Bu protokol önemlidir, çünkü Lyme hastalığı ajanı Borrelia burgdorferi'nin moleküler biyolojisini incelemek için başka bir önemli aracı tanımlar. Bu tekniğin temel avantajı, faj transdüksiyonunu kullanarak, elektroporasyonda olduğu gibi bir elektrik darbesinin uygulanmasına gerek kalmadan Borrelia burgdorferi'ye DNA sokmak için alternatif bir yöntem sağlamasıdır. Bu yöntem, Borrelia burgdorferi tarafından enzootik döngüsünde devam etmek ve sonuçta insanlarda Lyme hastalığına neden olmak için kullanılan moleküler mekanizmalar hakkında daha fazla bilgi sağlamak için kullanılabilir.
Başlamak için, transdüksiyon protokolü için sıkıca kapatılmış steril konik santrifüj tüplerinde uygun Borrelia burgdorferi klonunun 150 mikrolitresini 15 mililitre BSK'ya aşılayın. Daha sonra, ortamı Borrelia burgdorferi klonu içindeki heterolog DNA'nın seçimi ve bakımı için uygun antibiyotik konsantrasyonu veya bir antibiyotik kombinasyonu ile destekleyin ve numuneyi 33 santigrat derecede inkübe edin. Kültür büyüdükten sonra, uygun kültür hacmini 10 dakika boyunca 6.000 G'de santrifüj edin.
Süper natantı boşalttıktan sonra, peleti taze BSK'da dört mililitre halinde yeniden askıya alın ve numuneyi minimum kafa boşluğuyla tutmak için mevcut en küçük steril tüpe aktarın. Daha sonra, faj üretimini indüklemek, tüpü sıkıca kapatmak ve iyice karıştırmak için dört mililitrelik bir kültür hacmine dayanarak önerilen konsantrasyona uygun miktarda indükleyici madde ekleyin. Numuneyi iki ila dört saat boyunca 33 santigrat derecede inkübe edin.
Ardından, numuneyi 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Numuneyi 10 dakika boyunca 6.000 G'de santrifüj yapın. Süper natantı boşalttıktan sonra, hücre peletini 15 mililitre BSK'da yeniden askıya alın.
Hazırlanan kültürü, makalede açıklanan uygun antibiyotik konsantrasyonu ile tamamlarken, numuneyi 72 ila 96 saat boyunca 33 santigrat derecede inkübe edin. PEG çökeltmesi için çözeltiler hazırlamak için, makalede açıklandığı gibi 500 mililitre beş molar sodyum klorür, 500 mililitre% 40 PEG ve 100 mililitre süspansiyon ortamı hazırlayın. Sterilize etmek için, çözeltiyi otoklavın, kullanmadan önce soğutun ve oda sıcaklığını veya dört santigrat derece depolayın.
Donör Borrelia burgdorferi klonundan fajın PEG çökeltilmesi için, 72 ila 96 saatlik inkübasyondan sonra, numuneleri dört santigrat derecede 20 dakika boyunca 8.000 G'de santrifüj edin. Süpernatantı temiz, 50 mililitrelik konik bir tüpe boşaltın ve hücre peletini atın. Bir azı dişinin son konsantrasyonuna beş molar sodyum klorür ekleyin.
İyice karıştırdıktan sonra, bir saat boyunca oda sıcaklığında hafifçe sallayın. Numuneleri dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 8.000 G'de santrifüj yapın. Süpernatantı daha önce gösterildiği gibi temiz bir 50 mililitrelik konik tüpe boşalttıktan sonra,% 40 PEG-8000 çözeltisini% 10'luk son bir konsantrasyona ekleyin İyice karıştırın ve bir saatten fazla bir süre, bir geceye kadar buz üzerinde ayarlayın.
Daha önce gösterildiği gibi dört santigrat derecede 20 dakika boyunca 8.000 G'de numunelere santrifüj yapın. Süpernatantı atın ve faj parçacıklarını içeren herhangi bir pelet kaybetmeden mümkün olduğunca fazla sıvıyı çıkarın. Şişenin yan tarafını yıkamak ve potansiyel faj parçacıklarını toplamak için süspansiyon ortamını kullanarak peleti minimum hacimli bir süspansiyon ortamında yeniden askıya alın.
