فصل الأدمة الجنينية الماوس الوجه واللحمة المتوسطة

يوصف بروتوكول للفصل الجنين الأديم الظاهر الوجه واللحمة المتوسطة. نستخدم Dispase II لعلاج الأجنة كلها أولا، تشريح الوجه كله من البروز، ومن ثم فصل الأديم الظاهر الوجه واللحمة المتوسطة.

انشقاقات فموي وجهي هي العيوب الأكثر شيوعا القحفي، والتي تؤثر 1.5 في الأطفال حديثي الولادة ^1،2 1000 في جميع أنحاء العالم. ويتسبب clefting فموي وجهي غير طبيعي من قبل ³ التطوير الوجه. في النمو، والماوس الإنسان الأولية والزخرفة من الوجه تعتمد على براعم صغيرة عدة من الأنسجة، والبروز الوجه ^4،5. مشتق من ست وجه البروز رئيسية هي: العمليات المقترنة الجبهي الأنفي (FNP)، البروز للفك العلوي (MXP) والبروز الفك السفلي (MDP). هذه النتوءات تتكون من تورمات من اللحمة المتوسطة التي هي المغطى في ظهارة الفوقية. وقد أظهرت الدراسات في الأنواع المتعددة التي يشير الحديث المتبادل بين الأديم الظاهر الوجه واللحمة المتوسطة هو أمر حاسم لتشكيل الوجه ^6. بعد وتفاصيل الآلية المتعلقة الجينات المسؤولة عن هذه التبديلات يشير تعاني من نقص. طريقة واحدة للحصول على فهم شامل للالتعبير الجيني، عامل النسخ ملزم، وعلامات لونين المرتبطة develoالأديم الظاهر بينغ الوجه واللحمة المتوسطة هو عزل وتوصيف المقصورات الأنسجة فصل.

هنا نقدم طريقة لفصل الأديم الظاهر الوجه واللحمة المتوسطة في يوم الجنينية (E) 10.5، مرحلة حاسمة في تشكيل التنموية الماوس الوجه التي تسبق التحام نتوءات. ويتم تكييف أسلوبنا من النهج الذي قد استخدمت في السابق لتشريح الوجه البروز ^7. في هذه الدراسة في وقت سابق قد استخدمناها C57BL الفطرية / 6 الفئران وهذه السلالة أصبحت معيارا لعلم الوراثة، علم الجينوم وعلم التشكل الوجه ^8. هنا، على الرغم من، ونظرا لكميات محدودة من أنسجة أكثر المتاحة، وقد استخدمت لدينا الأباعد CD-1 السلالة التي هي أرخص لشراء، أكثر قوة للتربية، وتميل إلى إنتاج المزيد من الأجنة (12-18) في القمامة من أي الفطرية الماوس سلالة ^8. بعد العزلة الجنين، وكان يستخدم محايدة البروتيني Dispase II لعلاج الجنين كله. ثم، وكان البروز الوجه تشريحتم فصل إد بها، والأديم الظاهر الوجه من اللحمة المتوسطة. هذه الطريقة تحافظ على كل من الوجه والأديم الظاهر اللحمة المتوسطة سليمة. يمكن استخدام عينات تم الحصول عليها باستخدام هذه التقنيات بما في ذلك منهجية لكشف البروتين، لونين مناعي (رقاقة) فحص والدراسات ميكروأري، ويليها RNA.

1. إعداد Dispase II

1. إعداد جديدة HEPES-مخزنة المالحة (HBS) (ملي Hepes 50 / KOH درجة الحموضة 7.4، 150 مم كلوريد الصوديوم). إضافة 2 مل 0.5 م HEPES / KOH درجة الحموضة 7.4 و 1.2 مل 2،5 M كلوريد الصوديوم في 16،8 مل النقاوة O. ₂ H
2. جعل 10 ملغ / مل II Dispase. تزن 0.2 غرام Dispase II (روش، القط # 4942078001) وتذوب في HBS مل 20. إعداد 1،0 مليلتر مأخوذة في أنابيب إيبندورف الفردية وتخزينها في -20 درجة مئوية لمدة طويلة الأجل التخزين.
3. تمييع 10 ملغ / مل Dispase 1:10 II في برنامج تلفزيوني قبل الاستخدام. وضع المخفف Dispase II على الجليد.

2. تشريح CD-1 الأجنة الإناث الحوامل من E10.5

أجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا للبروتوكولات المعتمدة من قبل رعاية الحيوان جامعة دنفر كولورادو (UCD) واللجنة الإشتخدام. تم الحصول على CD-1 (ICR) من الفئران المختبرات هارلان (إنديانابوليس، IN).

