Bu yüksek verimli tahlil, caenorhabditis dauer larvalarında sağlam gravitaktik davranışı gözlemlemek için kullanılabilir. Solucan davranışı, bir petri kabı üzerinde yapılan tahlillerle karşılaştırıldığında büyük mesafelerde gözlenir. Bu, tahlilin hassasiyetini arttırır ve ayrıntılı veri analizine izin verir.
Gravitaksis davranışını incelemek, memeli vestibüler sistemini anlamak için ilgisi olan caenorhabditis'te yerçekimi hissinin nasıl oluştuğuna dair fikir verebilir. Gravitaksis tahlil odalarının oluşturulması, dauerlerin izole edilmesi ve solucanların odalara enjekte edilmesi pratik gerektirir. Dauerleri izole ederek ve odaları bir gün önceden oluşturarak zamandan tasarruf edebilirsiniz.
Bir Bunsen brülörü, bir ila iki tıraş bıçağı, pense, cımbız ve plastik bir kesme yüzeyi ve bir duman başlığı kurarak başlayın. Bir oda yapmak için, iki adet 5 mililitrelik serolojik pipet toplayın ve cımbızla pamuk tapasını bir pipetten çıkarın. Pense kullanarak bir tıraş bıçağını sıcak olana kadar Bunsen brülörün üzerinde tutun.
Isıtılmış bıçağı kullanarak ikinci pipetin konik ucunu dilimleyin, böylece pipetin tamamı eşit bir çapa sahip olur. Şimdi, modifiye edilmiş iki pipet ucunu hızlı bir şekilde aleve yaklaştırın ve hafifçe eritin. Bu uçları sıkıca birbirine bastırarak birleştirin ve her iki pipetin duvarlarının sürekli olmasını sağlayın.
Birleştirmeden sonra herhangi bir boşluk görünüyorsa, bunları ayırın ve bu adımı tekrarlayın. Standart solucan prosedürlerine göre NGM'yi %4 agar ile hazırlayın ve agar hala erimişken serolojik bir pipetleyiciye takarak her odayı doldurun. Düzensiz soğutma nedeniyle agarın kıvamındaki değişiklikleri en aza indirmek için, agar'ı hazırlarken pipetleyiciyi tezgah üstüne paralel tutun.
Ardından çözeltiyi yavaşça çekin ve odayı pipetleyiciden çıkarmadan önce ucu parafilm ile kapatın. Odayı soğuması için düz bir şekilde yerleştirin ve hareket etmeden önce agarın sertleşmesine izin verin. Soğutulduktan sonra, üç milimetrelik bir altıgen anahtarı bir Bunsen brülörü üzerinde ısıtın ve orta hattın bir tarafına yaklaşık beş milimetre kadar her odanın duvarına sıkıca bastırarak küçük bir plastik açıklık oluşturun.
Daha sonra, odanın pamuğu ve konik uçlarını çıkarmak için ısıtılmış bir bıçak kullanın ve uçları parafin filmle kapatın. Deneyden 10 ila 15 gün önce, her bir suşu OP50 bakterileri ile iki ila üç büyük NGM plakasına koyun ve parafin filmini sarın. Kapakları ve plakaları M9 Tamponu ile durulayarak ve çözeltiyi 15 mililitrelik santrifüj tüplerine pipetleyerek solucanları toplayın.
Oda sıcaklığında 30 ila 60 saniye boyunca 1600 x G'de döndürerek solucanları toplayın ve M9 Tamponunun çoğunu bir pipet veya vakum aspiratörü ile aspire edin. Her solucan peletine yedi mililitre% 1 sodyum dodesil sülfat çözeltisi ekleyin ve solucanları 30 dakika boyunca içinde bırakın. Havalandırmaya izin vermek için, bu süre zarfında tüpleri sürekli döndürmeye devam edin.
Ardından, deterjanı M9 ile üç ila beş kez durulayarak çıkarın. Beş mililitre M9 ekledikten sonra, beş mililitre soğuk filtrelenmiş% 60 sakkaroz çözeltisi ekleyin. İyice karıştırın ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca 1600 x G'de santrifüj yaparak bir ayırma gradyanı oluşturun. Yeni 15 mililitrelik santrifüj tüplerini iki mililitre M9 Buffer ile doldurun.
