Electroporation للمن المستجيبات البكتيرية وظيفية في خلايا الثدييات

Electroporation was used to insert purified bacterial virulence effector proteins directly into living eukaryotic cells. Protein localization was monitored by confocal immunofluorescence microscopy. This method allows for studies on trafficking, function, and protein-protein interactions using active exogenous proteins, avoiding the need for heterologous expression in eukaryotic cells.

دراسة التفاعلات البروتين في سياق الخلايا الحية يمكن أن تولد المعلومات الهامة حول توطين والديناميكية وشركاء التفاعل. هذه المعلومات هي قيمة خاصة في سياق التفاعلات المضيف الممرض. العديد من البروتينات الممرض تعمل داخل الخلايا المضيفة في مجموعة متنوعة من طريقة مثل، مما يتيح التهرب من الجهاز المناعي المضيفة والبقاء على قيد الحياة في البيئة داخل الخلايا. لدراسة هذه الممرض البروتين التفاعلات الخلية المضيفة، وتستخدم عدة نهج شيوعا، بما في ذلك: في إصابة الجسم الحي مع سلالة التعبير عن بروتين الموسومة أو متحولة، أو إدخال جينات الممرض عبر ترنسفكأيشن أو تنبيغ. كل من هذه الطرق لها مزايا وعيوب. سعينا وسيلة لإدخال مباشرة البروتينات الخارجية إلى داخل الخلايا. يستخدم Electroporation للعادة لتقديم الأحماض النووية في خلايا، ولكن تم أكثر نادرا ما تطبق على البروتينات على الرغم من أن أساس فيزيائي حيوي هو نفسه تماما.تم استخدام electroporator القياسية لإدخال مؤثرات تقارب الموسومة البكتيرية إلى خلايا الثدييات. كان المثقف خلايا البلاعم الظهارية والفأر الإنسان من خلال الطرق التقليدية، فصل، ووضعها في 0.4 سم cuvettes الفجوة Electroporation للمع البروتين البكتيري الممرض خارجي من الفائدة (على سبيل المثال السالمونيلا التيفية الفأرية GtgE). بعد Electroporation لل(0.3 كيلو فولت) والقصيرة (4 ساعات) فترة نقاهة، تم التحقق من البروتين داخل الخلايا التي وصفها fluorescently البروتين عن طريق بطاقة تقارب ودراسة التوزيع المكاني والزماني بواسطة المجهر متحد البؤر. وقد تبين أن البروتين electroporated أيضا لتكون وظيفية داخل الخلية وقادرة على الاتجار التحت خلوية الصحيح والتفاعل البروتين البروتين. في حين تميل البروتينات الخارجية لتتراكم على سطح الخلايا، فان عينات electroporated زيادات كبيرة في داخل الخلايا تركيز المستجيب نسبة إلى الحضانة وحدها. بروتوكول بسيط وسريع بما فيه الكفاية مما يتعين القيام به في ا ف بالأزياء arallel، والسماح لتوصيف عالية الإنتاجية للبروتينات الممرض في الخلايا المضيفة بما في ذلك استهداف التحت خلوية وظيفة البروتينات الفوعة.

العديد من الجراثيم سلبية الغرام تستخدم أنظمة إفراز المتخصصة لحقن البروتينات المرتبطة الفوعة (ويشار إلى المستجيبات) مباشرة في الخلايا المضيفة ^1-5. هذه المؤثرات لديها مجموعة واسعة من الوظائف البيولوجية بما في ذلك: قمع الحصانة المضيف، والتغيرات هيكل الخلية، وتعديل الاتجار داخل الخلايا والإشارات، والتغيرات النسخي، والتعديلات proteasome والمضيف ^6-9. ومن المعروف وظائف بعض المؤثرات، ولكن الأهداف المضيفة وعمل الكيمياء الحيوية (ق) من كثيرين آخرين لا تزال يحدد لاحقا. في حين المقارنة بين النوع البري والالتهابات البكتيرية المؤتلف هو نهج صحيح لدراسة آليات المستجيب الفوعة داخل الخلايا، غالبا ما يكون من المفيد أن استحداث المستجيب الفردي في الخلية المضيفة. وهكذا، طرق بسيطة لإدخال وتميز البروتينات المستجيب البكتيرية في سياق الخلايا المضيفة أمر مرغوب فيه للغاية.

تبسيط التحليل واي تجريبيعشر على المستجيب واحد أمر بالغ الأهمية كما المستجيبات أخرى قد يكون لها وظائف معارضة أو زائدة عن الحاجة. لإنجاز هذا التبسيط، وأدخلت الباحثين سابقا الجزيئات إلى الخلايا عن طريق العديد من الطرق المختلفة، بما في ذلك تنبيغ الفيروسية ^10، حقن مكروي ^11، كشط تحميل ^12،13، والانصهار مع خلية يسببها كيميائيا حقن مكروي ¹⁴ والبروتين الملكية "ترنسفكأيشن" الكواشف ^15، رواسب فوسفات الكالسيوم ^16، و electroporation ^17-20. وتتراوح جزيئات عرض من الأحماض النووية بما في ذلك الأنواع DNA، RNA، ورني للبروتينات، والأصباغ خلايا كتيمة، والأجسام المضادة لأهداف داخل الخلايا ^21،22. بعض الطرائق حدودها بما في ذلك نوع من جزيء التي يمكن إدخالها، ويمكن أن تكون خاصة التحليلات المصب محدودة نظرا لسمية عالية الخلوية، وآليات الضارة للعمل، فعالية منخفضة، أو الكفاءة المقدمة. ترنسفكأيشن، وهو ofteطريقة ن استخدامها للتعبير عن الجينات البكتيرية في خلايا الثدييات، كما يعاني القيد أن بعض أنواع الخلايا المضيفة ذات الصلة، مثل الضامة والخلايا الأولية، هي مقاومة وخاصة تجاه ترنسفكأيشن. أبعد من ذلك، فمن الصعب السيطرة على مستويات البروتين البكتيري تنتج على إدخال DNA الأجانب.