1. تنظيف المنطقة وأدوات تشريح مع الايثانول 70٪.
2. الموت ببطء الحوامل CD-1 الإناث باستخدام approvبروتوكولات أد.
3. رش البطن مع الايثانول 70٪ ثم فتح البطن. استخدام مجموعة واحدة من ملقط لسحب الرحم وآخر لالمسيل للدموع بعيدا مسراق الرحم من الرحم. إزالة الرحم من الجسم. تكرار للقرن الرحم على الجانب الآخر من البطن.
4. شطف لفترة وجيزة الرحم مع الثلج الباردة PBS في طبق بتري 10-سم لتغسل الدم.
5. نقل الرحم في طبق بتري جديد مع الثلج الباردة PBS. منفصلة في جنين واحد عن طريق قطع أجزاء بين المواقع التوطين.
6. نقل جنين واحد في الجليد الباردة PBS تحت stereomicroscope. استخدام ملقط غرامة لتمزيق قبالة الجدار العضلي للرحم ابتداء من الساعة واحدة من مواقع قطع لفضح الجنين مع كيس الصفار. تقشر كيس المح والسلى. نقل الأجنة إلى تشريح طبق بتري 6 سم مع PBS على الجليد. المضي قدما إلى أن يتم جمع جميع الأجنة بهذه الطريقة.

3. Dispase II العلاج

1. غسل جميع الأجنة مع PBS في طبق بتري 6 سم. استبدلPBS مع 10 مل II Dispase المخفف في برنامج تلفزيوني. تغطية طبق بتري واحتضان في C ° 37 لمدة 25 دقيقة - حاضنة أو البكتيرية غرفة دافئة ينبغي أن يكون كافيا - ونحن لم تستخدم CO ₂ حاضنة زراعة الأنسجة لهذه الخطوة.
2. اتخاذ طبق بتري بها ومراقبة الجنين تحت stereomicroscope. تتميز الأديم الظاهر ينبغي أن تصبح فضفاضة، من خلال وجود فجوة واضحة بين هذه الطبقة نسيج اللحمة المتوسطة والأساسية. إن لم يكن، لاحتضان 5 دقائق إضافية في 37 ° C. ثم وضع طبق بتري على الجليد.

4. تشريح خارج البروز سليمة الوجه

1. استخدام الزجاج القابل للتصرف ماصة (VWR، القط # 14672-380) أن ينقل واحد Dispase II تعامل الجنين في الجليد الباردة PBS في طبق بتري 6 سم تحت stereomicroscope.
2. استخدام ملقط زوج واحد من عقد الجنين. استخدام زوج آخر من ملقط غرامة بعناية لخفض حدود البروز الوجه تعلق على الرأس (الشكل 1 يبين حدودوالبروز الوجه). تبدأ من جانب واحد من حركة الأشخاص الطبيعيين، ثم MXP، ومشاركة وFNP. أن تفعل الشيء نفسه في الجانب الآخر لتشريح الوجه من البروز سليمة (الشكل 2A).

5. الوجه منفصلة عن الأدمة اللحمة المتوسطة

1. مراقبة البروز الوجه تحت stereomicroscope مع 3X مسافة العمل. استخدام الزجاج طويلة باستور ماصة للماصة بلطف البروز الوجه صعودا وهبوطا 5 مرات. بعد هذا، والأديم الظاهر من السهل أن تقشر.
2. استخدام ملقط زوج واحد من عقد البروز في الوجه. استخدام ملقط أخرى من الزوج لقشر قبالة ببطء شديد الأدمة. 2B الشكل يبين ورقة فصل من الأديم الظاهر الوجه.
3. استخدام الزجاج جديدة طويلة باستور ماصة لنقل الوجه الأديم الظاهر في أنبوب مل 1.5 إيبندورف مع PBS على الجليد. نقل اللحمة المتوسطة إلى آخر أنبوب إيبندورف 1،5 مل مع برنامج تلفزيوني على الجليد.
4. استخدام الجليد الباردة PBS جديدة لكل تشريح. جمع العينات.
5. يغسل رانه مع عينات PBS. أجهزة الطرد المركزي في 4 درجات مئوية، 500 x ج لمدة 3 دقائق.
6. نضح في PBS باستخدام ماصات باستور الزجاج طويلة. إذا كانت العينات لاستخدامها في فحص المعالج، انتقل إلى الخطوة 6.1. لاستخراج الحمض النووي الريبي، انتقل إلى الخطوة 6.2. لاستخراج البروتين، انتقل إلى الخطوة 6.3.

