Analisi completa delle piastrine procoagulanti che presentano caratteristiche di necrosi, apoptosi e attivazione piastrinica

La nostra ricerca si concentra sulla comprensione del metabolismo piastrinico e della segnalazione durante gli stati protrombotici, come la sindrome da anticorpi antifosfolipidi e il cancro, con l'intento di identificare nuovi biomarcatori e bersagli terapeutici. Il nostro gruppo è stato in prima linea in un recente aumento di interesse su come il metabolismo piastrinico contribuisca all'attivazione piastrinica e alla trombosi. La caratterizzazione accurata dello stato di attivazione piastrinica nella circolazione dei pazienti per determinare il rischio di trombosi e l'efficacia terapeutica degli agenti antipiastrinici rimane una sfida significativa.

La glicolisi aerobica, la via del pentoso fosfato e la beta ossidazione degli acidi grassi sono state svelate come le vie distintive del metabolismo energetico nelle piastrine e il loro potenziale è stato stabilito per il targeting terapeutico. Questo protocollo serve a facilitare l'identificazione e l'accurata caratterizzazione funzionale delle piastrine procoagulanti, distinte dalle piastrine proaggregatorie, nonché delle piastrine in fase di morte cellulare per apoptosi o necrosi. Per iniziare, integrare le piastrine umane lavate con 2,5 millimolari di calcio aggiungendo 0,5 microlitri di soluzione di cloruro di calcio 0,5 molari a 100 microlitri di sospensione piastrinica.

Mantenere una frazione di piastrine non stimolata e stimolare la frazione rimanente con una combinazione di trombina e convulsivante per 15 minuti a temperatura ambiente. Dopo la stimolazione, aggiungere un microlitro ciascuno di un'annessina V, una confezione e un anticorpo anti-CD62P a 100 microlitri di sospensioni piastriniche stimolate. Incubare le piastrine al buio a temperatura ambiente per 30 minuti.

Dopo 30 minuti, fissare le piastrine aggiungendo un volume uguale del 2% di formalina prima di analizzare i campioni mediante citometria a flusso per quantificare le piastrine procoagulanti. Per la preparazione delle piastrine, diluire le piastrine umane lavate a una concentrazione di un milione di piastrine per millilitro e integrare con 2,5 millimolari di calcio. Etichettare le piastrine con cinque ROD2 micromolari per la rilevazione del calcio mitocondriale e incubare per 30 minuti al buio.

Per la preparazione delle piastrine per il saggio di attivazione della caspasi, dopo aver integrato le piastrine con calcio e stimolato una frazione, aggiungere il dado di marcatura attiva della caspasi alle sospensioni piastriniche stimolate. Incubare le piastrine per 30 minuti al buio. Dopo 30 minuti, fissare le piastrine aggiungendo un volume uguale di 2% di formalina prima di analizzare le piastrine mediante citometria a flusso.

I risultati mostrano che la trombina ha indotto un aumento dose-dipendente della proporzione di piastrine che esprimono sia fosfatidilserina che P-selectina. La stimolazione della trombina ha anche causato un aumento tempo-dipendente dei livelli di calcio mitocondriale nelle piastrine. Tuttavia, la stimolazione della trombina ha comportato una riduzione del potenziale di membrana mitocondriale nelle piastrine.

La stimolazione con trombina attivava la caspasi-8 ma non la caspasi-3 o 7 nelle piastrine.