وقد أنشأت الكثير من العمل Electroporation للمن الأحماض النووية في خلايا الثدييات على حد سواء البكتيرية وكأسلوب مختبر مشترك؛ ومع ذلك، هناك أبحاث جارية حول أفضل الطرق لتقديم البروتينات في الخلايا تحت الظروف الفسيولوجية. هي تقارير عن البروتين ترنسفكأيشن واعدة، ولكن تتطلب الكواشف مكلفة والتحسين. الرغبة في إدخال المستجيبات البكتيرية السامة إلى مجموعة واسعة من الأهداف خلية بأقل تكلفة ممكنة أدى بنا إلى النظر في Electroporation للكطريقة لدراسة هذه البروتينات في الجسم الحي.

بروتين ^23-25 ​​Electroporation للهو الوفاءهود لإدخال البروتينات في الخلايا الحية عبر electropermeabilization، المعروف أيضا باسم الكهربائية ترنسفكأيشن أو الكهربائية حقن ^26. وتستخدم هذه التقنية عالية الكثافة النبضات الكهربائية لخلق المسام في أغشية الخلايا. هذه المسام عكسها تسمح الجزيئات التي يتم استبعادها عادة من الفضاء داخل الخلايا لدخول الخلية. على إزالة الحقل الكهربائي الخارجي، لا يمكن للغشاء إعادة الختم، والسماح للخلية للاحتفاظ الجزيئات التي مرت من خلال المسام ^27،28.

تم استخدام electroporator القياسية في هذه الدراسة لتقديم باستمرار المستجيبات البكتيرية في كل من الماوس خلايا تشبه البلاعم والخلايا الظهارية الإنسان. طريقة سريعة وفعالة، وغير مكلفة، مع أي انخفاض ملموس في جدوى الخلوية. يمكن تصور البروتينات أدخلت عن طريق المناعي المجهري أو استخدامها لالمقايسات الفنية. وقد تجلى ذلك باستخدام بروتين الفلورية الخضراء (GFP) كمعيار غير سامة، وكذلكاثنين من السالمونيلا البروتينات المستجيب، SspH1 وGtgE. نقترح البروتين Electroporation للكأداة إضافية في جعبته لدراسة البروتينات الفوعة البكتيرية وظائفهم في الخلايا المضيفة حقيقية النواة.

1. إعداد مقدما

1. الفوسفات العقيمة الدافئة مخزنة المالحة (PBS) إلى 37 درجة مئوية.
2. تعديل الدافئ Dulbecco ومتوسطة النسر (DMEM) والحد الأدنى الضروري المتوسطة (MEM) تستكمل مع المصل 10٪ بقري جنيني (FBS)، و 100 وحدة دولية / مل البنسلين، و 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين إلى 37 درجة مئوية. ملاحظة: هذه تمثل وسائل الإعلام النمو الطبيعي (NGM) لخلايا RAW وهيلا على التوالي.

2. إعداد الخلايا

1. تنمو الخلايا 264.7 الخام إلى 70-90٪ confluency في NGM.
   1. الحفاظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية في ترطيب الهواء 95٪ / 5٪ CO ₂ الغلاف الجوي.
2. تنمو خلايا هيلا إلى 70-90٪ confluency في NGM.
   1. الحفاظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية في ترطيب الهواء 95٪ / 5٪ CO ₂ الغلاف الجوي.
3. قبل جمع، وغسل أحادي الطبقة الخلية مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني العقيمة.
4. جمع الخلايا ما قبل متكدسة في أنبوب مخروطي العقيمة.
   1. كشط بلطف خلايا RAWمع شرطي المطاط في برنامج تلفزيوني، مع pipetting لالمتكررة لتفريق تجمعات الخلية.
   2. فصل خلايا هيلا مع 0.25٪ محلول التربسين حتى يظهر الفحص البصري التفكك من سطح الثقافة. على سبيل المثال، استخدام 2 إلى 3 مل لT-75 قارورة. ضبط حجم وفقا لذلك لضمان حل التربسين يغطي سطح النمو بأكمله.
      1. إخماد رد فعل التفكك مع NGM تحتوي على 10٪ FBS.
      2. استخدام ما لا يقل عن ضعف حجم NGM إلى التربسين، مع pipetting لالمتكررة لتفريق تجمعات الخلية.
5. بيليه طفيفة الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 900 x ج لمدة 4 دقائق.
6. resuspend في نفس الحجم كما حل التربسين / إخماد باستخدام برنامج تلفزيوني العقيمة.
7. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات أو الجسيمات المضادة.
8. بيليه طفيفة الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 900 x ج لمدة 4 دقائق.
9. resuspend في حجم كاف من برنامج تلفزيوني لمدة 5.5 × 10 ^6-6،0 × 10 ⁶ خلية / مل. ملاحظة: على سبيل المثال، واحد T-75 قارورة تسفر approxim¢ الأمر 7.5 × 10 ⁶ خلايا ^(29).
10. حافظ على تعليق خلية على الجليد حتى Electroporation لل.

3. إعداد ل electroporation

1. cuvettes قبل البرد Electroporation لل(0.4 سم الفجوة) على الجليد.
2. بدوره على جهاز Electroporation للوتعيين الجهد إلى 0.3 كيلو فولت.
   ملاحظة: كانت السعة والمقاومة لا إعدادات قابلة للتعديل على موقعنا electroporator (وضعت في 10 μF و 600 Ω من قبل الشركة المصنعة).
3. ملء وحات الانتعاش مع NGM وتتوازن في ترطيب الهواء 95٪ / 5٪ CO ₂ الغلاف الجوي عند 37 درجة مئوية.

4. Electroporation لل

1. وضع 400 ميكرولتر من تعليق خلية في كفيت ما قبل المبردة وإضافة 20 ميكروغرام من البروتين المحدد إلى كوفيت (50 ميكروغرام / مل).
2. نفض الغبار كفيت بلطف ~ 10 مرات لخلط دون الإضرار الخلايا. ملاحظة: يمكن أيضا كفيت أن مقلوب عدة مرات لتخلط جيدا، ولكن لا الماصة صعودا وهبوطا أو دوامة لتجنب إتلاف الخلايا.
خارج الجاف كفيت مع منشفة ورقية أو ممسحة أخرى لتجنب الانحناء الكهربائي في electroporator.
3. عينة Electroporate عند 0.3 كيلو فولت ل1،5-1،7 ميللي ثانية. ملاحظة: كان هذا نموذجي لهذه الدراسة.
4. مباشرة بعد Electroporation للنفض الغبار كفيت بلطف ~ 10 مرات لمزيج دقيق.

