترومير الحيز الحركي الذاتية، بما في ذلك CENP-A والعلم الموسومة الخارجية البروتينات CENP-A، والكميات من هذه البروتينات في الخلايا البشرية. ويمكن تطبيق هذه الأساليب لتحليل البروتينات السنترومير الحيز الحركي في الأنواع الأخرى.

1. خلية الثقافة وترنسفكأيشن

1. وضع غطاء زجاجي (22 ملم × 22 ملم) في لوحة البوليسترين 6 جيدا. معطف اختياريا غطاء زجاجي مع بولي-L-ليسين، 0.1٪ ث / ت، في الماء (انظر قائمة المواد / المعدات) للحفاظ على الخلايا الإنقسامية على الزجاج غطاء باتباع الخطوات التالية:
   ملاحظة: يجب تحديد الظروف المثلى لكل خط الخلية والتطبيق.
   1. جو معقم و مطهر سطح الثقافة معطف مع بولي-L-ليسين، 0.1٪ ث / ت، في الماء (0.4 مل / بئر لوحة 6 جيدا البوليسترين). صخرة بلطف لضمان حتى طلاء السطح الثقافة.
   2. بعد 5 دقائق، وإزالة حل بواسطة طموح ويشطف جيدا السطح مع الأنسجة المعقمة للمياه ثقافة الصف.
   3. الجافة على الأقل 2 ساعة قبل إدخال الخلايا والمتوسطة.
2. البذور خلايا هيلا هيلا ¹⁷ أو تيت أوف خلايا ^17،22 على غطاء زجاجي (22 ملم × 22 ملم) وضعها في لوحة البوليسترين 6 جيدا. تأكد من أن كثافة الخلية هي 5.4 × 10 ⁵ لكل بئر. الخلايا ثقافةفي DMEM عالية الجلوكوز مع FBS 10٪ و 1٪ البنسلين ستربتومايسين.
   ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج، وتحديد تجريبيا كثافة الخلايا لاستخدامها في البذر.
3. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في جو من 5٪ CO ₂ لمدة 18 ساعة.
   ملاحظة: في حالة من خلايا هيلا تيت أوف، نسخ من الجين خارجي نشطا في غياب محفز (أي، التتراسيكلين / الدوكسيسيكلين) لذا الخلايا ثقافة دون التتراسيكلين / الدوكسيسيكلين وtransfect عابر مع ناقلات overexpression pTRM4 (الجدول 2 )، الذي ينظمه المروج TRE النسخ (أنظر أدناه).
4. ثمانية عشر ساعة بعد خلايا البذر، transfect على النحو التالي:
   1. جعل حل وعن طريق خلط 1.5 ميكرولتر سيرنا بنسبة ضئيلة (20 ميكرومتر الأسهم صلب، الجدول 1) و / أو 2.0 ميكروغرام البلازميد (الجدول 2) في 50 ميكرولتر خفض سيرم (انظر قائمة المواد / المعدات)، واحتضان في RT لمدة 5 دقائق .
      ملاحظة: في هذا التحليل،وكان شارك في transfected لاستخدامها في بروتوكولات 3 و 4 (انظر مناقشة)؛ CA-UTR الرناوات siRNAs (الجدول 1 خليط من 5 'و 3' UTR سيرنا).
   2. جعل حل B عن طريق خلط 0.75 ترنسفكأيشن كاشف ميكرولتر أنا (انظر قائمة المواد / المعدات) في 50 ميكرولتر انخفاض متوسط ​​مصل، واحتضانها في RT لمدة 5 دقائق.
      ملاحظة: خطوة اختيارية هي إضافة 1.0 ميكرولتر ترنسفكأيشن الكاشف الثاني (انظر قائمة المواد / المعدات).
   3. مزيج حلول A و B معا، واحتضانها في RT لمدة 15 دقيقة.
   4. غسل الخلايا المستزرعة مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني، ثم إضافة 500 ميكرولتر خفض سيرم إلى كل بئر من لوحة البوليسترين 6 جيدا. يضاف خليط من الحلول A و B (أي RNA و / أو مجمع الحمض النووي الدهون) مباشرة إلى كل من الفرد أيضا.
      ملاحظة: التركيز النهائي هو 3.3 ميكروغرام / مل (البلازميد)؛ 50 نانومتر (سيرنا).
   5. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في جو من 5٪ CO ₂ ل 4.5 ساعة. تغيير متوسطة إلى عالية الجلوكوز DMEM خفة دمح 10٪ FBS و 1٪ البنسلين ستربتومايسين.
   6. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في جو من 5٪ CO ₂ ل48-72 ساعة بعد ترنسفكأيشن.
      ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج، وفترة حضانة لنمو الخلايا قبل التثبيت يجب أن يتحدد تجريبيا، واستنزاف البروتين و / أو يجب تأكيد التعبير عن طريق تحليل لطخة غربية (انظر بروتوكول 6).
   7. إذا تحليل الخلية الإنقسامية هو من الفائدة، إضافة باكليتاكسيل (10 نانومتر) إلى الخلايا المستزرعة 24 ساعة قبل التثبيت، أو إضافة TN16 (0.5 ميكرومتر) إلى الخلايا المستزرعة 2.5 ساعة قبل التثبيت.

2. خلية التثبيت ومناعي تلطيخ لكشف البروتينات الذاتية السنترومير-الحيز الحركي (امتصاص العرق التثبيت)

