Bu protokolde, tam kandan yüksek canlılığa sahip periferik kan ve mononükleer hücrelerin veya PBMC'lerin nasıl toplanacağı ve saklanacağı hakkında takip etmesi kolay, adım adım bir eğitim sağlamayı amaçlıyoruz. PBMC'ler lenfositleri, dendritik hücreleri ve monositleri içerir. Toplu PBMC'ler, tek tek hücre tiplerini izole etmek için işlenebilir ve RNA dizilimi ve akış sitometrisi dahil olmak üzere çok çeşitli deney ve tahlillerde yaygın olarak kullanılır.
PBMC'lere ek olarak, EDTA plazmasının ve bütün buffy kaplamanın nasıl toplanacağını da gösteriyoruz. Bu protokole başlamadan önce lütfen Tablo 2'de listelenen malzemeleri ve reaktifleri hazırlayın. Bu protokolün, her biri yaklaşık 12 milyon hücre veren altı yoğunluk gradyanlı santrifüj tüpünden PBMC'lerin toplanması için tasarlandığını unutmayın.
Buna göre ölçeklendirin. Standart flebotomi tekniğini kullanarak, tam kanı altı yoğunluk gradyanlı santrifüj tüpünde ve dolana kadar bir EDTA tüpünde toplayın. Tüm tüpleri oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 1800 g'da santrifüjleyin.
Gerekirse, toplanan tüpler dört saate kadar saklanabilir ve daha sonra aynı anda işlenebilir. Bir santrifüjün nasıl çalıştırılacağına dair bir gösteri için ek video 1'e bakın. Yoğunluk gradyan ortamını içeren tüpün santrifüjlenmesinden sonra, plazma ve PBMC'ler yoğunluk gradyan ortamının üzerinde olacaktır.
Eritrositler ve granülositler dibe çökecektir. Görselleştirme için Şekil 1A'ya bakın. Santrifüjlemeden sonra, yoğunluk gradyanlı santrifüj tüpünü dikkatlice açın.
Plazma içeren yarı saydam sarı tabakayı çıkarmak ve atmak için bir transfer pipeti kullanın. Puslu hücre tabakasını doğrudan yoğunluk gradyan ortamının üzerinde rahatsız etmeyin. PBMC'leri atmak yerine fazla plazma bırakma tarafında hata yapın.
Tüm tüpler için tekrarlayın. Yeni bir transfer pipeti ile, her tüpte kalan hacmi içeren hücreleri ve artık plazmayı, yoğunluk gradyan ortamının üzerinde birkaç kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin. Yeniden süspansiyondan sonra, tüpün yeniden askıya alınmış içeriğini etiketli 50 mL'lik konik bir tüpe pipetleyin.
Tüm tüpler için tekrarlayın. 50 mL'lik tüpü 50 mL'lik çizgiye kadar dökerek çözelti 1 ile doldurun. 50 mL'lik tüpü 300 g'da oda sıcaklığında 10 dakika santrifüjleyin.
Bölüm 2'de detaylandırılan plazma ve buffy toplama protokolü bu süre zarfında tamamlanabilir. Santrifüjlemeyi takiben, pelet PBMC'ler içerir ve süpernatant trombositler ve kalıntı plazma içerir. Mümkün olduğu kadar çok süpernatanı atın.
Kalan damlaları çıkarmak için gerektiği kadar dokunun. PBMC peletini içeren 50 mL'lik konik tüpe 15 mL'lik bir çözelti 2 tüpü dökün. Peleti yeniden süspanse etmek için tüpü yavaşça ters çevirin.
Bir transfer pipeti kullanarak 15 mL çözelti 3'ü aspire edin. 50 mL'lik tüpe damla damla ekleyin. Çözelti 3, oda sıcaklığında hücreler için toksik olan DMSO içerir.
Hemen işlenmeye hazır olana kadar çözelti 3 eklemeyin. Karıştırmak için tüpü üç kez hafifçe ters çevirin. Önceden etiketlenmiş ve önceden soğutulmuş her kriyo şişesini, çok dağıtımlı bir pipet kullanarak 1 mL PBMC ile doldurun.
Çok dağıtımlı bir pipetin nasıl çalıştırılacağına ilişkin bir gösteri için ek video 2'ye bakın. Kriyo şişelerini önceden soğutulmuş bir dondurma kabına yerleştirin. Ardından, kabı eksi 80 derece dondurucuya taşıyın.
Kriyo şişelerini dondurma kabının içinde en az 12 saat saklayın. Ardından, eksi 80 santigrat derecede etiketli bir saklama kutusuna aktarın. Alternatif olarak, donmuş kriyo şişelerini uzun süreli saklama için sıvı nitrojene aktarın.
Santrifüjlemeden sonra, üst tabaka plazmadan oluşur, alt tabaka eritrositler içerir ve arayüz buffy kaplamalar olacaktır. Görselleştirme için Şekil 1B'ye bakın. Yeni bir transfer pipeti kullanarak, buffy coat tabakasını bozmadan mümkün olduğunca çok plazma hazırlayın.
