Mitokondri disfonksiyonu, nörodejeneratif ve metabolik bozukluklar başta olmak üzere birçok hastalıkla ilişkilidir. Bu nedenle, mitokondrinin lizozomlar tarafından nasıl düzenlendiğini anlayabilirsek, yeni terapötik stratejiler geliştirmeye yardımcı olur. Bu protokolde, mitokondriyal lizozom temasını görselleştirmek için çift renkli bir CLEM yöntemi gösterdik.
Bağıntılı ışık ve elektron mikroskobu, ışık mikroskobu ve elektron mikroskobunun avantajlarını birleştiren bir görüntüleme tekniğidir. Bu protokolde, mitokondriyal lizozom temasını görselleştirmek için çift renkli problar kullanarak CLEM'in avantajını en üst düzeye çıkarıyoruz. Geleneksel elektron mikroskobu örnekleme yöntemlerini kullanarak lizozomlar içinde bozulan mitokondriyi net bir şekilde ayırt etmek zordur.
Bu çalışma, lizozomların ve mitokondrinin efektör alanını açıkça gösteren yüksek çözünürlüklü CLEM sonucunu sunmaktadır. Lizozomlar içindeki mitokondri efektörlerini doğru bir şekilde ayırt etmek için çift renkli alma yöntemi kullanıldı. Araştırmamız, mitokondrinin lizozomlarla etkileşime girdiğini ortaya koydu.
Araştırmamız, mitokondrinin farklı dış streslere yanıt olarak lizozomlarla farklı şekillerde etkileşime girdiğini ortaya koymuştur. Bu fenomenlerin nedenlerini ve düzenleyicilerini inceleyerek, hücre içi mitokondriyal kalite kontrolünü anlama konusunda fikir edineceğiz. Başlamak için, HeLa hücrelerini 35 milimetrelik cam ızgara tabanlı kültür kaplarında bir çarpı 10 ila beş kuvvetinde bir yoğunlukta kültürleyin.
Ertesi gün, transfeksiyon reaktifini kullanarak hücreleri plazmitlerle %30 ila %40 oranında birlikte transfekte edin. Transfeksiyondan sonra, hücreleri 18 saat boyunca dimetil sülfoksit veya U18666A ve bafilomisin A1 ile tedavi edin. Konfokal görüntüleme için, kültür ortamını çıkarın ve hemen 30 ila 37 santigrat derecede 250 mikrolitre ılık fiksatif çözelti ekleyin.
Sabitleyiciyi hemen çıkarın. 1,5 mililitre taze sabitleyici ile değiştirin ve 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Daha sonra hücreleri 10 dakika boyunca üç kez yıkayın, her biri bir mililitre buz gibi soğuk 0.1 molar sodyum kakodilat tamponu ile.
Daha sonra, aldehiti söndürmek için bir mililitre soğuk 20 milimolar glisin çözeltisi ekleyin. Hücreleri buz üzerinde 10 dakika inkübe ettikten sonra, her biri 10 dakika boyunca üç kez soğuk 0.1 molar sodyum kakodilat tamponunda yıkayın. Daha sonra numune kabına 500 mikrolitre Amplex kırmızı solüsyonu ekleyin ve buz üzerinde beş dakika inkübe edin.
Daha sonra, Amplex kırmızı çözeltisini çıkarın ve hücreleri her biri 0.1 molar sodyum kakodilat tamponu ile 10 dakika boyunca üç kez durulayın. Üçe üç karo tarama modunda ilgilenilen hücrelerin etrafındaki alanı görüntülemek için konfokal bir mikroskop kullanın. 40 zamanlı bir objektif kullanarak ızgarayı ve ızgara çanağındaki harfleri tanımlamak ve kaydetmek için hem diferansiyel girişim kontrastını hem de floresan sinyallerini yakalayın.
40 kat objektif kullanarak hedef hücreleri yüksek büyütmede görüntüleyin ve bir Z-yığını görüntüsü elde edin. Amplex kırmızı lekeli hücreleri konfokal bir mikroskop kullanarak görüntüledikten sonra, dört santigrat derecede bir mililitre% 1 indirgenmiş osmiyum tetroksit ekleyin ve bir saat inkübe edin. Daha sonra numuneyi 10 dakika boyunca üç kez durulayın, her biri dört santigrat derecede damıtılmış su ile.
Kademeli bir etanol serisinde her seferinde oda sıcaklığında 15 dakika dehidre edin. Şimdi etanolü epoksi reçine ile üç ila bir, bir ila bir ve bir ila üç hacim oranlarında karıştırın ve her karışımdan toplam 300 mikrolitre hazırlayın. Her epoksi reçine karışımını tabağa dökün ve oda sıcaklığında bir saat inkübe edin.
Ardından, gömme kapsülünü taze epoksi reçine ile doldurarak hazırlayın. Tüpü veya kapsülü ilgilendiğiniz bölgede ters çevirin ve polimerize olması için 48 saat boyunca 60 santigrat derecede bir fırına koyun. Daha sonra alt camı ve polimer bloğu ayırmak için sıvı nitrojene batırın.