5. التصفيحات من الخلايا

1. متجر كفيت مع خلايا electroporated على الجليد حتى جاهزة لوضع لوحات في الانتعاش.
2. بالنسبة لمعظم التحليلات المصب، وغسل الخلايا 1X مع حرارة ما قبل NGM لإزالة البروتين المستجيب دخيلة.
   1. إزالة الخلايا لتحليل وتعليق في 3-5 مل من NGM.
   2. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 900 x ج لمدة 4 دقائق.
   3. resuspend في حجم كاف من NGM لحجم المطلوب لوحة (على سبيل المثال 2 مل لمدة 35 ملم طبق).
3. إزالة كمية مناسبة من الخلايا لتحليل المصب.
   1. مثال 1: لوحة في أطباق أسفل الزجاج لتحليل المجهري.
   2. مثال 2: لوحة كثافة العملياتس البلاستيك زراعة الخلايا لتحليل البروتين مثل التنقيات التقارب.
4. تسمح للخلايا لاسترداد في لوحات معايرتها في ترطيب الهواء 95٪ / 5٪ CO ₂ في الجو 37 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 4 ساعة.

6. تحليل المجهر

6.1) التثبيت / تلطيخ المناعي

1. غسل الخلايا 1X مع برنامج تلفزيوني العقيمة بعد فترة نقاهة 4 ساعة.
2. إصلاح الخلايا في الميثانول بنسبة 100٪ لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. استخدام ما يكفي من الميثانول لتغطية تماما الخلايا (على سبيل المثال 2 مل لمدة 35 ملم طبق).
3. غسل 3X مع برنامج تلفزيوني العقيمة.
4. Permeabilize الخلايا مع 0.4٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني لمدة 15 دقيقة. على سبيل المثال، استخدم 1 مل لوحة قطرها 35 ملم.
   1. ضبط طول permeabilization وقوة تريتون X-100 وفقا لحاتمة والمكان من البروتين الهدف. ملاحظة: سوف تحتاج أفضل النتائج يتم تحديدها تجريبيا لكل هدف، ولكن ينبغي أن تكون الشروط المذكورة أعلاه كافية لمعظم جأهداف ytosolic.
5. منع مع 5٪ مصل بقري الزلال (BSA) في برنامج تلفزيوني لمدة 1 ساعة على RT. على سبيل المثال، استخدم 1 مل لوحة قطرها 35 ملم.
6. غسل 3X مع برنامج تلفزيوني.
7. احتضان الأجسام المضادة الأولية في الضد حل ملزم (0.1٪ تريتون X-100 و 1٪ BSA في PBS) بين عشية وضحاها في 4   ° C مع هزاز لطيف. على سبيل المثال، استخدم 0.5 مل لوحة قطرها 35 ملم.
   1. اتبع توصيات الشركة الصانعة للأجسام المضادة التخفيف. ملاحظة: على سبيل المثال، تم استخدام ملزم streptavidin العلامة الببتيد (SBP-علامة) الأجسام المضادة في 1: 1،000 التخفيف، في حين تم استخدام الأجسام المضادة PKN1 في 1: 200 التخفيف.
8. غسل 4X مع برنامج تلفزيوني.
9. احتضان مع الأجسام المضادة المناسبة fluorescently مترافق الثانوية في الضد حل ملزم لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة، محمية من الضوء.
   1. على سبيل المثال، استخدم اليكسا 488 أو 647 اليكسا لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
      1. اتبع توصيات الشركة الصانعة للنملةتخفيف ibody. (على سبيل المثال حوالي 1: 1،000 لهذه الدراسة).
   2. إضافة البقع الأخرى حسب الحاجة، على سبيل المثال، 5 ميكرومتر القمح الجرثومية agglutinnin (WGA) مترافق لاليكسا 647 أو دابي وفقا لتوصية الشركة الصانعة، لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
10. غسل 5X مع برنامج تلفزيوني وتخزينها في 4 درجات مئوية، محمية من الضوء حتى جاهزة للصورة.

6.2) متحد البؤر المجهري وتحليل الصور

1. عينات الصورة على مجهر متحد البؤر مقلوب باستخدام الهدف الغمر 63X النفط.
   1. صورة قناة الخضراء باستخدام سطر 488nm ليزر الأرجون، مع انبعاث عرض النطاق الترددي بين 492-542 نانومتر.
   2. صورة القناة الحمراء باستخدام 633 نانومتر ليزر ديود، مع انبعاث عرض النطاق الترددي بين 640-718 نانومتر.
   3. صورة القناة الزرقاء باستخدام 405 نانومتر ليزر ديود، مع انبعاث عرض النطاق الترددي بين 407-453 نانومتر.
   4. ضمان القناة متعددة ض مداخن تغطي مجمل حجم الخلوية.
2. صور عملية مع المناسبة برامج معالجة الصور.