6. عينات لمزيد من التجارب العملية

1. عينات للفحص رقاقة
   1. إضافة 1 مل PBS مع 1٪ إلى الفورمالديهايد تشعبي. التجانس العينات.
   2. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة مع التناوب.
   3. إضافة 110 ميكرولتر من جليكاين M 1.25 إلى كل أنبوب لإرواء الفورمالديهايد غير المتفاعل.
   4. خلط واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
   5. تدور في 500 XG في C ° 4 لمدة 3 دقائق. إزالة طاف.
   6. إضافة 1 مل PBS الباردة لغسل الأنسجة.
   7. تدور في 500 XG في C ° 4 لمدة 3 دقائق.
   8. إزالة PBS وتكرار غسل PBS مرة واحدة.
   9. إزالة طاف، التقط تجميد الأنسجة في النيتروجين السائل. تخزين SAmples في -80 درجة مئوية لمدة تجميع ومعالجة لاحقة.
2. عينات لاستخراج الحمض النووي الريبي
   1. وضع الأديم الظاهر الوجه واللحمة المتوسطة في أنابيب تحتوي على RNAlater (Ambion).
   2. احتضان العينات في محلول RNAlater بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية للسماح للاختراق شامل للأنسجة.
   3. المحل في -20 درجة مئوية لتجميع ومعالجة لاحقة.
3. عينات لاستخراج البروتين

إضافة إلى تحلل العازلة العينة لمعالجتها لاحقا. أو المفاجئة تجميد الأنسجة في النيتروجين السائل. تخزين العينات في -80 درجة مئوية لمدة تجميع ومعالجة لاحقة.

تلاحظ

1. ضيق الوقت. تخطيط الموارد البشرية في الفترة 4-6 من بداية تشريح حتى بداية القسم 6.
2. عندما يتقن، فإنه يأخذ 10-15 دقيقة ~ في جنين لتنفيذ القسمين 4 و 5 (تشريح أهمية وفصل الأديم الظاهر).
3. إذا كانت العينات لعزل الحمض النووي الريبي، كل محلولينبغي أن يعامل ن مع Diethylpyrocarbonate الأولى. أيضا تنظيف ملقط ومنطقة العمل مع ريبونوكلياز بعيدا.
4. الحفاظ على العينات على الجليد في جميع الأوقات باستثناء لعلاج II Dispase وتشريح. تغيير جديد PBS الباردة الجليد لكل تشريح للتأكد من أن تستخدم لتشريح PBS بارد.
5. ملقط حاد حاسمة للحصول على تشريح دقيق. تنظيف ملقط تماما لمنع أي تلوث.
6. لجمع عينات من البروز المختلفة، تشريح كل على حدة بروز بعد العلاج الثاني Dispase. فصل ثم الأديم الظاهر واللحمة المتوسطة.
7. بعد العلاج مع Dispase II، والأديم الظاهر الوجه من السهل أن تقشر. إيلاء اهتمام خاص للتلوث من الأديم الظاهر أخرى. تجاهل كافة الأنسجة التي يحتمل تلوثها.
8. بمجرد أن تبدأ، لا تتوقف حتى تصل إلى نقطة عينات مناسبة في القسم 6. إنهاء الفصل بين الأديم الظاهر الوجه واللحمة المتوسطة لجميع الأجنة بأسرع ما يمكن.
9. هقد أنشطة nzyme الثاني Dispase تكون مختلفة بين دفعات، والعلامات التجارية. لا بد من ضبط الوقت لعلاج مختلف العلامات التجارية ودفعات من Dispase II.

بعد العلاج الثاني Dispase، والأديم الظاهر للجنين يميل إلى أن يكون فضفاض. يجب أن تكون سليمة البروز الوجه بعد تشريح (الشكل 2A). الأديم الظاهر معزولة الوجه واضحة وخالية من الأنسجة اللحمة المتوسطة (الشكل 2B). لتحديد مدى فعالية من البروتوكول وللكشف عن التلوث عبر الدماغ الأمامي لأننا يعاير أعرب Zic3 ^9، الأدمة محدد ⁵ cdh1 والوسيطة المحددة sox10 ¹⁰ باستخدام PCR الناسخ العكسي. دراساتنا أكد أن كلا من الأديم الظاهر الوجه واللحمة المتوسطة أعرب عن الجينات المتوقعة وكانت خالية من التلوث المتبادل (الشكل 3).

الشكل 1. الرسم التخطيطي تبين الماوس البروز E10.5 الوجه. مشاهدة الجانبي (يسار) من الرأس وعرض منقاري (يمين) من رأس الجنين E10.5. الأحمر dotteد تشير خطوط الحدود من البروز في الوجه. بروز جبهي أنفي (FNP)، بروز الفك العلوي (MXP)، بروز الفك السفلي (MDP).