Numune bloğunu ultra mikrotomun numune tutucusuna yerleştirin ve düzeltme bloğuna yerleştirin. Reçineyi ilgilenilen nesnenin etrafında dikdörtgen veya trapez şeklinde kesmek için bir tıraş bıçağı kullanın. Kesilmiş numune bloğunu numune tutucuya yerleştirin ve elmas bıçağı ayarlayın.
Bir ultra mikrotom kullanarak, düz gömülü hücrelerden yaklaşık 60 ila 70 nanometre ultra ince kesitler kesin. Seri bölümleri, sıcak bir plaka üzerinde kurutmadan önce formvar kaplı bir yuva ızgarasında toplayın. Daha sonra, bölümleri iki dakika kontrast boyası ile boyayın ve bir dakika boyunca kurşun sitrat ile boyayın.
Ardından ızgarayı gözlem için transmisyon elektron mikroskobuna veya TEM, numune tutucuya yerleştirin. Işık mikroskobundan alınan diferansiyel girişim kontrast görüntüsüne dayanarak, ilgilenilen hedef hücreyi belirleyin ve 1.700 kat büyütmede döşenmiş üst üste binen görüntüleri kullanarak tüm hücre alanını görüntüleyin ImageJ Fiji kullanarak HeLa hücrelerinin bağıntılı ışık ve elektron mikroskobu görüntülerini elde etmek için, ImageJ Fiji'yi başlatın ve dosyaya, yeni, TrakEM2 boş, ve yeni bir TrakEM2 projesi oluşturmak için depolama klasörünü seçin. Kutucuk görüntüsü veri kümesini açmak için ham döşeme görüntüsü verilerini çalışma alanına sürükleyip bırakın.
Farenin sağ tuşuna tıklayın ve çizgiyi seçin, bu katmandaki tüm görüntüleri ve elastik doğrusal olmayan blok yazışmalarını monte edin. Ardından, kalan parametreler için varsayılan değerleri kabul etmek üzere Tamam'ı tıklatın. Ardından, farenin sağ tuşuna tıklayın ve dışa aktar'ı seçin, ardından dikişli bir görüntü oluşturmak için düz görüntü oluştur'u seçin.
Ardından dosyayı tıklayın ve görüntüyü kaydetmek için farklı kaydet. Floresan görüntüyü yeniden boyutlandırmak için fotoğraf büyütme yazılımını açın. Dosyaya tıklayın, açın ve resmi seçin.
Genişlik ve yüksekliği girin. Elektron mikroskobu görüntüsünün boyutuna uyması için. Yeniden boyutlandırma yönteminde uygulanacak algoritmayı seçin.
Yeniden boyutlandırılan görüntüyü kaydetmek için dosyaya tıklayın ve farklı kaydedin. ImageJ Fiji'yi açın ve yeniden boyutlandırılan floresanı ve dikişli elektron mikrografını çalışma alanına sürükleyip bırakın. Kaydı başlatmak için eklentiler büyük veri görüntüleyici ve büyük çarpıtma'ya tıklayın.
Ardından, hareketli görüntü olarak floresan mikrograf görüntüsünü ve hedef görüntü olarak elektron mikrograf görüntüsünü seçmek için açılır menüye tıklayın. Yakınlaştırma, görüntü döndürme ve taşıma gibi işlevleri kullanarak floresan ve elektron mikrograf görüntülerini karşılaştırın. Yer işareti moduna geçmek için klavyedeki boşluk çubuğuna basın ve her iki görüntüde de tanımlanan en az üç yer işaretini işaretlemek için farenin sol düğmesine basın.
Tanımlanan tüm yer işaretlerini işaretledikten sonra, dosyaya gidin, hareketli görüntüyü dışa aktarın ve Tamam'ı tıklayın. Dönüştürülmüş floresan mikrograf görüntüsünü içeren yeni bir açılır pencere görünecektir. Dönüştürülen floresan mikrograf görüntüsünü kaydetmek için dosyaya tıklayın ve farklı kaydedin.
CLEM görüntülerini üst üste bindirmek için, dönüştürülmüş floresan mikrograf görüntüsünü ve dikişli elektron mikrografı görüntüsünü ImageJ çalışma alanına sürükleyip bırakın. Görüntüye, türe ve sekiz bitlik renge tıklayın. Hem floresan hem de elektron mikrograf görüntüleri için aynı görüntü türünü ayarlamak için.
Görüntüye, renge tıklayın ve kanalları birleştirin. Görüntüleri birleştirmek için. CLEM görüntüsünü kaydetmek için dosyaya tıklayın ve farklı kaydedin.
Bafilomisin A1 ile tedavi edilen hücrelerde lizozomlar içinde hapsolmuş mitokondri, otofajiyi inhibe ettiğini ve mitokondriyal kalite düşüşünü gösterirken, kontrol hücreleri mitokondrinin lizozomlarla etkileşime girdiğini ancak lizozomlar tarafından yutulmadığını gösterirken, kontrol hücrelerinde gözlenen mitokondriyal bozulma, mitokondrinin lizozomlar tarafından yutulmak yerine onları çevrelediğini gösterdi. U18666A ile tedavi edilen hücreler, mitokondri ve lizozomlar arasında artan etkileşimler gösterdi ve bazı lizozomlar mitokondri tarafından yutuldu.
