IVT reaksiyon bileşenlerini ayıran ve NTP tüketimini ve mRNA üretimini izlemek için kullanılabilecek hızlı bir kromatografik yöntem geliştirdik. Bu yöntemle IVT reaksiyonunu optimize edebilir, proses safsızlıklarının oluşumunu ve reaksiyonun maliyetini en aza indirirken mRNA verimini en üst düzeye çıkarabiliriz. Metodolojimiz, mRNA alanında öncüydü ve IVT reaksiyonunun analitik verilerinin birleştirilmesinin nasıl daha yüksek verim ve daha düşük maliyetlere yol açabileceğini gösterdi.
Alan şu anda Raman spektroskopisi gibi diğer hat içi proses analitik araçlarını araştırıyor, ancak kromatografi, çözme gücü ve yüksek hızı nedeniyle hala çok önemli bir yer tutuyor. IVT reaksiyonunun kapsamlı bir optimizasyonunu yapmak için deney yazılımı tasarımı ile yüksek verimli analitik araçların nasıl yakalanacağını gösterdik. Bu, litre başına 25 gramlık bildirilen her IVT reaksiyonu veriminin en yüksek olmasına yol açtı.
Yöntemimiz, hem mRNA hem de NTP konsantrasyonlarının kısa okuma süreleriyle aynı anda izlenmesine izin verir, bu nedenle neredeyse gerçek zamanlı IVT izleme için uygundur. mRNA alanı artık mRNA üretimine devam etmeye doğru ilerliyor ve elbette bu geçişi desteklemek için yeni nesil araçlar geliştiriyoruz. Başlamak için, enzimler hariç tüm reaktifleri, dakikada 300 devire ayarlanmış bir termo blokta 15 dakika boyunca 37 santigrat derecede çözün ve önceden ısıtın.
Her tüpü belirlenmiş bir in vitro transkripsiyon veya IVT numarası ve zaman noktası ile işaretleyin. Reaktifler çözülürken, iki mikrolitre 100 milimolar EDTA'yı 0,5 mililitrelik steril tüplere pipetleyin. Şimdi enzimleri dondurucudan çıkarın ve geçici olarak bir soğutucuda saklayın.
Uygun hacimlerde IVT reaktifleri ile 50 ila 100 mikrolitre reaksiyon karışımı hazırlayın. Tüm IVT reaktifleri karıştırıldığında son reaktif olarak T7 RNA polimeraz ekleyin. Hemen iki mikrolitre IVT karışımını çıkarın ve iki mikrolitre EDTA içeren önceden hazırlanmış 0,5 mililitrelik tüplere pipetleyin.
IVT karışımları içeren reaksiyon tüplerini termo bloğa yerleştirin ve 37 santigrat derecede inkübe edin. İstenen her zaman noktasında, reaksiyon karışımından iki mikrolitre IVT numunesini çıkarın ve EDTA içeren tüplere pipetleyin. Kromatografik analiz, NTP'lerin tamamen tükendiğini doğruladıktan sonra, EDTA ile toplu IVT reaksiyonlarını 50 milimolar nihai konsantrasyona kadar söndürün.
Fed-Batch IVT reaksiyonu için, her NTP ve magnezyum klorürün stoklarını karıştırın. Reaksiyonu kurduktan sonra, NTP konsantrasyonu% 10'un altına düştüğünde, toplu IVT reaksiyonuna uygun bir hacimde besleme ekleyin. İstenen mRNA üretimi elde edildikten sonra, EDTA ile tüm reaksiyonu 50 milimolar nihai konsantrasyona kadar etkisiz hale getirin.
Kolon koşullandırma için, analizden önce 12 saat boyunca oda sıcaklığında 0,1 mililitrelik bir analitik kolon dengeleyin. Kolon muhafazasında belirtilen yönü takip ederek kolonu kromatografik sisteme takın. Daha sonra sütunu 50 sütun hacmi çift damıtılmış su ile yıkayın ve ardından dakikada bir mililitre akış hızında 50 sütun hacmi MPA ile yıkayın.
Ardından, taban çizgisini oluşturmak için analizden önce yalnızca MPA enjekte eden en az üç boş örnek çalıştırın. Şimdi sistem uygunluk test numunesini ve kalibrasyon eğrisi numunelerini analiz etmeye devam edin. Sistem uygunluk testi için, kapatma reaktifi NTP'lerini, plazmid DNA şablonunu ve mRNA'yı birleştirin.
Şimdi, mobil faz A ile bilinen konsantrasyonda seyreltilmiş saflaştırılmış mRNA örneğini kullanarak kalibrasyon standardını oluşturun.Gerekirse, tüm NTP'ler için kalibrasyon eğrisini oluşturmak için 0.5, iki, beş, 10, 15 ve 20 mikromolar nihai NTP konsantrasyonlarına sahip standartlar oluşturun. Formülü kullanarak IVT numuneleri için gereken minimum seyreltmeyi belirleyin. Kromatografik analiz için seyreltmeden önce, söndürülmüş IVT numunesini girdaplayın ve aşağı doğru döndürün.
MPA ve sodyum klorürü konik bir cam şişeye pipetleyin, ardından söndürülmüş IVT örneğini ekleyin. Hazırlanan numuneyi vorteksleyin ve dört santigrat dereceye ayarlanmış otomatik numune alma cihazına yükleyin. Seyreltilmiş numuneden 25 mikrolitre analitik kolona enjekte edin ve her IVT numunesi için 260 ve 280 nanometrede absorbansı ölçün.
Tüm IVT numunelerinin analizini tamamladıktan sonra, sistem kararlılığını doğrulamak için sistem uygunluk testi standardını tekrar enjekte edin. Hızlı on-line analitik, zaman içinde mRNA üretiminin izlenmesine olanak tanır. Bu deneyde, IVT tampon bileşiminin IVT kinetiği üzerindeki etkisini karşılaştırdık.
Tampon A ile gerçekleştirilen IVT, en yüksek mRNA üretimi oranıyla sonuçlandı, ardından tampon B ve tampon C.IVT reaksiyonu da Fed-Batch olarak gerçekleştirilebilir. NTP'lerin tüketiminin izlenmesi, reaksiyona NTP'leri ve magnezyum klorürü besleyerek konsantrasyonun ayarlanmasına izin verir. Yem ilaveleri IVT reaksiyonunu seyrelttiğinden, IVT'deki mRNA konsantrasyonu her besleme baskısında düşer.
