Nekroz, Apoptoz ve Trombosit Aktivasyonu Özellikleri Sergileyen Prokoagülan Trombositlerin Kapsamlı Analizi

Araştırmamız, yeni biyobelirteçleri ve terapötik hedefleri belirlemek amacıyla antifosfolipid sendromu ve kanser gibi protrombotik durumlar sırasında trombosit metabolizmasını ve sinyalleşmesini anlamaya odaklanmaktadır. Grubumuz, trombosit metabolizmasının trombosit aktivasyonuna ve tromboza nasıl katkıda bulunduğuna dair son zamanlarda artan ilginin ön saflarında yer almıştır. Tromboz riskinin yanı sıra antiplatelet ajanların terapötik etkinliğini belirlemek için hastaların dolaşımındaki trombosit aktivasyon durumunun doğru karakterizasyonu önemli bir zorluk olmaya devam etmektedir.

Aerobik glikoliz, pentoz fosfat yolu ve yağ asitlerinin beta oksidasyonu, trombositlerdeki ayırt edici enerji metabolizması yolları olarak çözülmüş ve terapötik hedefleme için potansiyelleri belirlenmiştir. Bu protokol, proagregatör trombositlerden farklı olarak prokoagülan trombositlerin yanı sıra apoptoz veya nekroz yoluyla hücre ölümü geçiren trombositlerin tanımlanmasına ve doğru fonksiyonel karakterizasyonuna yardımcı olur. Başlamak için, 100 mikrolitre trombosit süspansiyonuna 0,5 mikrolitre 0,5 molar stok kalsiyum klorür çözeltisi ekleyerek yıkanmış insan trombositlerini 2,5 milimolar kalsiyum ile takviye edin.

Trombositlerin bir kısmını uyarılmamış halde tutun ve kalan fraksiyonu oda sıcaklığında 15 dakika boyunca trombin ve konvülsan kombinasyonu ile uyarın. Stimülasyondan sonra, 100 mikrolitre uyarılmış trombosit süspansiyonuna bir annexin V, bir paket ve anti-CD62P antikorunun her birine bir mikrolitre ekleyin. Trombositleri karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.

30 dakika sonra, prokoagülan trombositleri ölçmek için numuneleri akış sitometrisi ile analiz etmeden önce eşit hacimde% 2 formalin ekleyerek trombositleri sabitleyin. Trombositlerin hazırlanması için, yıkanmış insan trombositlerini mililitre başına bir milyon trombosit konsantrasyonuna seyreltin ve 2.5 milimolar kalsiyum ile takviye edin. Mitokondriyal kalsiyum tespiti için trombositleri beş mikromolar ROD2 ile etiketleyin ve karanlıkta 30 dakika inkübe edin.

Kaspaz aktivasyon testi için trombositlerin hazırlanması için, trombositleri kalsiyum ile takviye ettikten ve bir fraksiyonu uyardıktan sonra, uyarılmış trombosit süspansiyonlarına aktif kaspaz etiketleme kalıbı ekleyin. Trombositleri karanlıkta 30 dakika inkübe edin. 30 dakika sonra, trombositleri akış sitometrisi ile analiz etmeden önce eşit hacimde% 2 formalin ekleyerek trombositleri sabitleyin.

Sonuçlar, trombinin hem fosfatidilserin hem de P-selektini eksprese eden trombositlerin oranında doza bağlı bir artışa neden olduğunu göstermektedir. Trombin stimülasyonu ayrıca trombositlerdeki mitokondriyal kalsiyum seviyelerinde zamana bağlı bir artışa neden oldu. Bununla birlikte, trombin stimülasyonu trombositlerde mitokondriyal membran potansiyelinin azalmasına neden oldu.

Trombin stimülasyonu kaspaz-8'i aktive etti, ancak trombositlerde kaspaz-3 veya 7'yi aktive etmedi.