Şimdi deliği genişletmek için cam Pasteur pipetlerin uçlarını ezin. Ve bu pipetleri, çözeltinin üst tabakasını sakkaroz gradyanından yeni tüplere aktarmak için kullanın. Dauerleri M9 Buffer ile üç ila beş kez durulayın.
Dauerleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 1600 x G'de santrifüj yapın ve M9 çözeltisinin çoğunu bir pipet veya vakum aspiratörü ile aspire edin. Daha sonra, diseksiyon mikroskobu altında üç ayrı 1 mikrolitrelik damlacıktaki solucan sayısını manuel olarak sayarak solucan yoğunluğunu tahmin edin ve mikrolitre başına solucan sayısını yaklaşık olarak belirlemek için bu sayımların ortalamasını kullanın. Şimdi 10, 20 veya 200 mikrolitrelik pipet uçlarının ucunu keserek uç deliğini genişletin.
Mikropipeti, amaçlanan aspirasyon hacminden biraz daha büyük bir hacme ayarlayın. Konsantre solucan çözeltisinin yaklaşık 1 ila 2 mikrolitresini aspire edin ve uca az miktarda havanın girmesine izin verin. Mikro pipeti bastırırken pipet ucunu yavaşça agarın içine itin.
Bu, ucu tıkamadan bir enjeksiyon bölgesi oluşturacaktır. Solucanları agarın içine bırakın ve açıklığı kapatmak için parafin filmi kullanın. Odalar oda sıcaklığında karanlık bir Faraday kafesine yerleştirildikten sonra mümkün olduğunca çok değişkeni ortadan kaldırmak için, her odayı etiketleyin ve Faraday kafesine dikey olarak asın.
Bazı odaları aynı çevre koşulları içinde düz bir şekilde yerleştirerek yatay kontrolleri eşzamanlı olarak test edin. Daha sonra dikey yönelimli N2 solucanlarını pozitif bir kontrol olarak ve N2 dauers içeren yatay yönelimli odaları deneysel suşlara karşı ek bir negatif kontrol olarak kullanın. Birkaç saat sonra, dauer solucanları başlangıç bölgesinden dağılmaya başlar ve odanın her iki ucuna da ulaşması birkaç saat sürer.
Bu süre zarfında odaları rahatsız etmeden bırakın ve enjeksiyondan sonraki 12 ila 24 saat içinde puan alın. Daha sonra, odaları birer birer çıkarın ve diseksiyon mikroskobu altında canlı dauers arayarak ve yerlerini mürekkeple işaretleyerek gravitaksileri puanlayın. Enjeksiyon bölgesinin her iki tarafına 2,5 santimetre içinde solucanlar atmayın, çünkü bu solucanların yön tercihi göstermesi muhtemel değildir.
Ayrıca, ölü görünen veya sıvıda sıkışıp kalmış solucanları puanlamaktan kaçının ve% 50'den fazla ölü veya yüzme solucanı içeren odaları atın. Sonuçları ölçmek için, odanın her yarısını enjeksiyon bölgesinden 2,5 santimetre uzakta başlayarak yedi 3,5 santimetreye bölmek için bir işaretleyici kullanın. Her bölümde gözlemlenen solucan sayısını hesaplamak için manuel bir uyarı sinyali sayacı kullanın.
Caenorhabditis briggsae'de, dauer solucanlarının büyük bir yüzdesi odaların tepesine doğru göç gösterdi. Bununla birlikte, yatay kontroller, odaların merkezi etrafında dağılım gösterdi ve negatif yerçekimsel davranışı gösterdi. Ayrıca, caenorhabditis briggsae ve caenorhabditis elegans'ın dikey dağılımları, caenorhabditis briggsae dauers'in caenorhabditis elegans dauers'e benzer negatif bir gravitaksis davranışı gösterdiğini düşündüren herhangi bir fark göstermemiştir.
Bu protokolde sodyum azid gibi paralitik ajanlar kullanılmaz. Bu nedenle, gravitaksis odalarını Faraday kafesinden çıkarılır çıkarılmaz puanlamak önemlidir. Bu tahlil, c.elegans'ta negatif gravitaksis davranışının keşfine yol açtı.
Birkaç mutant suşu test ederek, solucanlardaki gravitaksis için genetik ve sinirsel gereksinimleri de ortaya çıkardı.