1. إعداد تثبيتي، ومخازن، والكواشف.
   1. حديثا تجهيز 50 مل من محلول بارافورمالدهيد 4٪ في برنامج تلفزيوني، ودرجة الحموضة 7.4.
      1. إضافة 40 مل من 1 × PBS إلى دورق زجاجي على طبق من ضجة في غطاء التهوية. الحرارة في حين stirrinز إلى ما يقرب من 60 درجة مئوية. إضافة 2 غرام من مسحوق امتصاص العرق إلى برنامج تلفزيوني ساخنة.
      2. رفع ببطء درجة الحموضة بإضافة 1 مل من 1 N هيدروكسيد الصوديوم في المجموع، لأن مسحوق لم تنحل فورا.
         ملاحظة: الحل يزيل بعد إضافة هيدروكسيد الصوديوم.
      3. مرة واحدة قد حلت امتصاص العرق، بارد وتصفية الحل.
      4. ضبط درجة الحموضة مع 1 N حمض الهيدروكلوريك إلى 7.4 درجة الحموضة وحجم حل مع 1 × PBS إلى 50 مل.
         ملاحظة: أجزاء مأخوذة من الحل يمكن تجميد أو تخزينها في 2-8 درجة مئوية لمدة طالما 1 أسبوع. وينبغي أن يكون الحل من الجليد البارد أو تخزينها في 4 درجة مئوية حتى يصبح لاستخدامها.
   2. تجهيز 50 مل من KB1 العازلة، والذي يتألف من 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.5. 150 ملي مول كلوريد الصوديوم. 0.5٪ BSA. و 0.5٪ تريتون X-100.
      ملاحظة: BSA ينبغي أن تضاف حديثا.
      ملاحظة: المخزن المؤقت KB سلسلة تستند KB عازلة وصفها في التقارير السابقة ^1،2،4.
   3. تجهيز 50 مل من KB2 العازلة، والذي يتألف من 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك،7.5 درجة الحموضة. 150 ملي مول كلوريد الصوديوم. و 0.5٪ BSA.
      ملاحظة: BSA ينبغي أن تضاف حديثا.
   4. إعداد 1 مل من KB3 العازلة التي تحتوي على دابي (50 نانوغرام / مل).
   5. إعداد 100 مل من تصاعد المتوسط، والذي يتكون من 1 ملغ / مل ف phenylenediamine. 10٪ في برنامج تلفزيوني، و 90٪ الجلسرين.
      1. ضبط درجة الحموضة من 1 × برنامج تلفزيوني إلى 9.8 مع 1 N هيدروكسيد الصوديوم، حل ف phenylenediamine في الحل، ثم قم بإضافة الجلسرين.
      2. مخزن 1 مل aliquots في -80 درجة مئوية. يحفظ بعيدا عن الضوء.
2. إزالة مستنبت بواسطة الطموح في 48-72 ساعة بعد ترنسفكأيشن (انظر البروتوكول 1) لتثبيت الخلية. خلايا شطف مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني. تطبيق برنامج تلفزيوني إلى جانب الآبار ثقافة لتجنب إزعاج سطح الخلايا.
   ملاحظة: يجب تحديد نقطة زمنية المثلى لتثبيت الخلية تجريبيا.
3. إصلاح الخلايا في بارافورمالدهيد 4٪ في برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية. شطف الخلايا مرتين مع KB2 عازلة لإزالة بما فيه الكفاية المتبقية 4٪ لامتصاص العرق.
4. Permeabiليز العينات في KB1 عازلة لمدة 30 دقيقة في RT. شطف خلايا مرة واحدة مع KB2 العازلة، وإضافة KB2 عازلة لمدة 5 دقائق على RT لمواقع كتلة إضافية من ملزمة انوعي.
   ملاحظة: المخزن المؤقت KB1 أيضا يساهم بشكل كبير في عرقلة.
5. إزالة الغطاء الزجاجي (22 ملم × 22 ملم) من لوحة البوليسترين 6-جيدا باستخدام ملقط. بمانع القلم مسعور (انظر قائمة المواد / المعدات)، رسم مربع أخضر شاحب أو دائرة لتشكيل حاجز مسعور حول كل عينة غطاء زجاجي. لا تلمس أو الاقتراب جدا من الخلايا التي تحتوي على قلم حاجز مسعور. وضع غطاء زجاجي في 6 جيدا جديدة لوحة البوليسترين.
6. تمييع الأجسام المضادة الأولية لالسنترومير أو البروتين الحيز الحركي (نسبة التخفيف من 1: 100 إلى 1: 200؛ وانظر أيضا قائمة من المواد / المعدات) وإما الأجسام المضادة لمكافحة CENP-B (نسبة التخفيف من 1: 400) أو المضادة السنترومير الأجسام المضادة (ACA) (نسبة التخفيف من 1: 2000) كعلامة السنترومير موقع في KB2 العازلة.
   ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج، وconcentra النهائييجب تحديد نشوئها من الأجسام المضادة الأولية في هذا الحل تجريبيا.
7. تطبيق كمية كافية (حوالي 30 ميكرولتر) من الأجسام المضادة الأولية المخفف لتزج عينة الخلية. احتضان عينة الخلايا لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. شطف الخلايا 3 مرات مع KB2 العازلة.
8. باستخدام KB2 عازلة، تمييع الضد الثانوي fluorophore مترافق (نسبة التخفيف من 1: 100-1: 200) موجهة ضد كل الأجسام المضادة الأولية.
   ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج، لا بد من تحديد تركيز النهائي من الأجسام المضادة الثانوية في هذا الحل تجريبيا.
9. تطبيق حجم كاف (قطرة من كاليفورنيا 30 ميكرولتر على غطاء زجاجي) من الأجسام المضادة الثانوية المخفف لتزج عينة الخلية. احتضان عينة الخلايا لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. شطف الخلايا 5 مرات مع KB2 العازلة خلال فترة 30 دقيقة (خمسة 6 يغسل دقيقة).
   ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج (أي لفقدان الحد الأدنى من الخلايا)، وحالة غسل الأمثل يجب أن يتحدد empiricaLLY.
10. تطبيق حجم كاف من KB3 العازلة التي تحتوي على دابي (50 نانوغرام / مل) أن تزج عينة الخلية. احتضان عينة خلية لمدة 5 دقائق على RT. شطف خلايا 1-2 مرات مع KB2 العازلة.
11. تركيب الغطاء الزجاجي الذي يحتوي على عينة الخلايا على الشريحة الصغيرة.
    1. ضع قطرة من تصاعد المتوسطة في وسط الشريحة الصغيرة.
    2. إزالة السائل من عينة الخلية، وباستخدام اليدين أو ملقط، ضع العينة في وسط الشريحة الصغيرة. تجنب فقاعات الهواء.
    3. إزالة المتوسطة المتزايدة الزائدة مع منشفة ورقية.

3. خلية التثبيت ومناعي تلون C-محطة الموسومة العلم CENP-A البروتينات (الأسيتون التثبيت)

1. تجهيز
   1. إعداد المثلج 75٪ الأسيتون.
   2. حديثا تجهيز 50 مل من برنامج تلفزيوني (الرقم الهيدروجيني 7.4) التي تحتوي على الحليب الخالي من الدسم 0.5٪ و 0.5٪ BSA.
   3. حديثا تجهيز 50 مل من برنامج تلفزيوني (الرقم الهيدروجيني 7.4) التي تحتوي على الحليب الخالي من الدسم 0.1٪ و 0.1٪ BSA.
   4. إعداد 1 مل من برنامج تلفزيوني (ودرجة الحموضة 7.4) التي تحتوي على دابي (50-100 نانوغرام / مل).
   5. إعداد 100 مل من تصاعد المتوسط ​​كما هو موضح في 2.1.5.
2. إزالة مستنبت بواسطة الطموح في 48-72 ساعة بعد ترنسفكأيشن (انظر البروتوكول 1) لتثبيت الخلية. خلايا شطف مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني. تطبيق برنامج تلفزيوني إلى جانب البئر ثقافة لتجنب إزعاج سطح الخلايا.
   ملاحظة: يجب تحديد نقطة زمنية المثلى لتثبيت الخلية تجريبيا.
3. إصلاح الخلايا في الجليد الباردة 75٪ الأسيتون، واحتضان الخلايا لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة -20 درجة مئوية. الخلايا الجافة على الغطاء الزجاجي في غطاء الدخان لمدة 30-60 دقيقة في RT.
   ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج، لا بد من تحديد المدة الزمنية اللازمة لتثبيت وخلية تجفيف تجريبيا.
4. باستخدام حاجز القلم مسعور (انظر قائمة المواد / المعدات)، رسم مربع أخضر شاحب أو دائرة لتشكيل حاجز مسعور حول كل عينة غطاء زجاجي. لا تلمس أو الاقتراب جدا من الخلايا التي تحتوي على قلم حاجز مسعور.
5. كتلة nonspecIFIC مواقع على الخلايا ملزمة بإضافة برنامج تلفزيوني يحتوي الحليب الخالي من الدسم 0.5٪ و 0.5٪ BSA لمدة 5 دقائق على RT.
6. باستخدام برنامج تلفزيوني يحتوي الحليب الخالي من الدسم 0.1٪ و 0.1٪ BSA، وتمييع الأجسام المضادة ضد العلم (1: 1000 نسبة التخفيف) وإما الأجسام المضادة لمكافحة CENP-B (نسبة التخفيف من 1: 200) أو هيئة مكافحة الفساد (نسبة 1: 2000 تخفيف ) كعلامة السنترومير الموقع.
   ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج، لا بد من تحديد تركيز النهائي من الأجسام المضادة الأولية في هذا الحل تجريبيا.
7. تطبيق كمية كافية (حوالي 30 ميكرولتر) من الأجسام المضادة الأولية المخفف لتزج عينة الخلية. احتضان عينة الخلايا لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. شطف الخلايا 5 مرات مع عازلة تمنع خلال فترة 30 دقيقة.
   ملاحظة: يمكن أن تشطف الخلايا مع برنامج تلفزيوني. لأفضل النتائج (أي، لتجنب فقدان الخلايا)، يجب أن تحدد الشروط غسل الأمثل تجريبيا.
8. تمييع الضد الثانوي fluorophore مترافق (نسبة التخفيف من 1: 100-1: 200) موجهة ضدعلى كل الأجسام المضادة الأولية في برنامج تلفزيوني يحتوي الحليب الخالي من الدسم 0.1٪ و 0.1٪ BSA.
   ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج، لا بد من تحديد تركيز النهائي من الأجسام المضادة الثانوية في هذا الحل تجريبيا.
9. تطبيق كمية كافية (حوالي 30 ميكرولتر) من الأجسام المضادة الثانوية المخفف لتزج عينة الخلية. احتضان عينة الخلايا لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. شطف الخلايا 2 مرات مع برنامج تلفزيوني يحتوي الحليب الخالي من الدسم 0.1٪ و 0.1٪ BSA.
   ملاحظة: برنامج تلفزيوني وحدها يمكن أن تستخدم أيضا لغسل الخلايا.
10. تطبيق حجم كاف من برنامج تلفزيوني تحتوي على دابي (50-100 نانوغرام / مل) أن تزج عينة الخلية. احتضان عينة خلية لمدة 5 دقائق على RT. شطف خلايا 1-2 مرات مع برنامج تلفزيوني.
11. تركيب الغطاء الزجاجي الذي يحتوي على عينة الخلايا على الشريحة الصغيرة كما هو موضح في 2.11.