7. الانجذاب تنقية

1. غسل الخلايا electroporated مرتين مع 4 ° C PBS بعد فترة نقاهة 4 ساعة.
2. ليز مع ~ 1.0 مل من تحلل العازلة (1٪ تريتون X-100 مع كوكتيل مثبط البروتياز والفوسفاتيز المانع في PBS) على الجليد. استخدام مثبطات وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. ملاحظة: على سبيل المثال، سواء تم تزويد الفوسفاتيز ومثبطات الأنزيم البروتيني المستخدمة في هذه الدراسة في 100X، ولكن ينبغي الصيغ الأخرى تعمل بشكل جيد على قدم المساواة.
3. كشط فورا الخلايا مع شرطي المطاط وجمع في أنابيب مخروطية.
4. ليز من قبل vortexing قوية وصوتنة. ملاحظة: طرق تحلل أخرى يمكن أن تعمل بنفس القدر أيضا، ولكن سوف تحتاج الكفاءة يتم تحديدها تجريبيا لمدى ملاءمة متطلبات الفحص.
   1. يصوتن 3 × 30 ثانية مع vortexing لفترات متقطعة.
5. الطرد المركزي في 10،000 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية لجمعالحطام الخلوي والمجاميع غير قابلة للذوبان. حفظ طاف.
6. الجمع بين أحجام متساوية (~ 1.0 مل) من electroporated المحللة زنزانة مع 50 ميكرولتر من Streptavidin الراتنج تعليق الاغاروز في 4 درجات مئوية خلال الليل مع نهاية الإفراط في نهاية التناوب. ملاحظة: هذا الراتنج يلتقط البروتين electroporated (والمجمعات المرتبطة بها) عبر ملزم streptavidin الببتيد العلامة تقارب لها.
7. أجهزة الطرد المركزي في 2،500 x ج لمدة 2 دقيقة وتجاهل طاف.
8. غسل مرتين مع 40 مجلدا السرير (~ 1 مل) PBS.
9. إضافة 30 ميكرولتر 4X LDS العازلة تحميل (141 ملي تريس قاعدة، 2٪ LDS، و 10٪ الجلسرين، 0.51 ملي EDTA، 0.22 ملي SERVA الأزرق G، 0.175 ملي الفينول الأحمر، ودرجة الحموضة 8.5)، و 20 ميكرولتر diH ₂ O، و 1 ميكرولتر من 0.5 M تريس (2-carboxyethyl) الفوسفين (TCEP)، والسماح لبعض وحدات التخزين بالبقاء في الخرز.
10. الحرارة على 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة وباردة على الجليد.
11. تدور> 10،000 x ج في 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
12. جمع طاف.
13. إجراء طخة غربية باستخدام الأجسام المضادة المناسبة ملاحظة: وإعادة، يتم استخدام المضادة للPKN1 الأجسام المضادة الأولية.

كما دليلا الأولي للمفهوم، وقدم النقى البروتين الفلوري الأخضر بنجاح في خلايا الثدييات باستخدام Electroporation لل. هو عرض GFP، تقريبي 27 دينار كويتي بروتين الوزن الجزيئي عادة في خلايا الثدييات (معبرا عادة من DNA البلازميد) كأداة البيولوجيا الجزيئية الخلوية دون سمية كبيرة. وحضنت خلايا هيلا (الشكل 1A) أو electroporated (الشكل 1B) مع 25 ميكروغرام / مل GFP، تليها المناعي متحد البؤر المجهري للتحقق من الفلورسنت إشارة GFP. لإثبات أن GFP كان داخل العصارة الخلوية الخلوية، وكانت ملطخة الخلايا أيضا مع راصة جنين القمح (WGA) لترسيم الحدود عصاري خلوي (الأحمر)، وكذلك وصمة عار الحمض النووي، دابي (الأزرق) للإشارة إلى النواة. وقد لوحظ داخل الخلايا إشارة GFP إلا بعد Electroporation لل، في حين لم يلاحظ أي البروتين داخل الخلايا في الخلايا المحتضنة مع GFP. ولوحظت نتائج مماثلة مع RAW264.7 الماوسالخلايا الشبيهة بلعم (الشكل 1C و1D). لاحظ أن WGA هو كتين التي ترتبط بشكل تفضيلي المخلفات في غشاء البلازما وبالتالي يمكن أن تظهر تلطيخ منقط على أساس طول الحضانة. قارن الشكل 1A والشكل 2A، حيث تم المحتضنة الشكل 2A لمدة أطول من الشكل 1A.

ثم تم تمديد Electroporation لللالموسومة، تنقية المستجيب السالمونيلا، GtgE. GtgE، وهو عامل الفوعة معروف ^30، تم اكتشافه من قبل مجموعتنا أن يفرز في الخلايا المضيفة ^31، وتبين مؤخرا أن يكون الأنزيم البروتيني السيستين ^32. وحضنت خلايا هيلا أو electroporated مع 50 ميكروغرام / مل GtgE. لتحليل المناعي، كانت ملطخة الخلايا مع أجسام مضادة ضد الببتيد العلامة تقارب ملزم streptavidin على GtgE. كانت ملطخة الخلايا أيضا مع WGA ودابي. في خلايا هيلا حضنت (فيقوإعادة 2A)، لا يوجد GtgE داخل الخلايا كما تصور بسبب عدم وجود بؤر الأخضر الفلورسنت. في المقابل، خلايا هيلا electroporated (الشكل 2B) وتبين ان كبير الفلورسنت إشارة داخل الخلايا البروتين مشيرا إلى المستجيب دخلت الخلايا بسبب عملية Electroporation لل. وأظهرت خلايا الخام وزيادة طفيفة الميل إلى تراكم البروتين على سطح الخلايا أثناء الحضانة (الشكل 2C)، ولكن كان ينظر إشارة داخل الخلايا إلا بعد Electroporation لل(الشكل 2D).

تحديد حدود الكشف لتصور التعريب شبه الخلوية عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر من المهم ضمان دخل ما يكفي من البروتين في الخلية، مع تجنب الحمولة الزائدة الخلية مع المستجيبات البكتيرية السامة. في الشكل (3)، وكان electroporated GtgE إلى خلايا تشبه البلاعم الخام عند 2.5، 25، و 50 ميكروغرام / مل. الخلايا ثم تم ثابتة وملطخة الأجسام المضادة ضد علامة على GtgE. Oنلي لوحظت في عدد قليل جدا من البؤر عند 2.5 ميكروغرام / مل GtgE (الشكل 3A)، مع أعداد متزايدة من بؤر واضحة في 25 ميكروغرام / مل، (الشكل 3B)، ولكن كان ينظر إلى أكبر عدد من البؤر متميزة في أقصى البروتين تركيز اختبارها، 50 ميكروغرام / مل (الشكل 3C). وقد لوحظت أنماط مماثلة تلطيخ بين عينات مبينا في هذه التركيزات البروتين البروتين داخل الخلايا يمكن التحقق منها بسهولة عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر. لم يتم اختبار تركيزات بروتين أعلى من 50 ميكروغرام / مل لأنه كما أن تركيز البروتين زيادة، وكذلك فعل ميل طبيعي للبروتين الهدف لتصبح كثف على سطح الخلايا. لتجنب هذه المجاميع من غشاء المرتبطة البروتين، أصبح من الضروري أن تجمع اثنين cuvettes Electroporation للللحصول على ما يكفي من البروتين التفاعل المضيف لتصور على لطخة غربية (الشكل 6، حارة اليمين المتطرف).

