Hücre içi zarların füzyon mekanizmasını incelemeye kararlıyız. Bu protokolde, endoplazmik retikulum membran füzyon proteini atlastinin GTP hidroliz döngüsü sırasında smFRET ile konformasyonel dinamiklerini gerçekleştirmeyi amaçlıyoruz. Atlastin, GTP hidroliz döngüsünde bir monomer veya dimer olarak bulunabilir.
Tek moleküllü deneylerde, uygun protein etiketleme ve immobilizasyon stratejileri bulmak zordur ve aşağıdakiler, GTP hidroliz döngüsü boyunca atlastinin konformasyonel dinamiklerini sunmaktadır. Toplu FRET ile karşılaştırıldığında, smFRET, farklı nükleotid yükleme durumları altında protein konformasyonlarını doğru bir şekilde izleyebilir, böylece modülatör moleküllerinin davranışı hakkında doğrudan bilgi sağlar. Farklı pozisyon stratejileri sırasında atlastinin GTP hidroliz döngüsünü tam olarak çözmek için smFRET'i kullandık.
Bulgularımızın, GTP hidroliz proteinlerinin incelenmesinde daha fazla konformasyonel dinamiği teşvik edeceğine ve nadir biyolojik sürecin yeni yorumlarını sağlayacağına inanıyoruz. Lamelin yüzeyini temizlemek için, sekiz lamel almak için cımbız kullanın ve bunları bir boyama kavanozuna koyun. Lamelleri örtmek için 50 mililitre aseton ekleyin ve boyama kavanozunu 30 dakika boyunca ultrasonik bir temizleyiciye koyun.
Lamelleri çift damıtılmış suyla üç kez durulayın ve ultrasonik bir temizleyicide metanol ile yıkayın. Daha sonra, boyama kavanozuna piranha çözeltisi ekleyin ve iki saat boyunca 95 santigrat derecede bir su banyosu su ısıtıcısında ısıtın. Kavanozu oda sıcaklığına soğuttuktan sonra, lamelleri altı kez çift damıtılmış suyla durulayın.
Boyama kavanozuna sodyum metoksit çözeltisi ekleyin ve 15 dakika boyunca ultrasonik temizleyiciye koyun. Lamelleri suyla duruladıktan sonra, boyama kavanozuna çift damıtılmış su ekleyin ve 15 dakika boyunca ultrasonik temizleyiciye koyun. Lamelleri boyama kavanozuna sıkıştırın ve nitrojenle kurulayın.
Kurumuş lamelleri başka bir boyama kavanozuna aktarın ve kavanozu 120 derecelik bir kurutma fırınında 30 dakika pişirin. Ardından, kavanozu bir desikatörde oda sıcaklığına soğutun. Bir behere 47,5 mililitre metanol, 2,5 mililitre asetik asit ve 0,5 mililitre trietoksisilan ekleyin ve eşit şekilde karıştırın.
Karışımı boyama kavanozuna aktarın ve 10 dakika inkübe edin. Lamelleri boyama kavanozunda çift damıtılmış suyla üç kez durulayın ve beş dakika boyunca sonikasyon yapın. Lamelleri su ile duruladıktan ve gösterildiği gibi nitrojen ile kuruttuktan sonra, lamelleri 10 santimetre çapında bir Petri kabına yerleştirin.
SVA-mPEG ve SVA-mPEG-Biotin'i yüksek tuzlu çözelti içinde 1:100 oranında çözün. Hazırlanan karışımı bir lamel üzerine bırakın ve başka bir lamel ile örtün. Lamelleri iki saat veya gece boyunca uygun nemde inkübe edin.
Modifikasyondan sonra, lamelleri ayırın, deiyonize su ile durulayın ve nitrojen ile kurutun. Modifiye edilmiş lamel dikkatlice 50 mililitrelik bir tüpe yerleştirin. Rosetta E.coli hücrelerinde eksprese edilen dinnamin benzeri protein atlastin veya ATL'nin GTPase alanını saflaştırdıktan sonra, 10 kilodaltonluk bir santrifüj filtre kullanarak protein tamponunu protein biyotinilasyon tamponuna değiştirin.
Protein biyotinilasyonu için, her biri 100 milimolar ATP, 100 milimolar magnezyum asetat ve 500 mikromolar D-biotin, 10 mikrolitre 100 mikromolar BirA biotin ligaz ve 50 mikromolar proteini bir mililitrelik son hacme kadar karıştırın. Karışımı gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, 10 kilodalton moleküler ağırlıklı kesme santrifüj filtre kullanarak serbest D-biotin'i çıkarın.
