噬菌体介导的莱姆病螺旋体伯氏疏螺旋体的遗传操作

该协议意义重大，因为它描述了剖析莱姆病病原体伯氏疏螺旋体分子生物学的另一个重要工具。该技术的主要优点是，通过使用噬菌体转导，它提供了一种在伯氏疏螺旋体中引入DNA的替代方法，而无需像电穿孔那样应用电脉冲。该方法可用于进一步了解伯氏疏螺旋体在其地方性动物病周期中持续存在并最终导致人类莱姆病的分子机制。

首先，将150微升适当的伯氏疏螺旋体克隆接种到15毫升BSK中，用于转导方案。然后，用适当浓度的抗生素或抗生素组合补充培养基，以选择和维持伯氏疏螺旋体克隆内的异源DNA，并将样品在33摄氏度下孵育。培养物长大后，将适当体积的培养物以6， 000 G离心10分钟。

倾析上清液后，将沉淀重悬于新鲜BSK的4毫升中，并将样品转移到最小的无菌管中，以最小的顶部空间容纳样品。然后，根据4毫升的培养体积，将适量的诱导剂加入至推荐浓度，以诱导噬菌体的产生，盖紧管子，充分混合。将样品在 33 摄氏度下孵育两到四个小时。

然后，将样品转移到15毫升离心管中。将样品以6， 000 G离心10分钟。倾析上清液后，将细胞沉淀重悬于15毫升BSK中。

用手稿中描述的适当抗生素浓度补充制备的培养物，同时将样品在 33 摄氏度下孵育 72 至 96 小时。要制备PEG沉淀溶液，请按照手稿中所述制备500毫升5摩尔氯化钠，500毫升40%PEG和100毫升悬浮培养基。要进行消毒，请将溶液高压灭菌，使用前冷却，并储存室温或四摄氏度。

对于来自供体伯氏疏螺旋体克隆的噬菌体的PEG沉淀，孵育72至96小时后，将样品在4摄氏度下以8， 000G离心20分钟。将上清液倒入干净的50毫升锥形管中并处理细胞沉淀。加入五摩尔氯化钠至终浓度为一摩尔。

混合均匀后，在室温下轻轻摇晃一小时。将样品在 8， 000 G 的温度下在 4 摄氏度下离心 10 分钟。如前所述，将上清液倒入干净的50毫升锥形管中后，向上清液中加入40%PEG-8000溶液至终浓度为10%充分混合，并在冰上放置超过一小时，直至过夜。

如前所述，在 4 摄氏度下以 8， 000 G 离心样品 20 分钟。弃去上清液并尽可能多地去除多余的液体，而不会损失任何含有噬菌体颗粒的沉淀。使用悬浮培养基将沉淀重悬于最小体积的悬浮培养基中，以冲洗瓶子的侧面并收集任何潜在的噬菌体颗粒。

根据重悬液体积，用等体积的氯仿处理回收的噬菌体样品。充分混合样品并以 8， 000 G 离心 10 分钟。然后，将水层去除到干净的管中，避免任何厚界面层。

确定回收的体积后，在第一次氯仿处理后，再次用等于该体积10%的氯仿量处理样品。将水层转移到干净的管中，同时小心避免任何界面或有机层。立即使用噬菌体或将其储存在四摄氏度。

如前所述，在制备伯氏疏螺旋体培养物以用作转导测定中的受体后，将培养物体积以6， 000 G离心10分钟。倒出上清液并将沉淀重悬于14.5毫升新鲜BSK中。 向受体克隆的培养物中加入少于或等于500微升PEG沉淀的噬菌体样品。

混合均匀后，在 33 摄氏度下孵育 72 至 96 小时。如手稿中所述，在与PEG沉淀的噬菌体混合后，通过固相电镀进行转导剂的选择。根据受体克隆的背景，在孵育 10 至 21 天后检查菌落是否出现在选择板上的琼脂糖内。

使用无菌棉塞 5.75 英寸硼硅酸盐移液管在两种抗生素存在下挑选至少 5 到 10 个在平板上生长的菌落，并用适当的抗生素将它们接种到 1.5 毫升 BSK 中。对编码卡那霉素和庆大霉素耐药性的10个克隆进行了基因的PCR扩增。卡那霉素抗性基因可以从供体c1673和潜在的转导剂扩增，但不能扩增受体c1706。

同样，庆大霉素抗性基因可以从受体c1706和潜在的转导剂中扩增，但不能从供体扩增，代表转导事件。为了证明卡那霉素耐药盒被5BB1从供体转移到受体中。使用菌株特异性标记物确定转导剂的背景。

c1673 克隆和 CA-112A 背景编码特定的扩增子 4、5 和 6，而具有高通道 B31 背景的 c1706 则不编码。类似地，转导剂一和二缺少扩增子四、五和六，证明克隆具有c1706背景，并从c1673获得了卡那霉素抗性基因。对于噬菌体的PEG沉淀，请仔细执行所有步骤以最大限度地提高噬菌体的产量，并在噬菌体使用和储存之前用氯仿彻底处理重悬的噬菌体，以去除尽可能多的PEG和培养基污染物。

一旦成功进行转导测定并验证转导剂，这些克隆就可以回答需要转基因伯氏疏螺旋体的问题。这项技术的发展有望使研究人员能够对伯氏疏螺旋体菌株进行遗传操作，目前很难通过电穿孔引入DNA。