4. خلية التثبيت ومناعي تلطيخ من N-محطة الموسومة العلم CENP-A البروتينات (الميثانول التثبيت)

1. تجهيز
   1. تحضير الميثانول الجليد الباردة.
   2. إعداد TBS (الرقم الهيدروجيني 7.4) التي تحتوي على 4٪ مصل الماعز.
   3. إعداد 1 مل من TBS (الرقم الهيدروجيني 7.4) التي تحتوي على دابي (50-100 نانوغرام / مل).
   4. إعداد 100 مل من تصاعد المتوسط ​​كما هو موضح في 2.1.5.
2. إزالة مستنبت بواسطة الطموح في 48-72 ساعة بعد ترنسفكأيشن (انظر البروتوكول 1) لتثبيت الخلية. خلايا شطف مرة واحدة مع TBS. تطبيق TBS إلى جانب الآبار ثقافة لتجنب إزعاج سطح الخلايا.
   ملاحظة: يجب تحديد نقطة زمنية المثلى لتثبيت الخلية تجريبيا.
3. إصلاح الخلايا في الميثانول الجليد الباردة، واحتضان الخلايا لمدة 6 دقائق عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. شطف الخلايا مرتين مع TBS لإزالة بما فيه الكفاية الميثانول المتبقية.
4. بمانع القلم مسعور (انظر قائمة المواد / المعدات)، رسم مربع أخضر شاحب أو دائرة لخلق حاجز مسعور حول كل عينة غطاء زجاجي. لا تلمس أو الاقتراب جدا من الخلايا التي تحتوي على قلم حاجز مسعور.
5. حجب المواقع ملزمة غير محددة على سلليرة سورية وذلك بإضافة TBS تحتوي على 4٪ مصل الماعز. احتضان لمدة 10 دقيقة في RT.
6. تمييع الأجسام المضادة ضد العلم (1: 1000 تمييع) وإما الأجسام المضادة لمكافحة CENP-B (نسبة التخفيف من 1: 200) أو هيئة مكافحة الفساد (1: 2000 نسبة تمييع) باعتباره السنترومير موقع علامة في TBS تحتوي على 4٪ مصل الماعز .
   ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج، لا بد من تحديد تركيز النهائي من الأجسام المضادة الأولية في هذا الحل تجريبيا.
7. تطبيق كمية كافية (حوالي 30 ميكرولتر) من الأجسام المضادة الأولية المخفف لتزج عينة الخلية. احتضان عينة الخلايا لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. شطف الخلايا 5 مرات مع عازلة تمنع خلال فترة 30 دقيقة. لأفضل النتائج (أي فقدان الحد الأدنى من الخلايا)، لا بد من تحديد حالة غسل الأمثل تجريبيا.
8. تمييع الضد الثانوي fluorophore مترافق (نسبة التخفيف من 1: 100-1: 200) موجهة ضد كل الأجسام المضادة الأولية في TBS تحتوي على 4٪ مصل الماعز.
   ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج، والاتحاد الدولي للسباحةيجب تحديد تركيز لتر من الأجسام المضادة الثانوية في هذا الحل تجريبيا.
9. تطبيق كمية كافية (حوالي 30 ميكرولتر) من الأجسام المضادة الثانوية المخفف لتزج عينة الخلية. احتضان عينة الخلايا لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. شطف الخلايا 3 مرات مع العازلة الحجب.
10. تطبيق حجم كاف من TBS تحتوي على دابي (50-100 نانوغرام / مل) أن تزج عينة الخلية. احتضان عينة خلية لمدة 5 دقائق على RT. شطف خلايا 1-2 مرات مع TBS.
11. تركيب الغطاء الزجاجي الذي يحتوي على عينة الخلايا على الشريحة الصغيرة كما هو موضح في 2.11.

5. المناعي صورة للمراقبة، شراء، الكميات، وتحليل

1. مراقبة عينة الخلية من خلال المجهر مضان الآلية مجهزة عدسة 63X 100X والغمر النفط، مصدر خارجي ضوء المدمجة، وكاميرا CCD الرقمية.
2. أداء الحصول على الصور ومعالجتها، بما في ذلك deconvolution، باستخدام البرمجياتA، أو برامج B1 و B2 (انظر قائمة المواد / المعدات). يرجى الاطلاع التكميلي Files الرمز (5.2.1) لجميع الأوامر المستخدمة في البرامج A. لجميع الأوامر المستخدمة في برامج B1 و B2، يرجى الاطلاع على (5.2.2) في ملفات التعليمات البرمجية التكميلي.
3. استخدام الأسلوب هو موضح سابقا ^23-25 ​​لتحديد إشارات من البروتينات السنترومير الحيز الحركي (على سبيل المثال، وتبقى إشارات CENP-A في السنترومير) مع تعديلات طفيفة التالية:
   1. حدد منطقة البروتينات السنترومير الحيز الحركي والخلفية على النحو التالي:
      1. الخلية الإنقسامية: (منطقة السنترومير الحيز الحركي) حدد منطقة متداخلة مع الكروموسومات ملطخة دابي. (المنطقة الخلفية) ومنطقة خارج الكروموسومات ولكن داخل خلية واحدة متطابقة (المنطقة أي عصاري خلوي).
      2. الخلية الطور البيني: (منطقة السنترومير الحيز الحركي) حدد منطقة متداخلة مع لونين ملطخة دابي. (المنطقة الخلفية) ومنطقة خارج لونين ولكن داخل خلية واحدة مماثلة (<م> أي منطقة عصاري خلوي).
         ملاحظة: انظر القانون أيضا التكميلي الملفات (5.2.1.4.3) أو (5.2.2.6.4) لاختيار المنطقة مع البرامج أو البرامج B2، على التوالي.
   2. تحديد النسبة المئوية للإشارات المتبقية في القسيم باستخدام البرامج أو B. لهذه المهمة، استخدم الصيغة التالية:
      تبقى إشارات من البروتين السنترومير-الحيز الحركي في السنترومير-الحيز الحركي
      
      حيث الصورة هو سطوع إشارة من المنطقة المحددة، وهو ما يؤكده ACA أو CENP-B تلطيخ، ب هي سطوع إشارة الخلفية؛ _عينة ص هي ACA إشارة أو CENP-B إشارات لسيرنا (ق) الخلايا المعالجة بالإثير. وص _{السيطرة} هو ACA إشارة أو إشارات CENP-B للخلايا transfected سيرنا لوك.
      ملاحظة: في هذا التحليل، تم استخدام إشارات CENP-B كإشارات مرجعية لCUL4A وRBX1 كما هو موضح في التقارير السابقة. 17
      1. استخدام ملف Excel لهذا الحساب بعد نسخ ولصق البيانات الخام من البرنامج إشارة الكميات المذكورة أعلاه. انظر أيضا ملفات التعليمات البرمجية الإضافية: (5.2.1.4) و (5.2.2.6) لمزيد من التفاصيل. ويظهر أحد الأمثلة على حساب في الجدول 3.
   3. تحليل لا يقل عن 20 خلايا للقضاء على التفاوت في تلطيخ والحصول على الصور لكل مستوى القياس. اختياريا استخدام "قيمة المتوسط" ما تبقى من إشارات السنترومير الحيز الحركي لكل تحليل الخلية لمقارنة هذه القيم بين البروتينات السنترومير الحيز الحركي المختلفة.

