1988'de Richard Lenski bir evrim deneyine başladı. 12 Erlenmeyer şişesini DM25 olarak bilinen glikoz sınırlı tanımlanmış bir büyüme ortamı ile doldurdu. Bu şişelerden altısını, şeker arabinozunu bir besin maddesi olarak kullanamayan REL606 olarak bilinen bir E.coli suşu ile aşıladı.
Bu popülasyonlar A-1'den A-6'ya kadar olarak adlandırıldı. Diğer altısını, arabinozu kullanabilen REL607 olarak bilinen neredeyse aynı suşla aşıladı. Bu atasal suşlar, onlardan evrimleşen E.coli, tetrazolium veya arabinoz agar üzerine kaplandığında ayırt edilebilir.
Ara-suşları kırmızı koloniler oluşturur ve Ara+suşları beyaz koloniler oluşturur. Lenski, bu şişeleri 37 santigrat derecede çalkalayan bir inkübatöre yerleştirdi ve doygunluğa ulaşmalarını ve ortamdaki glikozu tüketmelerini sağladı. Bu noktada, her bir şişeden kültürün% 1'ini taze ortam içeren yeni bir 12 şişe setine aktardı.
Bu günlük transfer ve yeniden büyüme döngüleri onlarca yıldır devam etmekte ve araştırmacılar tarafından incelenebilecek uzun bir evrim tarihi yaratmaktadır. Protokolümüzde, uzun vadeli evrim deneyinin veya LTEE'nin popülasyonlarının her gün nasıl aktarıldığını ve kültürlendiğini açıklıyoruz. Daha sonra, popülasyonların olası kontaminasyon belirtileri için düzenli olarak nasıl kontrol edildiğini ve daha sonraki çalışmalar için kalıcı bir dondurulmuş kayıt sağlamak üzere arşivlendiğini açıklıyoruz.
Buna sık sık, LTEE'nin fosil kayıtları olarak atıfta bulunuyoruz. LTEE'de evrimsel değişikliklerin genel temposunun ve karakterinin izlenmesinin önemli bir yolu, deneyden popülasyonların ve suşların göreceli uygunluklarını ölçmektir. Bu eş-kültür yarışma analizlerinin nasıl yapılacağını ve göreceli uygunluk değerlerini hesaplamak için elde edilen verilerin nasıl analiz edileceğini açıklıyoruz.
Bu videoda bu prosedürlerin ilkini ve sonuncusunu göstereceğiz. İlk olarak, uzun vadeli evrim deneyinin günlük aktarımını göstereceğiz. LTEE transferlerinin yapılacağı yüzeyi% 70 etanol veya% 10'luk bir ağartıcı çözeltisi ile silerek dezenfekte edin.
Yerel bir yukarı akım oluşturmak ve cam eşyaların yanmasını sağlamak için bir Bunsen brülörünü aydınlatın. Otoklavlama ile yıkanmış ve sterilize edilmiş 20 mililitre Pyrex veya polipropilen beherlerle kaplı 13 adet 50 mililitrelik Pyrex Erlenmeyer şişesi hazırlayın. Şişelerde görünür döküntüler olup olmadığını kontrol edin ve tamamen temiz olmayanları değiştirin.
Kırmızı bir işaretleyici kullanarak A-1 ile A-6 arasındaki altı şişeyi ve siyah bir işaretleyici kullanarak A + 1 ile A + 6 arasındaki diğer altı şişeyi etiketleyin. Kalan son şişeyi, boş olacak şekilde, tarihle, ay-gün biçiminde ve haftanın günüyle etiketleyin. 13 şişenin her birini steril 10 mililitrelik serolojik pipet kullanarak 9,9 mililitre DM25 ortamıyla doldurun.
Kapak görevi gören beheri çıkardıktan sonra ve beheri değiştirmeden önce her şişenin ağzını ateşleyin. Her şişeyi doldurmak arasında pipetin ucunu ateşe verin. Önceki günün LTEE şişelerini çalkalayan inkübatörden çıkarın.
Bulanıklığını ve rengini değerlendirmek için her birini sırayla ışığa tutarak inceleyin. Şişe bütünlüğünü kontrol edin ve yabancı maddenin varlığını arayın. Steril filtre ucuna sahip bir P200 mikropipetleyici kullanarak, her LTEE şişesinden 100 mikrolitre kültürü taze DM25 içeren ilgili şişeye aktarın.