20 mikrolitre biyotinile proteini 20 mikrolitre 15 mikromolar streptavidin ile 20 dakika buz üzerinde inkübe edin. SDS-PAGE kullanarak protein biyotinilasyonunun etkinliğini tespit edin. LD555 ve LD655 floroforlarını dimetil sülfoksit içinde beş milimolar nihai konsantrasyona kadar çözün.
Etiketleme tamponunu hazırlamak için 25 milimolar HEPES, 150 milimolar potasyum klorür ve beş milimolar magnezyum klorürü karıştırın. 10 kilodaltonluk bir santrifüj filtre kullanarak protein tamponunu etiketleme tamponuna değiştirin. Molekül içi smFRET tahlilleri için, ATL1cyto-TK'yi LD555 ve LD655 ile 1: 1.2: 1.2 oranında 100 mikrolitrelik bir nihai hacme karıştırın.
Karışımı dört santigrat derecede beş saat inkübe edin. Moleküller arası smFRET tahlilleri için, ATL1cyto-K'yi LD555 ile inkübe edin ve ATL1cyto-K'yi LD655 ile dört santigrat derecede beş saat boyunca inkübe edin. Protein immobilizasyon odasını hazırlamak için, modifiye edilmiş lamel ve mikroskop lamını özelleştirilmiş çift taraflı bantla dikkatlice yapıştırın.
Altı kanallı bir mikroakışkan oda oluşturmak için hortumları ve uçları takın. Eşleme düzeltmeleri için, bir mikroskop lamına 10 mikrolitre %10 polistiren parçacıkları ekleyin ve bir lamel ile örtün. Ardından, toplam iç yansıma floresan mikroskobu altında, polistiren parçacıkları içeren bir görüş alanı seçin ve parlak alan modunda bir video çekin.
Aynı polistiren parçacığının merkez konumunu hem verici hem de alıcı kanallarda hizalamak için özel bir komut dosyası kullanın. Harita dosyasını TXT dosyası olarak kaydedin. Moleküller arası smFRET deneyleri için, LD555 etiketli ATL1cyto-K ile LD655 etiketli ATL1cyto-K-biotin ile bire bir oranda, bir milimolar GTP-gama-S nihai konsantrasyonu ile karıştırın.
Proteinleri dimerize etmek için karışımı bir saat buz üzerinde inkübe edin. ATL1cyto-T ve ATL1cyto-K moleküller arası smFRET deneyleri için LD555 etiketli ATL1cyto-T'yi LD655 etiketli ATL1cyto-K-biotin ile bir milimolar GTP-gama-S ile bire bir oranında karıştırın. Dimerize proteinler elde etmek için karışımı bir saat buz üzerinde inkübe edin.
Daha sonra, molekül içi smFRET tahlilleri için, LD555 ve LD655 etiketli ATL1cyto-TK'yi bir milimolar GDP ile bir saat boyunca buz üzerinde inkübe edin. Moleküller arası deneyler için, proteinleri hareketsiz hale getirmek için mililitre streptavidin başına 10 mikrogram 10 dakika inkübe edin. Molekül içi tahliller için, mililitre biyotinile anti-His antikoruna 10 mikrogram ekleyin ve proteinleri hareketsiz hale getirmek için 10 dakika inkübe edin.
İnkübasyondan sonra, seyreltilmiş ATL1 dimerini kanaldaki proteine ekleyin ve 10 dakika boyunca hareketsiz hale gelmesine izin verin. Kanalı bir inkübasyon tamponu ile iki kez yıkayın. Kanala 2.5 milimolar nihai konsantrasyonda benzoik asit ve PCD ekleyin.
Uyarma ışık kaynağı olarak 532 nanometre lazeri seçin. EMCCD kamerayı, verileri 30 milisaniyelik bir kare aralığında kaydedecek şekilde ayarlayın. Kaydedilen filmleri 16 bit TIFF formatında kaydedin.
Veri toplama işleminden sonra, kaydedilen filmlerden FRET parçalarını çıkarın. FRET parçalarını TXT formatında seçin ve kaydedin. TXT dosyalarından verileri ayıklayın ve MATLAB'da ev yapımı komut dosyalarını kullanarak FRET değerlerini hesaplayın.
Dağılım histogramını elde etmek için smFRET verilerini GaussAmp in Origin ile sığdırın.