6. الغربية تحليل وصمة عار من البروتين الكلي

1. resuspend الخلايا في تغيير طبيعة العازلة ألف (20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.4 و 50 ملي كلوريد الصوديوم، 0.5٪ Nonidet P-40؛ 0.5٪ deoxycholate؛ 0.5٪ SDS، 1 ملم EDTA، والكامل خالية من EDTA مثبط البروتياز كوكتيل)، ²⁶ موضوع التعليق لصوتنة وتجميد عملية ذوبان الجليد، وقياستركيزات البروتين على النحو التالي:
   1. وفيما يتعلق بعملية صوتنة، إضافة 50 ميكرولتر من العازلة ألف من الخلايا التي تم جمعها من بئرين لوحة البوليسترين 6 جيدا في 48-72 ساعة بعد ترنسفكأيشن (انظر البروتوكول 1). تشغيل sonicator مجهزة القرن اختلال وmicrotip (انظر قائمة المواد / المعدات) لمجموع 15 ثانية مدة متقطعة النبض (دورة عمل 50٪) في عينة واحدة.
   2. لتجميد عملية ذوبان الجليد، وتجميد الخلايا مع النيتروجين السائل وذوبان الجليد الخلايا في RT.
   3. قياس تركيز البروتين باستخدام التجارية البروتين الفحص الكاشف الأول أو الثاني (انظر قائمة المواد / المعدات).
      والمخفف لست] مع نسبة 01:10 في قياس تركيزات البروتين مع أي كاشف الأول أو الثاني: مذكرة. وفي هذا التخفيف والحاضر SDS في المخزن ويظهر التدخل ضئيلة أو معدومة في هذا القياس.
2. خلط المحللة التي تحتوي على 20-30 ميكروغرام من البروتين الكلي مع العازلة تحميل 2 × أو 4 × SDS-PAGE ²⁷ تغلي العينات ل5 دقائق ثم تحميلها على 12.0٪ -15.0٪ تغيير طبيعة هلام SDS-بولي أكريلاميد لالكهربائي.
3. نقل البروتينات مفصولة SDS-PAGE على غشاء PVDF باستخدام طريقة النشاف الغربية التي سبق وصفها. ^{17،24،27-31}
   1. منع مواقع الربط غير محددة على الغشاء مع 5٪ الحليب الخالي من الدسم في 1 × PBS، ثم احتضان الغشاء مع حلول الأجسام المضادة الأولية مخففة لمدة 1 ساعة على RT. انظر قائمة المواد / المعدات للحصول على معلومات مفصلة (على سبيل المثال، نسبة التخفيف) من كل الأجسام المضادة الأولية.
   2. بعد غسل مرات غشاء 3-4 (كل حضانة 3- إلى 5 دقيقة مع اهتزاز) مع برنامج تلفزيوني-T عازلة (1 × برنامج تلفزيوني و 0.1٪ توين-20)، احتضان الغشاء في خليط من الأشعة تحت الحمراء القريبة (الأشعة تحت الحمراء) الأجسام المضادة الثانوية صبغ مترافق فلوري (نسبة التخفيف من 1: 20،000)، والأجسام المضادة الثانوية DyLight مترافق (نسبة التخفيف من 1: 20،000)، و / أو الفجل البيروكسيديز (HRP) -conjugated الأجسام المضادة الثانوية (المخفف في برنامج تلفزيوني-T، dilutiعلى نسبة 1: 10،000) لمدة 1 ساعة على RT. انظر قائمة المواد / المعدات للحصول على معلومات مفصلة (على سبيل المثال، نسبة التخفيف) من كل الأجسام المضادة الثانوية.
4. غسل غشاء 3 مرات، ثم مسح غشاء لتحليل البروتينات مع نظام التصوير بالأشعة تحت الحمراء و / أو تصوير التوهج للكشف عن طخة مناعية (انظر قائمة المواد / المعدات).
   1. لاستخدام نظام التصوير بالأشعة تحت الحمراء، انظر (6.4.1) في ملفات التعليمات البرمجية التكميلي.
   2. لاستخدام تصوير التوهج، انظر (6.4.2) في ملفات التعليمات البرمجية التكميلي. استخدام فائقة الحساسية تعزيز chemiluminescent (ECL) الركيزة (انظر قائمة المواد / المعدات) لهذا النظام.

التحليل المناعي من الذاتية CENP-A تدعم الفرضية القائلة بأن هناك حاجة CUL4A-E3 يغاز لتوطين CENP-A إلى القسيم
وأظهرت لنا الدراسات الحديثة أن CUL4A-RBX1-COPS8 E3 النشاط يغاز مطلوب للubiquitylation من ليسين 124 (K124) على CENP-A وتوطين CENP-A إلى القسيم. ¹⁷ في البداية، تم عزل مجمع البيني-السنترومير (ICEN) من خلال مكافحة CENP-A: أصلي لونين مناعي، ^32-34، وقد افترض أن بعض البروتينات ICEN قد تلعب دورا في توطين CENP-A إلى القسيم. لذلك، أجريت سيرنا التجارب ضربة قاضية للكشف عن البروتينات التي يسببها عدم تمركز CENP-A في القسيم ¹⁷ غياب التعبير (لا تظهر البيانات): و transfected خلايا هيلا المتزايد بشكل غير متزامن مع Cullin 4A (CUL4A) سيرنا أو سيرنا RBX1 للمرة اللازمة لاستنزاف البروتين الأمثل (48 ساعة ص لCUL4A و 72 ساعة لRBX1). أظهرت خلايا transfected مع CUL4A سيرنا على عدم تمركز كبير من CENP-A في القسيم (الشكل 1A-C). كما رأينا في الشكل 2G، كانت مستويات البروتين من CENP-A في إجمالي لست] خلية من خلايا transfected سيرنا CUL4A مماثلة لمستويات CENP-A في لست] من وسيفيراز (لوك) خلايا transfected سيرنا في ظل الظروف الثقافة نفسها. تم استبعاد إمكانية الآثار بعيدا عن الهدف من CUL4A سيرنا، لأن التعبير خارج الرحم من CUL4A-العلم انقاذ الحد من CENP-A في القسيم عندما استهدفت CUL4A سيرنا على 'UTR 3 (الشكل 2A-C). وأكد مستويات البروتين من CENP-A في إجمالي لست] الخلية لتكون مماثلة لمستويات CENP-A في لست] من خلايا transfected سيرنا لوك في ظل الظروف الثقافة نفسها بغض النظر عن (1B الأرقام، 2G) مرحلة دورة الخلية. وبالتالي، فإن احتمال أن CUL4A نضوب تسبب-A CENP تم القضاء على تدهور البروتين.

FO: المحافظة على together.within الصفحات = "1"> Cullin-RING-E3 ligases اليوبيكويتين (كرلس) هي الطبقة الأكثر بروزا من اليوبيكويتين ligases ³⁵ وتحتوي على 3 عناصر رئيسية هي: سقالة cullin، وهو بروتين البنصر (RBX1 أو RBX2)، وE2 انزيم المشحونة اليوبيكويتين أن يتم تجنيده من قبل RBX1 أو RBX2، ³⁶ حلقة البروتين إصبع المجندين أيضا محول الركيزة التي تضع ركائز في القرب من انزيم E2 لتسهيل نقل اليوبيكويتين. يسببها ³⁶ الرناوات siRNAs RBX1 انخفاض كبير في CENP-A في القسيم (1D الشكل-F) في ظل الظروف التي كانت مستويات البروتين من CENP-A في إجمالي لست] خلية من RBX1 الخلايا transfected سيرنا مماثلة لمستويات CENP-A في لست] من خلايا transfected سيرنا لوك (الشكل 2G). لم يكن لوحظ تدهور CENP-A البروتين إما عن طريق استنزاف RBX1 أو عن طريق الجمع بين CUL4A واستنزاف RBX1 في ظل الظروف الثقافة نفسها (الشكل 2G). إمكانية تأثير بعيدا عن الهدفتم استبعاد الصورة من RBX1 سيرنا، لأن التعبير خارج الرحم من العلم-RBX1 انقاذ الحد من CENP-A في القسيم عندما استهدفت RBX1 سيرنا على 'UTR 3 (الشكل 2D-F). وتشير هذه النتائج إلى أن CUL4A-RBX1-E3 يغاز مطلوب على وجه التحديد لتوطين CENP-A إلى القسيم.