A-1 ile başlayın, ardından A + 1'i aktarın. Bundan sonra, eksi ve artı popülasyonlar arasında dönüşümlü olarak devam edin. Hangi kültürlerin aktarıldığını takip etmek için, şişeleri pipetleme olarak sola veya onlara kaydırın.
Transferler sırasında sıkı aseptik tekniğe uyun. Her transfer için yeni bir pipet ucu kullanın. Şişelerin ağızlarını açtıktan hemen sonra ve tekrar açmadan önce ateşleyin ve mikropipettörün namlusunu ve enjektörünü her transfer arasında% 70 etanol ile nemlendirilmiş bir Kimwipe ile silin.
Yeni aşılanmış şişeleri 24 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin ve dakikada 120 devir yörüngesel bir inç çap üzerinde sallanın. Önceki günkü kültürleri dört santigrat derecede saklayın. Bu kültürleri iki gün boyunca saklayın.
Şu anda üç gün önce dört santigrat derecede kurtarılan eski kültürleri atın. Saati, tarihi, transfer numarasını, adınızı veya baş harfinizi, kültürlerin uygun olup olmadığını ve diğer ilgili bilgileri aktarım günlüğü defterine girin. E.coli ile yapılan uzun vadeli evrim deneyinin tarihinde 6 2/3 nesil daha geçti.
Önceki günün LTEE kültürleriyle ilgili herhangi bir sorun, kaza veya kontaminasyon şüphesi varsa, onlardan transfer yapmayın. Bunun yerine, daha sonra inceleme ve daha fazla karakterizasyon için 12 kültür setinin tamamını dört santigrat derecede saklayın. Bir gün önce aktarılan ve dört santigrat derecede saklanan yedek şişeleri alın.
Oda sıcaklığına ısınmak için tezgahın üzerine yerleştirin. Hücreleri yeniden askıya almak için her şişeyi yavaşça döndürün. Her şişeden yeni bir şişe setinde taze ortama aktarın ve deneye normal şekilde devam edin.
Aktarım günlüğüne yedekleme kültürlerini kullandığınızı not edin ve bir gün öncekiyle aynı aktarım numarasını kaydedin. Dört santigrat derecede depolanan yedek şişelerde kontaminasyon tespit edilirse, etkilenen LTEE popülasyonları donmuş stoklardan yeniden başlatılmalıdır. Daha sonra, uzun vadeli evrim deneyinden iki suşun veya popülasyonun göreceli uygunluğunu ölçmek için kullanılabilecek bir ortak kültür yarışması testi göstereceğiz.
LTEE atalarının her ikisini, REL606 ve 607'yi ve iki evrimleşmiş popülasyonu, 20.000 nesilde A-5 popülasyonunu, REL8597'yi ve 20.000 nesilde A + 5 popülasyonunu, REL8604'ü geliştiren bir rekabet deneyi göstereceğiz. Bu analizler, bir Ara-ve Ara+rakibinin her çifti için altı kat replikasyon kullandı. Kaç rakip LTEE suşu ve/veya popülasyonu kullanacağınıza ve her bir rakip çifti için kaç tane yinelenen rekabet tahlili yapılacağına karar verin.
Gerekli malzemeleri aşağıdaki gibi hazırlayın. Canlanma günü için, eksi iki gün, 20 mililitrelik bir beherle kaplanmış bir steril 50 mililitrelik Erlenmeyer şişesini, rakip olarak kullanılacak E.coli suşu veya popülasyonu başına 9.9 mililitre DM1000 veya lizojeni suyu, LB ile doldurun. Aşılanmamış bir boşluk olarak hizmet etmek için bir şişeyi daha aynı ortamdan 9.9 mililitre ile doldurun.
Ön koşullandırma günü için, eksi bir gün, bir test tüpünü rakip başına hacim başına% 0.85 ağırlıkta% 0.85 steril salin, bir çift rakip arasında tekrarlanan tahlil başına 9.9 mililitre DM25 ile iki şişe ve boş bir alan için 9.9 mililitre DM25 ile bir şişe daha doldurun. Yarışmanın başladığı gün için, sıfır günü, bir şişeyi 9.9 mililitre DM25 ile doldurun, bir test tüpünü 9.9 mililitre steril salin ile doldurun ve yarışma tahlili tekrarı başına bir tetrazolyum veya arabinoz veya TA plakası hazırlayın. Boş olarak kullanmak için bir şişeyi daha 9.9 mililitre DM25 ile doldurun.
