Bu araştırmanın amacı, hem normal pankreas biyolojisinde hem de hastalık gelişiminde pankreas vaskülatürünün rolüne ilişkin anlayışımızı derinleştirmektir. Endotel fraksiyonunu başarılı bir şekilde zenginleştirerek, hastalık ortamlarında pankreas fonksiyonlarını eski haline getirmek ve geliştirmek için potansiyel olarak hedeflenebilecek pankreas fonksiyonlarını yöneten vaskülatür içindeki spesifik yolları tanımlamaya çalışıyoruz. Son zamanlarda, pankreas patolojilerinde endotel hücre disfonksiyonunun rolüne artan bir vurgu yapılmaktadır.
Pankreastaki endotel hücre popülasyonlarının heterojenliğinin tanımlanması, endotelyal pankreas etkileşimlerinin hastalıklara karşı nasıl çaba gösterdiğinin veya koruduğunun anlaşılmasına izin vermiştir. Pankreası hücresel düzeyde incelemek için tek hücreli veya tek çekirdekli RNA dizilimi, proteomik ve genomik gibi omik yaklaşımlar kullanılmaktadır. Doku veya mekansal düzeyde içgörü elde etmek için Visium ve Xenium gibi tarafsız ve prob tabanlı yaklaşımları kullanan yeni platformlar uygulanmaktadır.
Bu protokolde, endojen pankreas enzimlerinin hücre canlılığını azaltmasını en aza indiren nazik bir ayrışma tekniği ve endotel hücrelerini seçici olarak zenginleştirmek için manyetik hücre sıralama prosedürünü tarif ediyoruz. Protokolümüzün ayrışma ve zenginleştirme stratejisi, hem hücre yüzey belirteçlerinin hem de teknik sınırlamalar nedeniyle daha önce araştırılan pankreas endotel hücrelerinin transkriptomunun daha iyi anlaşılmasını sağlayacaktır. Başlamak için, ötenazi yapılmış fareyi ameliyat masasına yerleştirin.
Fare uzuvlarını gerin ve pimlerle sabitleyin. Cerrahi makas kullanarak, alt karın bölgesinden cilt ve karın zarı boyunca küçük bir orta hat kesisi yapın ve torasik bölgeye doğru uzanın. Diyaframı kesin ve kalbi ortaya çıkarmak için göğüs kafesini kaldırın.
Kalbin sol ventrikülüne buz gibi steril PBS içeren bir şırıngaya bağlı 25 ila 30 gauge bir iğne yerleştirin. Kalbi dakikada beş ila 10 mililitre oranında perfüze edin ve 10 mililitre enjekte ettikten sonra durun. Daha sonra, diseksiyon makası ve forseps kullanarak pankreası dikkatlice çıkarın.
Pankreayı, tripsin inhibitörü ile birlikte 10 mililitre buz gibi soğuk PBS içeren 50 mililitrelik bir tüpe aktarın ve tüpü buzun üzerine yerleştirin. Başlamak için, murin pankreasını buz gibi soğuk PBS içeren bir Petri kabında alın. Cerrahi makas ve cımbız kullanarak fazla dokuyu dikkatlice çıkarın.
Kesilmiş pankreası, bir mililitre ayrışma çözeltisi içeren beş mililitrelik bir tüpe aktarın. Diseksiyon makası ile pankreas dokularını ince parçalar halinde doğrayın ve tüpü buz üzerinde tutun. Lizatı buz üzerine yerleştirilmiş 50 mililitrelik bir tüpe aktarın.
Kalan pankreas dokusunu çıkarmak için beş mililitrelik tüpe iki mililitre kollajenaz çözeltisi ekleyin ve 50 mililitrelik tüpe aktarın. Tüpü 37 santigrat derecede temperlenmiş bir su banyosunda 20 dakika inkübe edin. Doku homojenatlı tüpü buzun üzerine yerleştirin ve yerçekimi ile çökmesine izin verin.
Daha sonra süpernatanı 70 mikrometrelik bir filtreden geçirin ve beş mililitre ayrışma durdurma çözeltisi ekleyin. 27 gauge bir iğne kullanarak, kalan peleti ek bir mililitre ayrışma çözeltisi ile ezin ve daha önce olduğu gibi filtreden geçirin. Hücre süspansiyonunu 300 G'de dört santigrat derecede 10 dakika döndürün ve peleti bir mililitre yıkama tamponunda yeniden süspanse edin.
Bir döndürücü üzerinde bir mikrolitre anti-CD31 biyotin antikoru ile yedi hücrenin gücüne bir kez 10 kez inkübe edin. 20 mikrolitre anti-biyotin MicroBeads ekleyin ve 40 dakika daha inkübe edin. Ardından sütun ayırıcı tutucu ile manyetik bir stand kurun ve sütunu uygulayın.
Sütunu dengeledikten sonra, numuneyi üzerine ekleyin ve toplam dokuz mililitre yıkama tamponu ile yıkayın. Sütunu tutucudan çıkarın ve 15 mililitrelik bir tüpe yerleştirin. Sütuna beş mililitre yıkama tamponu ekleyin.
Bir piston kullanarak, endotel hücrelerini içeren elüsyonu toplamak için kolondaki hücreleri aşağı doğru itin. Son olarak, akış ve elüsyon fraksiyonlarını aşağı doğru döndürün. Yeniden askıya alındıktan sonra, hücreleri sayın ve canlılığı ölçün.
Endotel hücrelerinin zenginleştirilmesini doğrulamak için yapılan kantitatif PCR analizi, zenginleştirilmiş fraksiyonların, akış örneklerine kıyasla önemli ölçüde daha yüksek işaretleyici genler, Pecam1 ve Kdr seviyelerine sahip olduğunu gösterdi. Zenginleştirilmiş fraksiyonlarda pankreas endokrin hücrelerinde bir transkripsiyon faktörü olan NK6 homeobox 1'in daha düşük bir seviyesi gözlendi. Western blotlama, beklenen boyutta güçlü CD31 sinyalleri gösterdi ve fraksiyonlardaki endotel hücre zenginleşmesini daha da doğruladı.