التحليل المناعي للدخيلة CENP-A - البروتينات العلم إلى أن CENP-A K124 ubiquitylation أمر ضروري لتوطين CENP-A إلى القسيم
في السابق، وأظهر تحليلنا الطيف مناعي الشامل التي ليسين 124 (K124) من CENP-A-العلم وubiquitylated في خلايا هيلا ¹⁷ في التركيب البلوري للCENP-A جسيم نووي، K124 يقيم في الحلزون α3، على الرغم من أن الموقع هو لا داخل المنطقة CATD. ¹⁷ وبالإضافة إلى ذلك، يتم حفظها K124 بين الثدييات والطيور والزواحف والنباتات ومجموعة من الفطريات (على سبيل المثال، برعمدينغ الخميرة). ¹⁷ CENP-A المسوخ يسين (الشكل 3A) تم بناء واختبار قدرتها على توطين لالسنترومير. وقد لوحظ إلغاء كبيرا من توطين القسيم المركزي للدخيلة CENP-A متحولة K124R مع إشارات منتشر في كل الإنقسامية والبيني خلايا هيلا (الشكل 3B، C). كان السنترومير التعريب لم تتأثر بشكل كبير لا من الطفرات K9A (K9 يتوافق مع هيستون H3 مثيلة K9) ولا الطفرات K77R (K77 هو موقع يسين فريدة من نوعها في CATD) (الشكل 3B، C).

وبناء على هذه النتائج، يقترح اثنين من الفرضيات بشأن وظيفة في الجسم الحي من CENP-A ubiquitylation في K124. أولا، دور K124 ubiquitylation هو التحلل البروتيني بوساطة اليوبيكويتين للقضاء على overexpressed و / أو mislocalized CENP-A إلى كروماتين حقيقي. ثانيا، دور CENP-A ubiquitylation على K124 هو لتحميل CENP-A على القسيم. لاختبار وإمكانية أوال، وقد تناولت بثبات من نوع CENP-A-العلم البرية ومتحولة K124R فضلا الذاتية CENP-A بعد سيكلوهيكسيميد (فروج) علاج CUL4A- أو الخلايا المنضب RBX1. وتشير هذه البيانات إلى أن ubiquitylation من K124 ربما لا تشارك في التحلل البروتيني بوساطة اليوبيكويتين للقضاء على overexpressed و / أو mislocalized CENP-A (لا تظهر البيانات). ^17. وعلاوة على ذلك، تم التأكيد على أن الطفرة K124R تلغي المفترضة monoubiquitylation وdiubiquitylation العصابات، سواء في المجراة في المقايسات ubiquitylation المختبر (لا تظهر البيانات). ¹⁷ بشكل جماعي، وتشير هذه البيانات إلى أن مجمع CUL4A-RBX1 يساهم في "إشارات" ubiquitylation، وهو مطلوب لCENP-A التعريب في القسيم.

التحليل المناعي من العلم خارجي - البروتينات CENP-A يشير إلى أن monoubiquitin الانصهار كافية لتحميلCENP-A K124R في القسيم
واستنادا إلى النتائج أعلاه، كان الافتراض بأن monoubiquitin مرتبطة تساهميا بمثابة إشارة لCENP-A تحميلها على القسيم. لاختبار هذه الفرضية، وهو N-محطة الموسومة العلم وC-محطة-تنصهر اليوبيكويتين من النوع البري CENP-A ومتحولة K124R شيد CENP-A (الشكل 4A). تم استخدام متحولة monoubiquitin UB (K48R)، التي تفتقر إلى الموقع الرئيسي لpolyubiquitylation ^37-39 أيضا لمنع تنصهر اليوبيكويتين CENP-A البروتين من polyubiquitylation المحتملة. من خلال التقاط إشارات مناعي ضد العلم، تم اختبار توطين القسيم المركزي من البروتينات المشفرة بواسطة هذه التركيبات. في حين أن العلم-CENP-A (K124) ألغى بشكل كبير توطين السنترومير من CENP-A (الشكل 4B و 4C، العمود [6])، وكلاهما العلم-CENP-A (WT) والعلم-CENP-A (WT) -Ub ( WT) الحفاظ على توطين السنترومير بها (الشكل 4B و 4C، والأعمدة [1] و [2]). الالعلم CENP-A (K124R) -Ub (K48R) بروتين يفترض تحاكي monoubiquitylated CENP-A، حيث أن هذا البروتين استعادة كبير توطين لالقسيم (الشكل 4C، مقارنة الأعمدة [5] و [6]) بشكل أكثر كفاءة مما كان CENP-A (K124R) -Ub (WT) (الشكل 4C، مقارنة الأعمدة [4] - [6]). أظهرت هذه البيانات أن monoubiquitylation ما يكفي لتوظيف CENP-A إلى القسيم.

الشكل 1. تحليل المناعي من الذاتية CENP-A تدعم الفرضية القائلة بأن هناك حاجة CUL4A-E3 يغاز لتوطين CENP-A إلى القسيم (تم تكييف أرقام من Niikura وآخرون. ^17). (A) CUL4A سيرنا عدم التمركز الناجم من CENP-A في القسيم. و transfected خلايا هيلا مع CUL4A أو وسيفيراز (لوك) سيرنا والمحتضنة لمدة 48 ساعة (الجدول 1). يمثل مقياس شريط 10 ميكرون. (ب) تحليل لطخة غربية من هيلا لست] خلية كاملة باستخدام نفس حالة الثقافة كما في (A). وخلايا تم حصادها 48 ساعة بعد ترنسفكأيشن مع CUL4A سيرنا أو لوك سيرنا (الجدول 1). خدم GAPDH كعنصر تحكم التحميل. (C) كمية لالذاتية CENP-A إشارات في القسيم هو مبين في الفقرة (أ). تم إجراء تطبيع الإشارات باستخدام خلايا transfected سيرنا لوك، ويتم عرض متوسط ​​النسب المئوية (± SD). **** P <0.0001 مقابل خلايا transfected سيرنا لوك (الطالب اختبار t). (D) RBX1 سيرنا عدم التمركز الناجم من CENP-A من القسيم. و transfected خلايا هيلا مع RBX1 أو لوك سيرنا (ق) والمحتضنة لمدة 72 ساعة (الجدول 1). يمثل مقياس شريط 10 ميكرون. (E) تحليل لطخة غربية من هيلا لست] خلية كاملة باستخدام نفس حالة الثقافة كما في (D). تم حصاد الخلايا بعد 72 ساعة ترنسفكأيشن مع RBX1 سص لوك سيرنا (ق) (الجدول 1). خدم GAPDH كعنصر تحكم التحميل. (F) كميا إشارات الذاتية CENP-A في القسيم هو مبين في (D). تم إجراء تطبيع الإشارات باستخدام خلايا transfected سيرنا لوك، ويتم عرض متوسط ​​النسب المئوية (± SD). **** P <0.0001 مقابل خلايا transfected سيرنا لوك (الطالب اختبار t). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2. خلفية تتعلق الشكل 1 القسيم (تم تكييف أرقام من Niikura وآخرون ^17). (A) من مصادر خارجية CUL4A-العلم إنقاذ تمركز CENP-A عندما استهدفت CUL4A سيرنا على 'UTR 3. هيلا تيت أوف سلكانت ثابتة ليرة سورية في 48 ساعة بعد cotransfection مع سيرنا (CUL4A # 2: 3 "الهدف UTR أو لوك، الجدول 1)، بالإضافة إلى بناء البلازميد (pTRM4-CUL4A-العلم أو النواقل؛ الجدول 2). المناعية 4-اللون: تلطيخ للدابي (الأزرق)؛ العلم؛ الذاتية CENP-B (أحمر)؛ والذاتية CENP-A (الأخضر)، تم تنفيذ وتم فرز الخلايا العلم إيجابية، ولكن يتم حذف الصور العلم البساطة. ملاحظة: CUL4A رقم 2 هو الهدف متطابقة كما هو موضح في الشكل 1A-C. يمثل مقياس شريط 10 ميكرون. (ب) تحليل لطخة غربية من هيلا تيت أوف لست] خلية كاملة وفقا لنفس حالة الثقافة كما هو مبين في الفقرة (أ). خدم GAPDH كعنصر تحكم التحميل. وتم قياس كمية (C) CENP-A إشارات في القسيم هو مبين في الفقرة (أ) من خلال المجهر بعد فرز الخلايا لعزل تلك ملزمة من قبل الأجسام المضادة لمكافحة العلم. تم إجراء تطبيع إشارات مع خلايا transfected مع لوك سيرنا بالإضافة إلى ناقل، وتظهر النسب المئوية متوسط ​​(± SD).**** P <0.0001 مقابل خلايا transfected مع لوك سيرنا بالإضافة إلى ناقلات (يسار العمود، الطالب اختبار t). (د) من مصادر خارجية العلم-RBX1 انقاذ تمركز CENP-A في السنترومير عندما استهدفت RBX1 سيرنا على 'UTR 3 . تم إصلاح خلايا هيلا في 72 ساعة بعد cotransfection مع سيرنا (RBX1 # 2: 3 "الهدف UTR أو لوك، الجدول 1)، بالإضافة إلى بناء البلازميد (pcDNA3-علم-RBX1 أو النواقل؛ الجدول 2). المناعية 4-اللون: تلطيخ للدابي (الأزرق)؛ العلم؛ الذاتية CENP-B (أحمر)؛ والذاتية CENP-A (الأخضر)، تم تنفيذ وتم فرز الخلايا العلم إيجابية، ولكن يتم حذف الصور العلم البساطة. يمثل مقياس شريط 10 ميكرون. (E) تحليل لطخة غربية من هيلا لست] خلية كاملة وفقا لنفس حالة الثقافة كما في (D). خدم GAPDH كعنصر تحكم التحميل. (F) وتم قياس كمية CENP-A إشارات في القسيم هو مبين في (D) بواسطة المجهر بعد فرز الخلايا لعزل تلك ملزمة ل ن مكافحة العلم الأجسام المضادة. تم إجراء تطبيع إشارات مع خلايا transfected مع لوك سيرنا بالإضافة إلى ناقل، وتظهر النسب المئوية متوسط ​​(± SD). **** P <0.0001 مقابل خلايا transfected مع لوك سيرنا بالإضافة إلى ناقلات (يسار العمود، الطالب اختبار t). (G) استنفاد CUL4A وRBX1 لم يؤثر على مستويات الذاتية CENP-A البروتين. تم قياس مستويات الذاتية CENP-A البروتين في هيلا لست] خلية كاملة تحصد 72 ساعة بعد ترنسفكأيشن مع CUL4A، RBX1، CUL4A بالإضافة إلى RBX1، أو لوك سيرنا. بعد ثمانية وأربعين ساعة ترنسفكأيشن، كانت خلايا إما غير المعالجة (Asyn) أو تعامل مع باكليتاكسيل (+ الضريبة) للحث على اعتقال في الانقسام، وكانوا مثقف لمدة 24 ساعة. خدم GAPDH كعنصر تحكم التحميل. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