Üç günlük bir yarışma gerçekleştiriyorsanız, iki ek yarışma şişesi seti doldurun. Yarışmanın son günü için, iki test tüpünü 9.9 mililitre steril salin ile doldurun ve yarışma tekrarı başına bir TA plakası hazırlayın. Bir yarışma deneyinin eksi ikinci gününde, rakipleri dondurucu stoklarından ayrı olarak canlandırırsınız.
Rakip suşların donmuş stoklarını içeren kriyovyalleri 80 santigrat derece dondurucudan çıkarın. Şişeleri kullanırken güzel bir kovada soğutun. Her dondurulmuş stok çözüldükten sonra, E.coli hücrelerini yeniden askıya almak için iyice vorteks.
Bir klonu canlandırıyorsanız, taze ortam içeren şişeyi 12 mikrolitre dondurulmuş stokla aşılayın. Bir popülasyonu canlandırıyorsanız, dondurulmuş stokun 120 mikrolitresi ile aşılayın. Canlanma şişelerini bir gecede 37 santigrat derecede boşlukta inkübe edin, dakikada 120 devir yörüngesel bir inç çapında sallanın.
Bir yarışma deneyinin eksi bir gününde, DM25'te yarışmacıları ayrı ayrı ön koşullandırırsınız. Yeniden canlanan rakiplerin kültürlerini içeren şişeleri inkübatörden çıkarın. Her şişeden 100 mikrolitreyi, o rakip için tuzlu su test tüpüne aktarın.
Seyreltilmiş kültürden 100 mikrolitreyi taze DM25 içeren bir şişeye aktarmadan hemen önce her bir seyreltme tüpünü iyice vorteksleyin. Bu ön koşullandırma şişelerinden ikisini, her bir çoğaltma testi için, yarışmacıların her biri için bir tane olmak üzere aşılayın. Ön koşullandırma şişelerini boşlukta 24 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.
Bir yarışma deneyinin sıfır gününde, ilk sayımlar için yarışmacıları ve plakayı karıştırarak yarışmaya başlarsınız. Ön koşullandırma şişelerini inkübatörden çıkarın. Ara-rakibinin 50 mikrolitresini taze DM25 ile doldurulmuş ilk replika yarışma şişesine aktarın.
Hemen Ara + yarışmacının 50 mikrolitresini aynı yarışma şişesine aktarın. Şişeyi hafifçe döndürerek karıştırın. Test ettiğiniz tüm rakip çiftlerinin tüm kopyalarını birleştirmek için bu adımları tekrarlayın.
Her yeni aşılanmış yarışma şişesinden 100 mikrolitreyi, bu rekabet testi kopyası için etiketlenmiş salin test tüpüne aktarın. Yeni yarışma şişelerini yerleştirin ve çalkalayan inkübatöre boşaltın. Bu arada, aynı gün, her bir test tüpünü iyice vorteks edin ve bu 10.000 kat seyreltmenin 80 mikrolitresini TA plakaları üzerinde plakalayın.
Her plakanın alt tarafının kenarını, karıştırılan suş çifti, çoğaltma numarası ve her bir rakibin ilk temsilini belirlemek için kullanılacağını belirtmek için sıfır günü ile etiketleyin. TA plakalarını, hem Ara hem de Ara + rakiplerinin kolonileri görünür ve ayırt edilebilir olana kadar 37 santigrat derecede bir yerçekimi konveksiyon inkübatöründe baş aşağı inkübe edin. Genel olarak, bu 16 ila 24 saat içinde gerçekleşir, ancak bazı evrimleşmiş suşlar için daha uzun sürebilir.
Her plakadaki Ara-kırmızı ve Ara+beyaz kolonilerin sayılarını sayın ve sonuçları kaydedin. Üç günlük bir yarışma gerçekleştiriyorsanız, her yarışmanın 100 mikrolitresini büyümeden sonra yeni bir şişede 9.9 mililitre taze DM25 ortamına aktarın. Bu bir günlük şişeleri 24 saat boyunca inkübe edin.