Ardından, 0.5 mL alikotları önceden etiketlenmiş kriyo şişelerine dağıtın. Buffy coat tabakasını aspire edin ve uygun şekilde etiketlenmiş kriyo şişesine aktarın. Bazı plazma ve eritrositlerin buffy coat koleksiyonunu kontamine edebileceğini unutmayın.
Toplandıktan sonra, kriyo şişelerini eksi 80 santigrat derece dondurucuda saklayın. Alternatif olarak, uzun süreli depolama için sıvı nitrojen içinde saklayın. PBMC çözdürme protokolüne başlamadan önce lütfen Tablo 3'te listelenen malzemeleri ve reaktifleri hazırlayın.
Bu protokol, yaklaşık 2 milyon hücre içeren 1.5 mL'lik bir tüpün çözülmesi için tasarlanmıştır. Buna göre ölçeklendirin. Mutlak hücre sayısının farklı hastalar ve farklı tedavi koşulları arasında önemli ölçüde farklılık gösterebileceğini unutmayın.
Dondurulmuş PBMC'leri kuru buz kullanarak depodan aktarın ve 37 derecelik bir inkübatörde yaklaşık 4 dakika çözdürün. İstenirse, yazılı protokolün 4. bölümünde detaylandırıldığı gibi hücre sayımı ve canlılık ölçümleri için bir alikot alınabilir. Çözüldükten sonra, her kriyo şişesine 1 mL çözelti 4 ekleyin.
Ardından, içeriği, çözülen her PBMC tüpü için 10 mL çözelti 4 içeren önceden etiketlenmiş 50 mL'lik bir tüpe dökün. Kalan damlaları çıkarmak için dokunun. Hücre süzgecini boş 50 mL'lik tüpe yerleştirin ve ardından hücre süspansiyonunu hücre süzgecinden dökün.
Gerekirse, yüzey gerilimini kırmak için hafifçe vurun. Süzülmüş hücreleri içeren her tüpü 400 g'da oda sıcaklığında 7 dakika santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, DMSO içeren süpernatanı dökün.
Kalan damlaları çıkarmak için gerektiği kadar dokunun. Hücre peletini, hücre kültürü ortamı veya akış sitometrisi antikor kokteylleri gibi aşağı akış deneysel ihtiyaçları için uygun olan istenen ortamda yeniden süspanse edin. Denemenize devam edin.
PBMC toplama ve kriyoprezervasyonun ardından, 56 benzersiz numuneden çözülmüş PBMC'lerin, monositlerin ve lenfositlerin canlılığı, Şekil 2A'dan FA'ya kadar üreticinin talimatlarına göre Tablo 4'te listelenen reaktifler kullanılarak akış sitometrisi ile değerlendirildi. PBMC'lerin, monositlerin ve lenfositlerin sırasıyla 94 artı veya eksi %4 artı veya eksi %1.1 ve 93 artı veya eksi %5.6 ortalama ve standart sapma canlılığı, elde edildi, Şekil 2G'de gösterilmiştir. Tripan mavisi dışlaması ile canlılık ölçümleri, ortalama 88 artı veya eksi% 7.5'lik bir canlılık ve 2.3 katı, 10 üzeri 6 artı veya eksi 1.9 katı, 10 üzeri 6'lık bir hücre sayısı verdi. Akış sitometrisi analizi ayrıca canlı monositlerin toplam PBMC'lerin 17 artı veya eksi %5.9'unu ve lenfositlerin 53 artı veya eksi %13'ünü oluşturduğunu gösterdi.
Daha sonra, monositler, akış sitometrisi ile 59 benzersiz örnekten çözülmüş PBMC'lerden sıralandı ve başka bir yerde açıklandığı gibi kütüphane hazırlığı ve RNA dizilimi için gönderildi. Şekil 3A ve B.A'da gösterildiği gibi, 93 artı veya eksi %6,3 okuma hizalaması ve 49,6 artı veya eksi 1,4 GC içeriği ile 18 artı veya eksi 16,3 milyonluk bir ortalama ve standart sapma toplam dizi sayısı elde edildi. Bu parametreler, yüksek kaliteli RNA dizilimi de dahil olmak üzere alt uygulamalar için uygun, yüksek derecede uygulanabilir PBMC'lerin, bu protokolü kullanan herhangi bir laboratuvar eğitimi seviyesine sahip operatörler tarafından elde edilebileceğini göstermektedir.
Bu protokolü gerçekleştirirken, özellikle oda sıcaklığında hücreler için toksik olan çözelti 3'ün eklenmesinden sonra, hücre ölümünü önlemek için hızlı bir şekilde çalışmak çok önemlidir. Ek olarak, hasarı en aza indirmek için hücreler de nazikçe ele alınmalıdır. Bu protokol, PBMC'lerin, EDTA plazmasının ve buffy coat izolasyonu için verimli, takip etmesi kolay bir yöntem sağlar.
Bu bağışıklık hücreleri, farklı biyolojik bağlamlarda bağışıklık sisteminin rolüne odaklanan çok çeşitli deneyler ve tahliller için kullanılabilir.