32 / 53732fig3highres.jpg "العرض =" 700 "/>
وأشار شخصية تحليل 3. المناعي للبروتينات CENP-A-العلم الخارجية التي CENP-A K124 ubiquitylation مطلوب للCENP-A التعريب في القسيم (تم تكييف أرقام من Niikura وآخرون ^17). (A) overexpression من CENP-A- وأكد ثوابت العلم (WT وKR المسوخ) من خلال تحليل لطخة غربية من هيلا تيت أوف لست] خلية كاملة. وخلايا تم حصادها 48 ساعة بعد ترنسفكأيشن مع pTRM4-CENP-A-العلم WT، المسوخ KR، أو ناقلات pTRM4 (الجدول 2). تم الكشف عن overexpression من CENP-A-العلم من قبل الأجسام المضادة لمكافحة العلم. خدم GAPDH كعنصر تحكم التحميل. وترد المفترضة CENP-A-العلم ديمر (##) وCENP-A-العلم مونومر (#). ملاحظة: تم الإبلاغ عن المقاومة للSDS dimers CENP-A سابقا ^40،41 (ب) أظهر CENP-A متحولة K124R عدم التمركز تنتشر من القسيم. إشارات من دابي (الأزرق)، العلم (الجشعوترد تحكم موقع السنترومير)؛ n)، والذاتية CENP-B (أحمر. ملاحظة: على عكس الذاتية CENP-A في الخلايا transfected مع CUL4A أو سيرنا RBX1، إلى أن تستهدف القسيم، ربما لأن مستوى التعبير عنها ما يقرب من 10 ظهرت إشارات منتشرة في الخلايا التي overexpressed خارجي CENP-A K124R-العلم باعتباره النمط الظاهري للعجز - إلى 25 أضعاف أعلى من الذاتية CENP-A (لا تظهر البيانات) يمثل ¹⁷ مقياس شريط 10 ميكرون (C) المدرج الإحصائي من أنماط توطين هو مبين في (ب).. تم إحصاء أكثر من 50 الموالية / طليعة الطور والطورية الخلايا وأكثر من 200 خلية البيني في التجربة (ن ≥ 3 تجارب). ويبين متوسط ​​النسب المئوية (± SD). "أخرى (غير السنترومير)" يشير الخلايا التالفة في الغالب، الخلايا الميتة، أو الخلايا مع التعريب نويي (فقط في الطور البيني)، ربما لأن ترنسفكأيشن أو غيرها من العلاجات. *** P <0.001 مقابل CENP-A WT-العلم (الطالب اختبار t). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

وأشار شخصية تحليل 4. المناعي للبروتينات خارجية العلم-CENP-A التي CENP-A monoubiquitin الانصهار انقاذ تمركز في CENP-A متحولة K124R من القسيم (تم تكييف أرقام من Niikura وآخرون. ^17). (أ) الرسوم تخطيطي من كل بناء المستخدمة في هذه الدراسة (انظر أيضا الجدول 2). ويبين الموقع طفرة K124R على CENP-A (الحمراء)، وموقع طفرة K48R على monoubiquitin (الأزرق). (1) WT: العلم-CENP-A WT، (2) WT-UB (WT): العلم-CENP-A WT-UB (WT)، (3) WT-UB (K48R): العلم-CENP-A WT -Ub (K48R)، (4) K124R-UB (WT): العلم-CENP-A K124R-UB (WT)، (5) K124R-UB (K48R): العلم-CENP-A K124R-UB (K48R)، (6) K124R: العلم-CENP-A K124R (ب) من مصادر خارجية CENP-A monoubiquitin الانصهار انقاذ تمركز في CENP-A متحولة K124R من القسيم. وترد، دابي (الأزرق)، العلم (الأخضر)، والذاتية CENP-B (عنصر تحكم موقع السنترومير الأحمر). يمثل مقياس شريط 10 ميكرون (C) المدرج الإحصائي من أنماط توطين هو مبين في (C). تم إحصاء أكثر من 50 الموالية / طليعة الطور والطورية الخلايا وأكثر من 200 خلية البيني في التجربة (ن ≥ 3 تجارب). ويبين متوسط ​​النسب المئوية (± SD). **** P <0.0001 و*** P <0.001 مقابل غير تنصهر العلم-CENP-A K124R (العمود [6]) (الطالب اختبار t). الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1. تسلسل سيرنا المستخدمة في هذه الدراسة.

الجدول 2. ناقلات البلازميد المستخدمة في هذه الدراسة.

الجدول 3. مثال واحد على حساب إشارات المتبقية CENP-A في السنترومير (٪) يظهر مثال برو / طليعة الطور التالي في الشكل 2F: العينة RBX1 # 2 (3'UTR) + مركزنا (مركز العمود في الشكل 2F ) والسيطرة هو لوك + المزيد (العمود الأيسر في الشكل 2F). ونتيجة لذلك، تبقى إشارات CENP-A فيالسنترومير (٪) = (0.255 / 2.987) × يتم الحصول على 100 ​​= 8.5٪ (أو [5.347 / 62.725] × 100 = 8.5٪ مع نفس مجموع عدد الخلايا [أي 21 خلايا] حلل بين عينتين). لاحظ أنه إذا كانت القيمة ب هي أكثر من قيمة S (أي، إذا كانت القيمة طرح هو سلبي)، يتم تعيين قيمة نسبة تصحيح إلى 0.00.