لمزيد من إثبات أن كثافة العملياتلم كثف البروتين العمليات roduced ببساطة إلى سطح الخلية، تم تصوير المقاطع البصرية متتالية في طائرات التنسيق كل 0،35-0،43 ميكرومتر (Z-مداخن) باستخدام متحد البؤر المجهري. تم electroporated الخلايا الخام مع 50 ميكروغرام / مل GtgE وملطخة على النحو المبين أعلاه (الشكل 4، A و B). أظهرت-مداخن Z أن GtgE كان في الواقع داخل وتمتد على بؤر من الأسفل (الشكل 4A، طائرة 6 من 36) إلى الجزء العلوي من الخلية (الشكل 4B، الطائرة 26 من 36). وتم الحصول على نتائج مماثلة لجميع البروتينات electroporated. تم فحص الملف الشخصى الفلورسنت لا يتجزأ من السكان الخلية السيطرة مع وبدون بروتين المستجيب أو Electroporation للمن الفلورسنت متحد البؤر المجهري، وجدت لتكون ضئيلة.

بالإضافة إلى ذلك، تم فحص البروتين electroporated لمعرفة ما اذا كان مستهدفا لتدهور عبر مسارات التقامي. كانت ملطخة خلايا لالمتعلقة رأس البروتين 5A (Rab5)، وهوعلامة للحصول على الإندوسومات الأولى (الشكل 4C)، أو المرتبطة يحلول بروتين الغشاء 1 (Lamp1)، وهي علامة للحصول على الإندوسومات المتأخرة والجسيمات الحالة (الشكل 4D). وسيكون الاشتراك في التعريب بين البروتين electroporated وهذه علامات تدل على وجود الخلوية التفاعل الجسدي الوثيق بينهما (أي أن البروتين electroporated كان داخل الإندوسومات / الجسيمات الحالة). وأظهر الفحص المجهري متحد البؤر أن البروتين electroporated (GFP أو GtgE) لم يشارك في توطين مع LAMP1 أو Rab5. ويستدل من ذلك أن أدخلت البروتين لم endocytosed مباشرة في الخلايا أو تستهدف مسار endocytotic في غضون أربع ساعات من العلاج.

خارجي البروتين مقدمة يمكن أن يكون لها آثار الخلوية على مدار عدة ساعات أو أيام، وبالتالي غالبا ما يكون من المفيد للنظر في استمرار البروتينات قدم. لتحديد متى بروتين electroporated سيستمر دون تدهور بعد Electroporation لل. س مقرهان التصور من التعلق وخلية الانتشار، تم تحديد 4 ساعة ليكون الحد الأدنى للوقت الانتعاش التقريبي للخلايا electroporated. لمراقبة زمنيا البروتين استمرار تم إجراء التجربة مرة بالطبع، تلطيخ الخلايا 4، 24، أو 96 ساعة بعد Electroporation لل. بعد 4 ساعات (الشكل 5A)، عندما اقترح مورفولوجيا الخلايا الانتعاش، وكان هناك كمية ملحوظة من البروتين داخل الخلايا. بعد 24 ساعة (الشكل 5B)، وكان لا يزال هناك بروتين electroporated كبير داخل الخلايا. حتى عندما يحين الوقت بعد Electroporation للتم تمديد إلى 96 ساعة قبل التثبيت وتلطيخ (الشكل 5C) كانت هناك بؤر ملاحظتها وإن كان ذلك على وفرة واضحة مخفضة، مما يدل أيام البروتين استمرار بعد العلاج الأولي.

وقد لاحظ اثنين من المحاذير الهامة خلال هذه التجارب. خلايا RAW أظهرت ميل أكبر من خلايا هيلا تتراكم البروتينات الخارجية على irre السطح الخلويspective من الحضانة (الشكل 6A) أو Electroporation لل(الشكل 6B). على الرغم من هذا، كانت جميع العينات electroporated زيادة البروتين الداخلي (الشكلان 1 و 2 و 5B). بالإضافة إلى ذلك، اختفى البروتين المرتبط الغشاء بمرور الوقت. وكان التحذير الثاني يبلغ عدد سكانها قليل من الخلايا العارضة النمط الظاهري تتكون من أصغر حجما، وتقريب خلايا محملة كميات عالية من البروتينات الخارجية في كل من السيطرة (المحتضنة) والمعالجة (electroporated) الخلايا (الشكل 6 C و D، وعينات حضانة تظهر). وأظهرت نوى هذه الخلايا لونين المكثف على أساس تلوين دابي، وملأت مجمل حجم الخلوي، موحية من موت الخلايا المبرمج. ولذلك فمن الممكن أن الخلايا أفكارك (الناشئة كجزء طبيعي من دورة الخلية أو بسبب الحصاد / العلاج) لديها الميل إلى استيعاب البروتين من المخزن المؤقت.

لإثبات أن البروتينات electroporated كانت الوظيفية ويمكن توطين كور ctly داخل الخلية المضيفة، وشارك في توطين والتفاعل البروتين البروتين بين البروتين السالمونيلا المستجيب SspH1 والهدف معروف المضيف لها، والبروتين كيناز N1 (PKN1) وظهر ^33. بعد Electroporation لل، تم التحقق من التفاعل الجسدي بين SspH1 وPKN1 من قبل مناعي أساس تقارب تليها طخة غربية (الشكل 7A). وقد لوحظ شارك في التعريب أيضا بواسطة المجهر متحد البؤر، مما يدل على fluorophores قريبة بما فيه الكفاية مكانيا إلى التداخل ^34. بعد Electroporation للمع 50 ميكروغرام / مل SspH1، خلايا هيلا (الشكل 7B) كانت ثابتة وملطخة للSspH1 (الخضراء) وPKN1 (الحمراء). في انخفاض قوة الليزر بؤر متميز (الصفراء) لوحظت في النواة مما يدل SspH1 وكانت PKN1 جسديا قريبة بما فيه الكفاية للتفاعل. وقد تم إنشاء هذا التفاعل في الأدب. لكن هذه الدراسة هي الأولى التي تظهر شارك في التعريب في النواة.