Geri kazanılan faj numunesini, resüsitasyon hacmine bağlı olarak eşit miktarda kloroform ile tedavi edin. Numuneyi iyice karıştırın ve 10 dakika boyunca 8.000 G'de santrifüj yapın. Ardından, kalın arayüz katmanlarından herhangi birini önleyerek sulu tabakayı temiz bir tüpe çıkarın.
Geri kazanılan hacmi belirledikten sonra, ilk kloroform işlemini takiben, numuneyi tekrar bu hacmin% 10'una eşit miktarda kloroform ile tedavi edin. Sulu tabakayı temiz bir tüpe aktarın ve arayüz veya organik katmanlardan herhangi birini önlemeye dikkat edin. Fajı hemen kullanın veya dört santigrat derecede saklayın.
Borrelia burgdorferi kültürlerini, daha önce gösterildiği gibi transdüksiyon tahlillerinde alıcı olarak kullanılmak üzere hazırladıktan sonra, kültür hacmini 10 dakika boyunca 6.000 G'de santrifüj edin. Süpernatantı boşaltın ve peleti 14.5 mililitre taze BSK'da yeniden askıya alın. Alıcı klonun kültürüne 500 mikrolitre PEG çökeltilmiş faj örneğinden daha az veya buna eşit ekleyin.
İyice karıştırdıktan sonra, 72 ila 96 saat boyunca 33 santigrat derecede inkübe edin. Transdüktanların seçimini, makalede açıklandığı gibi PEG çökeltilmiş faj ile karıştırdıktan sonra katı faz kaplama ile gerçekleştirin. Alıcı klonun arka planına bağlı olarak, kolonilerin 10 ila 21 günlük inkübasyondan sonra seçim plakalarındaki agaroz içinde görünüp görünmediğini kontrol edin.
Sterilize pamuk tıkaçlı 5.75 inç borosilikat pipet kullanarak her iki antibiyotik varlığında plakada yetişen en az 5 ila 10 koloni seçin ve bunları uygun antibiyotik ile 1.5 mililitre BSK'ya aşılayın. Genlerin PCR amplifikasyonu, kanamisin ve gentamisin direncini kodlayan klonların 10'unda gerçekleştirildi. Kanamisin direnç geni, donör c1673 ve potansiyel transdüktanlardan güçlendirilebilir, ancak alıcı c1706'dan değil.
Benzer şekilde, gentamisin direnç geni, alıcı c1706'dan ve potansiyel transdüktan, transdüksiyon olaylarını temsil eden donörden değil, güçlendirilebilir. Kanamisin direnç kasetinin 5BB1 tarafından donörden alıcıya dönüştürüldüğünü göstermek. Transdüktanların arka planı, gerinime özgü belirteçler kullanılarak belirlendi.
C1673 klonu ve CA-112A arka planı, belirli amplikonları dört, beş ve altıyı kodlarken, yüksek geçişli B31 arka planına sahip olan c1706 kodlamaz. Benzer şekilde, bir ve iki transdüktanlar dört, beş ve altı amplikonlarını eksikti, bu da klonların c1706 arka planına sahip olduğunu ve kanamisin direnç genini c1673'ten edindiğini gösterdi. Fajın PEG çökeltilmesi için, faj verimini en üst düzeye çıkarmak için tüm adımları dikkatlice uygulayın ve faj kullanımı ve depolanmasından önce mümkün olduğunca fazla PEG ve kültür ortamı kirleticisini gidermek için yeniden askıya alınmış fajı kloroform ile iyice işlemden geçirin.
Transdüksiyon testi başarıyla gerçekleştirildikten ve transdüktan doğrulandıktan sonra, bu klonlar genetiği değiştirilmiş Borrelia burgdorferi gerektiren soruları cevaplamak için kullanılabilir. Bu tekniğin geliştirilmesi, araştırmacıların DNA'nın elektroporasyon yoluyla tanıtılmasının şu anda zor olduğu Borrelia burgdorferi suşlarını genetik olarak manipüle etmelerine izin verecektir.