في السنوات الأخيرة قد وضعت العديد من الدراسات المختلفة المقايسات المجهر الكمي للخلايا ثابتة. ⁴² التقدم في علم الأحياء السنترومير-الحيز الحركي وغالبا ما يتطلب فهم وظيفة السنترومير محددة أو الحيز الحركي محددة من البروتينات التي التحت خلوية تنظيم المكانية والزمانية ويعكس الوظائف المتغيرة لل هذه البروتينات خلال دورة الخلية. لذلك، هنا وضعنا طرق معهد التمويل الدولي تلطيخ وفحص معهد التمويل الدولي الكمي لتحليل تحديدا المستويات النسبية للالداخلية والخارجية البروتينات CENP-A، والتي يمكن أن تكون قابلة للتطبيق في عينات معاملة مختلفة. حققنا حاليا ناجحة تلطيخ معهد التمويل الدولي من الذاتية CENP-I، CENP-H، KNL1، Hec1، وSka1 باستخدام بروتوكول 2 في هذه الدراسة (انظر Niikura وآخرون ²⁴ ولا تظهر البيانات؛ قائمة المواد / المعدات للحصول على معلومات من الأجسام المضادة) . في المستقبل، يمكن للمرء أن تطبيق نفس الأسلوب لتحديد مستوى البروتينات السنترومير الحيز الحركي المختلفة (endogenous والبروتينات الخارجية العلم الموسومة) اختيار أجسام مضادة محددة، إلا أن وسائل معهد التمويل الدولي لدينا لا تشمل الكشف عن هذه البروتينات في الخلايا الحية أو في خلية واحدة محددة خلال دورة الخلية بأكملها. لأن هذه الإجراءات تتطلب الخلايا لتكون ثابتة ومعالجتها coverslips على منفصلة، ​​قدمنا ​​إشارات مرجعية (على سبيل المثال، هيئة مكافحة الفساد أو CENP-B) لغرض التطبيع من أجل مقارنة إلى حد ما إشارات بين العينات المختلفة وزيادة دقة الفحص. لأن ACA إشراك أو إشارات الذاتية و / الخارجية CENP-A، CENP-B كما أن إشارة مرجعية لغرض التطبيع تكون أكثر ملاءمة للمقارنة من شأنه أن هيئة مكافحة الفساد من حيث دقة الفحص الكمي للإشارات CENP-A. بربط منطقة الأمينية من محطة CENP-B لعزر 17-BP تسلسل مربع CENP-B في الحمض النووي alphoid، ومنطقة كربوكسي محطة من CENP-B تشكل homodimers. ^43،44 CENP-B لا colocalize تماما مع CENP ألف و / أو غيرها من الطرد المركزيالبروتينات omere-الحيز الحركي، ومع ذلك، ويرتبط بشكل وثيق معهم. ⁴⁵ وبينما المناعي مع أجسام مضادة للCENP-C عادة يعطي مركزين منفصلة، ​​تلطيخ مع مكافحة CENP-B غالبا ما يظهر على شكل شريط مشرق واحد يربط كلا القسيم الشقيقة. ⁴⁶ ولكن ، لدينا في الملاحظة المجهرية الحجم الكلي بعض الإشارات CENP-B على ما يبدو تتداخل مع إشارات CENP-A، وخصوصا في المراحل الإنقسامية السابقة (الطور-طليعة الطور التالي من أواخر الطورية)، وأيضا في جزء اعتمادا على زاوية الرصد ونوع من تثبيتي المستخدمة (لا تظهر البيانات). في المقابل، في فحص معهد التمويل الدولي الكمي للإشارات CENP-A، البروتين توطين الإشارات المرجعية يجب أن لا تتأثر استنزاف و / أو خلل في CENP-A لتحليل عادلة، على الرغم من توطين معظم البروتينات السنترومير الحيز الحركي يعتمد على تم تأسيس CENP-A التعريب في القسيم. التجميع الحيز الحركي ^47،48 CENP-A-مستقل عن طريق استبدال المناطق الحمض النووي ملزم من CENP-C وCENP-T مع المجالات التي تستهدف كروموسوم البديلة التي تجند هذه البروتينات إلى مواضع خارج الرحم. ^49،50 وبالإضافة إلى ذلك، أشارت الأبحاث الحديثة أن مكونات الحيز الحركي الداخلية CENP-C وCENP-T عمل بالتوازي لتجنيد شبكة KMN ل kinetochores. ^51-54 وعلاوة على ذلك، نيشينو وآخرون. واقترح أن أشكال CENP-TWSX معقدة تشبه هيكل جسيم نووي فريدة من نوعها لتوليد الاتصالات مع الحمض النووي، وتوسيع نطاق "كود هيستون" ما وراء البروتينات جسيم نووي الكنسي. ⁵⁵ لأن توطين السنترومير من CENP- C تعتمد على توطين السنترومير من CENP-A، ^47،48 CENP-TWSX أو خاصة CENP-T يمكن أن يكون المرشح بروتين آخر (الصورة) لتوفير الإشارات المرجعية في فحص معهد التمويل الدولي الكمي للCENP-A. ومع ذلك، ينبغي اختبار المرشح لالإشارات المرجعية بعناية قبل الاختبار لتحديد ما إذا كان التعريب في القسيم يتأثر نضوب و / أو خلل في CENP-A. نظر مماثلةينبغي أن تؤخذ لفحوصات معهد التمويل الدولي كمية من البروتينات الأخرى السنترومير الحيز الحركي: توطين البروتين الإشارات المرجعية لا ينبغي أن تتأثر استنزاف و / أو خلل في البروتين المستهدف لتحليل عادلة. في دراسة سابقة، كنا ACA كإشارة مرجعية لفحص معهد التمويل الدولي الكمي من البروتينات الحيز الحركي المركزية التي الخارجي الأخرى. ²⁴ ACA يمكن أن يكون خيارا أكثر ملاءمة من واحد CENP-B بمثابة سيطرة على الموقف، فضلا عن إشارة مرجعية، إذا ACA لا تتأثر الإشارات التي كتبها استنزاف و / أو خلل في بروتين الهدف ولكن colocalization من البروتين الهدف مع CENP-B فقير كما هو مذكور أعلاه.

بودور وآخرون. وذكرت أن مستويات القسيم المركزي CENP-A تنظمها العمل الجماهيري، أي كمية من القسيم المركزي CENP-A يختلف في نسبة مباشرة إلى المحتوى الخلوي. ⁵⁶ كما اظهرت أن تحريض عابرة من CENP-A التعبير يؤدي إلى زيادة سريعة في القسيم المركزي CENP-A مستوى. على العكس من ذلك، لاحظنا السكان الخلية كبير مع مترجمة السنترومير، العلم الموسومة-CENP-A WT بعد cotransfection من ناقلات التعبير pTRM4 مع CA-UTR الرناوات siRNAs (خليط من 5 'و 3' UTR سيرنا، الجدول 1) (البيانات لا معروضة). وهذه الفئة من السكان أكبر مما كان عليه بعد ترنسفكأيشن فقط مع ناقلات التعبير pTRM4. وكان مستوى خارجي الموسومة العلم CENP-A البروتين التي كان يقودها pTRM4 التعبير، حوالي 1،0-1،4 أوامر من حجم (10- إلى 25 أضعاف) أعلى من الذاتية CENP-A (لا تظهر البيانات). وتكهن بأن تعبير خارجي CENP-A WT فوق عتبة معينة يمكن أن يؤثر سلبا على توطين القسيم المركزي الذي تستحقه.