= "دائما">
الشكل 1: Electroporation للمن GFP - هيلا أو RAW 264.7 خلايا وحضنت الخلايا أو electroporated مع 25 ميكروغرام / مل من تنقية بروتين الفلورية الخضراء (GFP) وملطخة الأجسام المضادة لمكافحة GFP (الأخضر)، دابي، تحقيقا محددة النووي (الأزرق. )، وWGA (الأحمر) لترسيم الحدود عصاري خلوي. تظهر الخلايا المحتضنة (A) هيلا غياب مضان أخضر مما يدل على عدم استبطان GFP. (B) يظهر صورة مجهرية تمثيلية من GFP electroporated. لاحظ ظهور بؤر داخل الخلايا مما يدل قد GFP دخلت الخلايا. (C) و (D) هي صور تمثيلية من خلايا RAW حضنت (C)، أو electroporated (D) مع 25 ميكروغرام / مل من تنقية البروتين الفلوري الأخضر.

وفاق / ftp_upload / 52296 / 52296fig2highres.jpg "/>
الشكل 2: Electroporation للمن السالمونيلا المستجيب GtgE - خلايا هيلا حضنت الخلايا (A) أو electroporated (B) مع 50 ميكروغرام / مل من تقارب الموسومة السالمونيلا المستجيب، GtgE، وملطخة مضاد للالمستجيب العلامة الأضداد (الأخضر)، دابي، قناع النووي (الأزرق)، وWGA (الأحمر) لترسم الحدود عصاري خلوي. في (A)، حضنت تظهر خلايا هيلا غياب مضان أخضر مما يدل على عدم استبطان GtgE. (B) يظهر صورة مجهرية تمثيلية من electroporated GtgE، والتي تبين داخل الخلايا electroporated البروتين المستجيب. (C) و (D) هي صور تمثيلية ل خلايا الخام التي كانت إما المحتضنة أو electroporated، على التوالي، في نفس الأزياء مع 50 ميكروغرام / مل من السالمونيلا GtgE. الضوء الأزرق هو مزيج، أو تراكب، من مضان أحمر من WGA ومضان أخضر من الأجسام المضادة الثانوية.

الشكل (3): المعايرة من البروتين electroporated - خلايا تشبه البلاعم RAW تم electroporated الخلايا مع 2.5 ميكروغرام / مل (A)، و 25 ميكروغرام / مل (B)، أو 50 ميكروغرام / مل (C) السالمونيلا المستجيب GtgE وسمح لاستعادة ل. 4 ساعة. تم إصلاح الخلايا وملطخة الأجسام المضادة لمكافحة SBP العلامة (الخضراء) وقناع أنويتها، دابي (الأزرق). ومن الممكن تصور بؤر الفلورسنت، يدل على GtgE بين الخلايا عند 2.5 ميكروغرام / مل عبر microcopy متحد البؤر، على الرغم من أن تم الحصول على نتائج أفضل عندما استخدمت أعلى كمية الانطلاق من البروتين. وقد تم الحصول على نتائج مرضية (بما في ذلك داخل الخلايا البروتين ملاحظتها بسهولة بواسطة المجهر متحد البؤر دون غشاء المفرط المجاميع المرتبطة بها) في 50 ميكروغرام / مل لGtgE وبالتالي نس تم اختبار تركيزات أكبر.

الرقم 4: استيعاب البروتين وعدم التعاون مع التعريب علامات دخلول؛ جسيم داخلي شرائح الضوئية على التوالي (Z-مداخن) التي تم الحصول عليها بواسطة المجهر متحد البؤر لتصور إذا كان البروتين electroporated الداخلي. تم electroporated الخلايا الخام مع 50 ميكروغرام / مل GtgE. (A) يدل على شريحة البصرية 6 إلى 36، وض المكدس (2.1 ميكرومتر) فوق الجزء السفلي من الطبق. (B) ويظهر نفس مجال الرؤية ولكن في شريحة 26 من تمتد 36. بؤر داخل الخلايا في جميع أنحاء الخلية مما يشير إلى أن البروتين هو داخل الخلايا حقا وليس تجميعها على سطح الخلية. الضوء الأزرق هو مزيج من WGA الأحمر، والأجسام المضادة الثانوية الأخضر، والأزرق دابي. شارك في توطين مقايسة مع علامات الإندوسومات / الجسيمات الحالة، Rab5، (C) أو علامة يحلول، LAMP1 (D). تم ملطخة البروتين المستجيب الأخضر، وعلامات (Rab5 أو LAMP1) ملطخة الحمراء، ونوى يرسم مع دابي والأزرق. ليس هناك أي دليل من شارك في التعريب مع أي LAMP1 أو Rab5 تشير إلى أن البروتين لم phagocytized.

الشكل 5: استمرار البروتين بعد Electroporation للصورة مجهرية متحد البؤر تبين استمرار GtgE electroporated مع مرور الوقت. تم electroporated 50 ميكروغرام / مل GtgE إلى خلايا هيلا. الخلايا ثم تم ثابتة وملطخة الأجسام المضادة لمكافحة SBP العلامة (الخضراء) وقناع أنويتها، دابي (الأزرق). وكانت 4 ساعات (A) مصممة على أن يكون الحد الأدنى من الوقت للسماح للخلايا لاستعادة ويظهر كما هو متوقع أقصى البروتين داخل الخلايا. بعد 24 ساعة (B) و 96 ساعة (C)، بؤر الأخضر، سواء داخل الخلايا، وعلى سلسطح lular، وتظهر المستجيب استمرار تشير إلى أن البروتين هو ليس بعد أيام المتدهورة العلاج الأولي. اللون الأزرق الفاتح في هذه الصورة هو تراكب من دابي الأزرق والأخضر تلوين الأجسام المضادة.