Aynı şekilde başka bir transfer gerçekleştirin ve LTEE koşulları altında yarışmacıların üç tam ortak kültür büyüme döngüsünü tamamlamak için ikinci gün şişelerini 24 saat boyunca kuluçkaya yatırın. Yarışmanın son gününde, birinci günde veya üçüncü günde, denemenizin uzunluğuna bağlı olarak, son sayımlar için plaka alırsınız. Yarışma şişelerini inkübatörden çıkarın.
Her yarışma şişesinden 100 mikrolitreyi, bu çoğaltma için ilk tuzlu su test tüpüne aktarın. Her 100 katlı seyreltme tüpünü iyice karıştırmak için vorteks edin ve bu çoğaltma için 100 mikrolitreyi ikinci tuzlu su tüpüne aktarın. Elde edilen tüpler, DM25 kültürlerinin 10.000 kat seyreltisini içerir.
10.000 kat seyreltme içeren her bir test tüpünü iyice vorteksleyin ve 80 mikrolitresini bir TA plakasına yerleştirin. Her plakanın alt tarafının kenarını, karıştırılan çift suşla, çoğaltma sayısıyla ve bir günlük bir yarışma için birinci günle veya üç günlük bir yarışma için üçüncü günle, her bir yarışmacının nihai temsilini belirlemek için kullanılacağını belirtmek için etiketleyin. TA plakalarını 37 santigrat derecede inkübe edin ve büyümeden sonra Ara ve Ara + kolonilerini sayın.
Rekabetinizdeki suşların göreli uygunluğunu hesaplamak ve sonuçları çizmek için bu protokolle birlikte sağlanan Excel elektronik tablosunu veya Fitness RR paketini kullanın. Uzun vadeli evrim deneyinin günlük aktarımları sırasında, büyüme sonrası kültürlerin yoğunluğu çok düşüktür ve genellikle bir kültürü boşluğun hemen yanında tutarak değerlendirilmelidir. Bunun istisnası, ortamdaki sitratı ek bir besin kaynağı olarak kullanmak üzere evrimleşen ve diğer popülasyonların hücre yoğunluğunun yaklaşık on katına kadar büyüyen A-3 popülasyonudur.
LTEE kültürlerindeki optik yoğunluğun ölçümleri, beklenen büyümeyi izlemek için de kullanılabilir. Örneğin, rekabet tahlilleri için, daha uygun bir rakibin, daha az uygun bir rakibe göre, zaman içinde temsilini artırmasını bekliyoruz. İki ata suşu arasındaki rekabetin sadece bir kopyasının seyreltilmesinden yetiştirilen kolonilerle TA plakalarının incelenmesi, oranın üç günlük bir rekabet deneyi boyunca nispeten sabit kaldığını göstermektedir.
Buna karşılık, A + 5 popülasyonu hızla REL606 atasını geride bırakıyor. Ve A-5 popülasyonu hızla REL607 atasını geride bırakıyor. İki evrimleşmiş popülasyon neredeyse eşit olarak eşleşmiştir.
Kırmızı ve beyaz kolonilerin temsilleri, yarışmanın üç günü boyunca neredeyse aynı kalır. Bir günlük ortak kültürden sonra koloni sayımlarını kullanarak, evrimleşmiş popülasyonların uygunluklarının, LTEE sırasında E.coli'nin atasal suşlarına göre% 60 oranında arttığını bulduk. Yarışmaları birkaç gün boyunca aktarmaya devam ederek, yakından eşleşen yarışmacılar için göreceli uygunluk ölçümlerinin hassasiyetini artırabiliriz.
Ancak iki yarışmacı çok farklı kondisyonlara sahip olduğunda, göreceli uygunluğu hesaplamak için çok günlük bir yarışmadan sonra her iki koloninin de yeterli bir temsili yoktur. Burada gösterdiğimiz yöntemler, LTEE'nin eşsiz tarihsel kayıtlarını incelemek ve bu açık uçlu evrim deneyini sürdürmek için kritik öneme sahiptir. Ayrıca, yeni soruları ele alan, yeni ortamlar kullanan ve farklı mikroorganizmaları inceleyen yeni evrim deneylerini düşünen diğerleri için bir başlangıç noktası sağlayabilirler.