في البروتوكولات الحالية، التثبيت هو خطوة حاسمة للحفاظ على البنية الخلوية والبيئة والوضع الداني وقت ممكن إلى الدولة الأم. مرة واحدة يتم إصلاحها الخلايا، ينبغي للمرء أن المضي قدما في بروتوكول تلطيخ لتجنب فقدان البروتين من الأسواق العالمية ضغطهاراحة أو بقية الخلية. ومع ذلك، تثبيت يدمر مواقع المستضدات في بعض الأحيان، ومختلف مجموعات الضد مستضد عمل سيئة مع تثبيتي واحد، ولكن بشكل جيد جدا مع آخر. ²¹ وبسبب هذا الاختلاف، واختيار من تثبيتي يعتمد إلى حد كبير على البروتين (ق) من الفائدة. طول الوقت من تثبيت يمكن أن تؤثر تأثيرا كبيرا على الكشف عن بروتين (ق) من المناعية، وأقصر تثبيت أفضل عموما للاحتفاظ استضداد. ⁵⁷ لذلك، عند تحديد الإجراءات تلطيخ لهدف جديد من البروتينات الأخرى السنترومير الحيز الحركي، وخاصة من غير مؤكد التوطين، أو عند العمل مع الأجسام المضادة الجديدة، ينبغي للمرء أن يختبر عدة طرق لتثبيت ومخازن لإيجاد الظروف المثلى. في البروتوكولات الحالية، وقد تم اختيار فئتين من مثبتات الشعبية: مثبتات ألدهيد (بروتوكول 2) والمذيبات العضوية (بروتوكولات 3 و 4). نقاء مثبتات هو أيضا في غاية الأهمية. في بروتوكول 4، يتم استخدام 4٪ مصل الماعز especiaLLY لمنع مستقبلات مفتش على سطح الخلية للحد من خلفية غير محددة. ⁵⁷ عموما، ومصل لمنع المستقبلات مفتش يجب أن تكون من الأنواع لا علاقة لها الأجسام المضادة الأولية ويفضل أن يكون من نفس النوع كما الأجسام المضادة الثانوية ^(57).

في كل من البروتوكولات الحالية، واختيار من الأجسام المضادة الأولية هو الخطوة الأكثر أهمية في تحقيق المناعية ناجحة. المطلوب هو الجسم المضاد مع أكبر قدر من الدقة والنقاء، تقارب، والطمع. وهناك تركيز انطلاق جيدة لالأجسام المضادة وحيدة النسيلة هو عادة 1-5 ميكروغرام / مل. التخفيفات نموذجية من إعداد الأوراق المالية الأجسام المضادة تتراوح من 1:20 إلى 1: 500 ⁵⁷ يحتاج المرء لتحديد تجريبيا التركيز المناسب من الأجسام المضادة الأولية ومخفف لكل عينة. العينات يجب أن هز بلطف ولكن لم يجف خلال الحضانة لتلطيخ متجانس. غسل واسعة بين حضانة الأجسام المضادة الأولية والثانويةقد تكون هناك حاجة ntibody لتجنب الاختلاطات مع المناعية من الأنواع الأخرى. ومع ذلك، لا بد من تحديد حالة غسل الأمثل تجريبيا لتجنب فقدان الخلايا، وخاصة الخلايا الإنقسامية، التي تختم وفصل عندما اهتزت (أي الإنقسامية هزة إيقاف). ⁵⁸ ونظرا للنجاح، يجب اختيار الأجسام المضادة الثانوية لربط الأجسام المضادة الأولية مع قابلية عالية. على سبيل المثال، لتجنب ملزمة انوعي الجزء التيسير من الأجسام المضادة الثانوية لمستقبلات مفتش التيسير، أف ب (أ ب ') ₂ شظايا يمكن أن تستخدم بدلا من الأجسام المضادة كله. ⁵⁷ بالنسبة للعديد من الأجسام المضادة الثانوية، فترة حضانة يمكن التقليل إلى 30 دقيقة في RT للحد من خلفية غير محددة.

بالإضافة إلى بروتوكول 5، ويمكن ليزر المسح المجهري متحد البؤر يكون من المفيد في كشف وتحليل توطين وظيفة من البروتينات السنترومير الحيز الحركي مع خصائص الفلورسنت. كما هو مبين في قائمة المواد / اجهزة لازيوتالإقليم الشمالي، اليكسا فلور 488 واليكسا فلور 594 هي على الأرجح الأصباغ الفلورية الأكثر استخداما في البروتوكولات الحالية. للكشف عن اثنين و / أو البروتينات السنترومير الحيز الحركي مختلفة متعددة في العينة، لا بد من التأكد من أن الأجسام المضادة المستخدمة للكشف عن البروتين واحد لا تمنع من الكشف عن البروتين الثاني ⁵⁷ في البروتوكولات الحالية.، وهما الأجسام المضادة الأولية مختلطة وتطبيقها في نفس الوقت. ومع ذلك، ينبغي للمرء أن تحسين الظروف المناعية لكل البروتين على حدة قبل تطبيق الأجسام المضادة الأولية أو الثانوية معا: إذا البروتينات هما على مقربة كما هو الحال بالنسبة للمكونين السنترومير-الحيز الحركي، الأجسام المضادة الأولية يجوز لأحد أن يمنع هيكليا الربط من الأجسام المضادة الأولية الثانية. قلق آخر للكشف عن إشارة متعددة هي مشكلة التداخل الطيفي: صعوبة في منع إشارة من صبغة واحدة "تسريب" في قناة الطيفية للآخر. تصبح هذه المشكلة أكثر صعوبة بالنسبة للاتفاقيةآل مرشح تدخل مجموعات لحل كما يزيد عدد الأصباغ أو إذا كانت العينة تحتوي على إشارات overenhanced (على سبيل المثال، هيئة مكافحة الفساد أو مكافحة علم الإشارات في هذه الدراسة)، بما في ذلك التدخل من تألق ذاتي. وقد أجريت استكشاف الأخطاء وإصلاحها من تألق ذاتي في دراسات أخرى. ^57،59،60 وفي الدراسة الحالية، وتحسين مجموعات مرشح الفلورسنت مع الضوابط تسمية واحدة في كل قناة يكفي في معظم الحالات لتجنب هذه المشاكل (أنظر أدناه).

في كل من البروتوكولات الحالية، والضوابط المناسبة ضرورية. يجب أن تتسم كل الأجسام المضادة الأولية جديد قبل أن يبدأ المناعية. وينبغي تأكيد خصوصية الأجسام المضادة عن طريق تحليل لطخة غربية، إن وجدت. وبالإضافة إلى ذلك، وتأكيد أن تلطيخ لا ينتج عن انوعي ملزم لسطح الخلية ينبغي الحصول، وينبغي تحديد تركيز العمل الأمثل من الأجسام المضادة الأولية معين من خلال استخدام التخفيفات المسلسل(أي، ينبغي وضع منحنى ملزم). وسيطرة سلبية (أي عدم وجود الأجسام المضادة الأولية من عملية تلطيخ) ينبغي أن تدرج. وثمة خيار آخر للسيطرة سلبية هو استبدال مفتش العادي من نفس النوع لالأجسام المضادة الأولية. للكشف عن علامات متعددة، لا بد من إعداد الضوابط دون الأجسام المضادة الثانوية (سيطرة الخلفية) وكذلك الضوابط تسمية واحدة لتجنب القطع الأثرية تداخل الطيفية (أي تنزف من خلال، كروس، الحديث المتبادل، أو صبغ "تسريب"، كما هو موضح أعلاه ). يمكن للمرء أن تحديد جزء من "تسرب" من خلال مقارنة إشارات من خلال مرشحات "خاطئة" مع الإشارة الصحيحة، وذلك باستخدام هذه النسب لإزالة حسابيا عن "تسريب" وحساب التوزيع الحقيقي و / أو المشاركة في توطين التسمية الفلورسنت ⁶⁰ ينبغي النظر سيطرة الخلفية بشكل مستقل مع كل قناة لتعيين حدود كسب إشارة وتعويض لتكون آداpted للتصوير النهائي. جميع القنوات التي سيتم استخدامها للحصول على صورة عينة متعددة التسمية يجب أن تخضع للتصويب خلفية مستقل، لأن مستوى تألق ذاتي في كل قناة يختلف إلى حد كبير. في "تسريب" الضوابط على النحو المبين أعلاه اللازمة لتحديد مقدار الربح إشارة ممكنة في كل قناة من دون الكشف عن "تسريب" في القنوات المجاورة. ⁶⁰

الكتاب تعلن أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح GM68418.