الشكل 6: سطح الخلية البروتين تجميع والنمط الظاهري Electroporation للخلايا تشبه البلاعم الخام وحضنت إما (A) أو electroporated (B) مع 50 ميكروغرام / مل GtgE وملطخة مكافحة SBP العلامة الأضداد (الأخضر)، WGA (الأحمر )، ومع دابي (الأزرق). كل من خلايا هيلا الخام 264.7 وإلى درجة أقل، تميل إلى تجميع المستجيب على سطح الخلية؛ عرضت كل الخلايا electroporated قد زادت البروتين الداخلي (هيلا لا تظهر). الأصفر هو تراكب من الأحمر والأخضر من WGA من البروتين الهدف. RAW (C) وهيلا (D) خلايا showinز النمط الظاهري تغير بعد الحضانة مع GtgE (كما هو موضح). وأظهرت عدة تجارب النمط الظاهري تتألف من خلايا صغيرة مع فارق دابي تلطيخ وفقدان السيتوبلازم. الضوء الأزرق هو تراكب من WGA الأحمر، والأجسام المضادة الثانوية الأخضر، والأزرق دابي. تم استخدام المجهر متحد البؤر لإظهار البروتين الهدف تتراكم في النواة. لأن هذا النمط الظاهري للخلايا البروتين لادن الخارجية ظهر بعد كل من الحضانة و electroporation، يمكن للمرء افتراض هذا النمط الظاهري أن تكون موحية من موت الخلايا المبرمج.

الرقم 7: تفاعلات البروتين المضيف مع electroporated السالمونيلا SspH1 - خلايا هيلا تم electroporated الخلايا في تركيزات المدرجة مع SspH1، سمح لاسترداد لمدة 4 ساعة قبل إجراء تنقية تقارب تعديل تليها طخة غربية (A) لإثراء لوكشف عن شريك المتفاعل حقيقية النواة المعروفة: البروتين سيرين / ثريونين كيناز N1 (PKN1). لاحظ أن حارة اليمين المتطرف (2X EP) ويشمل 2 cuvettes المجمعة، والإشارة من كفيت واحد المخلوطة في الخلفية، ولكن كان لا يزال PKN1 المخصب فوق قلة ملزمة ينظر في التحكم لم الطعم. تم تشغيل وصمة عار الغربية مع الأصلي هيلا المحللة، تنقية SspH1، وعينات تنقية تقارب قبل أن يتم وبحث مع الأجسام المضادة وحيدة النسيلة لPKN1. تم الحصول على كشف الأهداف عن طريق الأجسام المضادة الثانوية الفجل البيروكسيديز مترافق مع التفاعل ضد نمط إسوي من الأجسام المضادة الأولية. خلايا هيلا (B) تظهر شارك في التعريب (الأصفر) بين PKN1 (أحمر) وSspH1 (الخضراء) عبر بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر بعد Electroporation للمع 50 ميكروغرام / مل SspH1. يشير هذا التداخل البصري أن المستجيب والبروتين المضيفة هي قريبة بما فيه الكفاية للتفاعل جسديا. حقيقة أن التفاعل كان يظهر في نواة لأول مرة، ويقدم دعما إضافيا أنتم الاتجار بهم البروتين بشكل صحيح من قبل المضيف.

وقد تطورت المستجيبات يفرز من البكتيريا المسببة للأمراض على العمل ضمن بيئة الخلية المضيفة، وبالتالي فإنه من المفيد لدراستها في الموقع الطبيعي داخل المضيف. إدخال مؤثرات محددة من الفائدة في الخلايا المضيفة تسمح للتفاعلات الممرض في استضافة ذات الصلة لدراستها في عزلة دون تدخل من البروتينات البكتيرية الأخرى. وكان الهدف هو استكشاف Electroporation للكوسيلة لإدخال البروتينات المستجيب البكتيرية في الخلايا المضيفة حقيقية النواة، وبالتالي تجنب بعض التحديات المرتبطة ترنسفكأيشن أو تنبيغ. تم استخدام البروتين الفلوري الأخضر كوسيلة لمراقبة وتم اختبار السالمونيلا البروتينات المستجيب. بسبب الاهتمام في مسببات الأمراض البكتيرية التي تستهدف استضافة الخلايا الظهارية وكذلك الخلايا المناعية، واستخدمت خط البشري مثل الظهارية الخلية (هيلا) والخلايا الشبيهة بلعم الماوس (RAW 264.7). Electroporation للبروتينات يمكن أن يحقق الخارجية في الخلايا المضيفة مع أي انخفاض ملموس في viabili خليةوكانت تاي، والبروتينات تسليمها كشفها في الخلايا لمدة تصل إلى أربعة أيام.

لعزل آثار البروتين electroporated، مطلوب من البروتين النقي. في هذه الدراسة، وأعرب عن البروتينات في E. القولونية سلالة BL21 مع بطاقة polyhistidine N-محطة وstreptavidin ملزم الببتيد. وتنقيته البروتينات مع الراتنج ني NTA، يعاير لتركيز (عادة ما بين 5-25 ملغ / مل)، والنقاء، وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى Electroporation لل. ان البروتينات المنتجة تجاريا أيضا أن تكون مقبولة ل electroporation، لأنها تميل إلى أن تكون عالية النقاء، وتميزت أيضا.

الخطوات الرئيسية في هذا البروتوكول شملت إزالة تماما مستنبت الخلية عن طريق الغسيل وتعليق الخلايا في عازلة خالية من البروتين. وهذا يضمن أن أي الظواهر المصب لوحظ ومن المقرر أن البروتين خارجي من الفائدة وليس للبروتينات الموجودة في مستنبت. وقد لوحظ كفاءة أفضل من Electroporation للعندما كانت كثافة الخليةأعلى (على سبيل المثال 6 × 10 ⁶ مقابل 1 × 10 ⁶ خلايا)، على الرغم من أن أفضل عدد الخلايا سوف تختلف مع حجم الخلية ونوع. وكانت آخر خطوة حاسمة في التجربة للسماح للخلايا الوقت للتعافي وأعد لأطباق. كان هذا ضروري لأن استخدمت الخلايا الملتصقة في هذه الدراسة. وينبغي أن يكون فترة نقاهة أقل أهمية للخلايا تعليق، على الرغم من أنه قد يكون من الضروري إعطاء بروتينات الوقت للاتجار السليم داخل الخلايا، البروتين البروتين التفاعلات، أو النشاط الأنزيمي، اعتمادا على طبيعة الدراسة المقصودة. منذ لوحظت البروتينات تسليمها داخل الخلايا لمدة تصل إلى 96 ساعة، وهناك مجال كبير للتكيف لفترة حضانة المرض قبل المجهري التصور أو الفحص الخلوي.