الشكل 2. ظهور نتوءات E10.5 تشريح كامل الوجه والوجه الأديم الظاهر. (A) نتوءات الوجه الجامعة. (B) الأديم الظاهر الوجه. لوحات A و B التكبير نفسه. ضعه في أعلى B يظهر التكبير واحد من الأديم الظاهر في الوجه B الفريق. بروز جبهي أنفي (FNP)، بروز الفك العلوي (MXP)، بروز الفك السفلي (MDP).

الشكل 3. أكدت عكس المنتسخة PCR الأديم الظاهر أن كلا من الوجه وخالية من اللحمة المتوسطة عبر التعاونتم استخراج ntamination. RNA من إجمالي الأديم الظاهر الوجه (E) واللحمة المتوسطة (M). وقد كتب العكس RNA DNA المكملة له في ([كدنا])، تليها PCR مع الاشعال محددة للكشف عن التعبير عن الأكتين بيتا (B-الأكتين)، Zic3، وcdh1 sox10. تم الحصول على تسلسل التمهيدي في الجدول 1 من البنك التمهيدي ( http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/ ). تم فصل المنتجات PCR على هلام الاغاروز 2٪. DNA سلم (L).

الجدول 1. تسلسل التمهيدي.

هذا البروتوكول يوفر طريقة مباشرة لفصل الجنينية الماوس الأديم الظاهر الوجه واللحمة المتوسطة على أساس خطوة Dispase العلاج الأولي II. في الدراسات السابقة، فقد أجرينا تشريح الوجه البروز قبل المعالجة II Dispase، ولكن وجدنا دائما أن يصبح اللحمة المتوسطة "لزجة" وأكثر صعوبة للتلاعب. بروتوكول الجديد يتجنب هذه المشكلة. الجمع بين العلاج مع Dispase II القوة البدنية لطيف من قبل pipetting صعودا وهبوطا يجعل الفصل بين الأديم الظاهر واللحمة المتوسطة أسهل. علاوة على ذلك، هذا البروتوكول أيضا يعمل بشكل جيد لفصل عينات أخرى الأديم الظاهر واللحمة المتوسطة الجنينية، مثل برعم الطرف الأديم الظاهر واللحمة المتوسطة مع علاجية أقصر II Dispase. وبالمثل، يمكن استخدامه في مراحل أخرى من التنمية - على سبيل المثال، لفصل E11.5 الأديم الظاهر الوجه واللحمة المتوسطة مع خطوة تعد Dispase العلاج II.

حجم العينة التي تم الحصول عليها من PROMIN E10.5 الوجه الماوسسينعقد صغيرة جدا، وبالتالي فإننا نميل لتخزين دفعات في نهاية المطاف لمعالجة وتحليل. في هذا الصدد لا بد من عينات الأدمة بركة 100-150 الأجنة للحصول على 10 ملغ من الأنسجة. مشتق كمية أكبر من اللحمة المتوسطة من كل جنين تتطلب قدرا أقل من تجميع. العائد من الحمض النووي الجيني للمقايسة sonicated رقاقة حوالي 80 ميكروغرام من الأديم الظاهر 10 ملغ الوجه. العائد الحمض النووي الريبي مجموع حوالي 20 ميكروغرام في الأديم الظاهر 10 ملغ الوجه. من فحص البروتين مقارنة برادفورد، فإننا نقدر أن نتمكن من الحصول على ما يصل إلى 1 في البروتين ملغ 10 ملغ الأديم الظاهر الوجه. وبمجرد أن RNA، لونين، أو عينات البروتين هي في متناول اليد، يمكن أن تستخدم لأنها المقايسات عديدة من بينها كشف عن البروتين، فحص المعالج، وتحليل ميكروأري، ويليها RNA. لذلك، هذا البروتوكول يتيح إجراء تحليل دقيق في التعبير الجيني الفرق، وتعديل جينية، وعامل النسخ ملزم المسؤولة عن الحديث المتبادل بين الجزيئية الأديم الظاهر الوجه واللحمة المتوسطة أثناء التطور الجنيني.

الكتاب ليس لديهم المصالح المتنافسة أو الصراعات الأخرى المرتبطة محتويات هذه المقالة.

فإن الكتاب أود أن أشكر إيرين تشوي لتوضيح رؤساء الجنين في الشكل (1) والأعضاء الآخرين في المختبر للحصول على مساعدة والمناقشة. ويدعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح DE012728 (TW)