قد يكون الأمثل العديد من المتغيرات في هذا البروتوكول لأنواع مختلفة خلية والأهداف البروتين، أو مخططات تحليل المصب. كمية البروتين إلى أن electroporated يمكن أن يكون صقل للتركيز داخل الخلايا المطلوبة. FOص التصور من البروتين التعريب، يمكن أن تستخدم ما لا يزيد عن 1 ميكروغرام. للدراسات وظيفية، قد تكون هناك حاجة إلى كميات بداية أعلى من البروتينات. وبالإضافة إلى ذلك، فإن كمية الوقت اللازم للشفاء الخلايا بعد electroporation يمكن قلل أو توسيع نطاقها. أن أهداف البروتين عطوب أو عمليات المصب سريعة تتطلب فترة حضانة أقصر. أيضا، كمية من الخلايا مطلي يمكن تعديل ما وراء اقتراحات هنا. يمكن مطلي الخلايا أكثر قليلة إذا كان البروتين قدم هو أن يتم رصدها بواسطة المجهر، أو مطلي أكثر كثافة إذا كان البروتين هو electroporated التي سيتم استردادها لتطبيقات مثل البقع الغربية.

في حين Electroporation للهي طريقة بسيطة ومباشرة لإدخال البروتينات في الخلايا الحية، وهناك بعض القيود على هذه التقنية. يتطلب أسلوب بروتينات نقية للغاية في كميات ميكروجرام. تم electroporated اقل من 1 ميكروغرام وتصور مع المجهري متحد البؤر، ولكن أعطى كميات بداية أعلى من البروتين BETTإيه النتائج البصرية. في حين لم يكن تقييم وظيفة البروتين في جميع التركيزات بعد Electroporation لل، وطلب من تركيزات البروتين يساوي أو أكبر من 50 ميكروغرام / مل للإشارة كافية لطخة غربية. أيضا، نظرا لضيق حجم cuvettes Electroporation لل، زيادة قد تتطلب معالجة cuvettes متعددة من الخلايا. ومع ذلك، معتبرا أن عملية Electroporation لليأخذ مجرد ثوان مرة واحدة يتم إعداد الخلايا، المعالجة المتوازية يتطلب القليل من الوقت والجهد الإضافي.

إذا كان البروتين قدم هو أن تصور من قبل الغرب وصمة عار، المجهري، أو تستخدم لتنقية تقارب، وينبغي أن يكون البروتين علامة ³⁵ لتنقية تقارب أو الأجسام المضادة متاح للكشف. ومع ذلك، لأسباب غير معروفة، وكانت بعض التفاعلات المعروفة من الكتب أو أساليب الكيمياء الحيوية الأخرى (لا تظهر البيانات) غير قادرة على أن لخص بعد Electroporation لل. قد يكون من أن المضيف يعترف بعض البروتينات electroporated كما ومالية أجنبية وسرعان ما يمثل لهم لتدهور proteasome و.

Electroporation لليحمل العديد من المزايا مقارنة مع الطرق الأخرى القائمة لتسليم البروتين. مقارنة حقن مكروي، Electroporation للهو أسرع بكثير وأبسط، ويمكن علاج عدد كبير من الخلايا في وقت واحد مع ما يقرب من 100 في المئة جدوى لظروف اختبارها. Electroporation للهو أيضا أرخص من البروتين ترنسفكأيشن مع الكواشف المتاحة تجاريا. وغالبا ما تستخدم transfections DNA لدراسة البروتينات المستجيب البكتيرية في الخلايا المضيفة؛ ومع ذلك، وهذا يتسبب في البروتينات البكتيرية ليتم توليفها غير مثالي من قبل المضيف. من ناحية أخرى، Electroporation للمن البروتينات البكتيرية يزيل الاعتماد على الثدييات الآلات البروتين التعبير، والسماح لتمثيل أفضل للعملية المعدية حيث يتم التعبير عن البروتينات المستجيب من البكتيريا.

العديد من التطبيقات يمكن استخدام البروتين Electroporation للكأسلوب في دراسة INTERA البكتيرية المضيفةctions. أولا، الخلايا الأولية التي غالبا ما يصعب بالنقل قد تكون أكثر استعدادا لElectroporation للللتسليم البروتين. وهذا سوف يسمح لدراسة وظيفة المستجيب في أنواع الخلايا أكثر بيولوجيا ذات الصلة. Electroporation للأيضا يعطي الخيار من البروتينات المتنوعة و / أو العلاجات. على سبيل المثال، يمكن إدخال بروتينات متعددة في وقت واحد، أو يمكن أن يتم تسليم الأدوية والجزيئات الصغيرة الأخرى جنبا إلى جنب مع البروتينات. الأهم للحصول على فهم الوظيفي للتأثير البروتينات قدم، يمكن أن يقترن البروتين Electroporation للمع فحوصات من أجل وظيفة البروتين والتفاعلات، مثل تنقية تقارب، البقع الغربية ضد أهداف معروفة، وتحليل التعبير خلية كاملة، والفحص المجهري لتحديد التحت خلوية توطين البروتين قدم. وبالتالي، فإن هذا الأسلوب له إمكانات كبيرة كأداة لتوضيح البكتيري الممرض البيولوجيا جنبا إلى جنب مع غيرها من تقنيات البيولوجيا الخلوية والجزيئية.

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

This work was supported by NIGMS, National Institutes of Health (GM094623). Significant portions of this work were performed in the Environmental Molecular Sciences Laboratory, a DOE/BER national scientific user facility located at the Pacific Northwest National Laboratory (PNNL). PNNL is operated for the DOE by Battelle under Contract DE-AC05-76RLO1830.