Bu protokolü kullanarak, çeşitli eğrilikler gösteren pateron substratları üzerinde sitoiskelet filamentli proteinlerin organizasyonunu görselleştirdik. Eğrilik hassasiyetini test edebiliriz. Taramalı elektron mikroskobu görüntülerinin çözünürlüğü, nanometre ölçeğindeki organizasyonların görselleştirilmesi için yeterince yüksektir.
Fiksasyon için kullandığımız yöntemler, proteinin yapısal organizasyonunu koruyacak kadar hafiftir. Bu, sitoiskelet filamentlerinin davranışını anlamak için temel araştırma kapsamında kalmaktadır. 250 nanometre genlikli dalgalı polidimetilsiloksan dalgalı desenlerden ve iki mikrometre yanal periyodiklikten temiz oda ortamında dalgalı bir Norland Optik Yapıştırıcı veya NOA kopyası tasarlayarak başlayın.
Bunu yapmak için, bir santimetre çapında dairesel bir cam kapak kayması üzerine beş mikrolitre sıvı NOA koyun ve ardından PDMS şablonunu damlanın üzerine yerleştirin. Sıvı NOA'yı ince bir polimer filme fotopolimerize etmek için düzeneği 320 nanometrede beş dakika boyunca UV ışığıyla tedavi edin. İşiniz bittiğinde, PDMS şablonunu taze polimerize NOA ile kapak kaymasından yavaşça çıkarın.
Yüzeyi hidrofilik hale getirmek için NOA filmini beş dakika boyunca bir hava plazma temizleyici kullanarak tedavi edin. El yazmasında açıklandığı gibi küçük unilamellar veziküllerden veya SUV'lardan oluşan bir çözelti hazırlayın ve çözelti şeffaf olana kadar beş ila 10 dakika boyunca bir banyo sonikatöründe sonikasyon altındaki gözlem tamponunda kurutulmuş bir lipit filmi yeniden askıya alarak SUV'ları elde edin. Daha sonra, NOA desenlerini destekleyen kapak fişlerini hücre kültürü kutularının kuyucuklarına yerleştirin ve desteklenen bir lipit çift katmanı oluşturmak için oda sıcaklığında 30 dakika boyunca mililitre SUV çözeltisi başına 100 mikrolitre bir miligram ile taze parıldayan boşaltılmış NOA desenlerini inkübe edin.
Kaynaşmamış SUV'yi çıkarmak için, numunenin iki yıkama arasında tamamen kurumasına izin vermeden septin düşük tuz tamponu ile kenarları altı kez iyice durulayın. Oktomerik septin stok çözeltisini, septin düşük tuz tamponunda, 10 ila 100 nanomolar ve bir mililitre hacimleri arasında değişen son konsantrasyonlara kadar seyreltin. Daha sonra, protein çözeltisini slaytlar üzerinde oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin.
Kaynaşmış destekli lipit çift katmanları içeren NOA slaytlarını yıkayın ve septin düşük tuz tamponu ile proteini inkübe edin. Septin düşük tuz tamponunu, 37 santigrat derecede önceden ısıtılmış 0.1 molar sodyum kakodilat tamponunda% 2 glutaraldehit fiksatif çözeltisi ile değiştirin ve reaksiyonun 15 dakika boyunca ilerlemesine izin verin ve sabit numuneyi her biri 0.1 molar sodyum kakodilat ile beş dakika olmak üzere üç kez yıkayın. Yıkadıktan sonra, numuneyi ozmiyum tetroksitin fiksatif çözeltisinde, daha sonra filtrelenmiş tanik asit ve son olarak filtrelenmiş uranil asetatın her biri 10 dakika boyunca inkübe edin.
Her çözeltiden sonra numuneyi üç kez damıtılmış suda yıkayın. Numuneyi, her biri iki ila üç dakika boyunca% 50 ila% 100 arasında değişen etanol çözeltilerinde seri olarak inkübe edin. Cam kızakları etanol ile önceden doldurulmuş kritik nokta kurutucunun içine aktarın ve üreticinin kurutma talimatlarına uyun.
Kurutulmuş numuneler oldukça hidroskobik olduğundan, kapak kaymasını saplamalara takarak hemen kaplayın. Ardından, boya deglomeraları oluşturmadan kapak kaymasının üst yüzüne bir gümüş boya şeridi ekleyin. Saplama ile bağlantının tatmin edici olduğundan emin olun.
Numune tamamen buharlaştığında, bir plazma magnetron püskürtme kafası ve döner bir gezegen aşaması ile donatılmış bir aparat kullanın ve üretici tarafından sağlanan standart protokolleri izleyin. Yüzeydeki oksit tabakasını çıkarmak için 60 saniye boyunca 120 miliamperde ön püskürtme işlemi gerçekleştirin. Daha sonra 90 miliamperde bir film kalınlığı monitörü ve 50 mililitrelik bir çalışma mesafesi ile 1.5 nanometre tungsten biriktirin.
Daha sonra, numuneleri SEM analizlerine kadar ve SEM analizleri boyunca ortam havasından korumak için bir vakum altında saklayın. İç dedektörle ikincil elektronları algılayarak yüksek çözelti görüntülemesi elde etmek için, hızlanan voltajı üç kilovolta ve ışın akımını 20 mikrometre açıklığa ayarlayın. Gözlemler için, piksel başına 21,25 nanometreden piksel başına 1,224 nanometreye kadar değişen çözünürlükler kullanın.
Veri analizi için piksel başına 5,58 nanometre çözünürlük kullanın. Yüksek çözünürlüklü gözlem için çalışma mesafesini bir ila iki milimetre arasında ve daha fazla alan derinliği gerekiyorsa yaklaşık üç milimetre arasında ayarlayın. Görüntü başına yaklaşık 30 ila 45 saniyelik bir yakalama süresiyle sabit bir sinyal-gürültü oranı sağlamak için tarama hızını ve hat entegrasyonunu sürekli olarak ayarlayın.
Temsili analiz, septin filamentleri üzerinde biriken malzemenin 1.5 nanometre platin ve 1.5 nanometre tungsten içeren dalgalı PDMS desenleri üzerindeki etkisini göstermektedir. Çıplak dev unilamellar veziküllerin veya GUV'ların mükemmel küresel olduğu gözlendi. Septin kaynaklı deformasyondan sonra, veziküller yönlü göründü ve deformasyonlar statik kaldı ve böylece dalgalanmadı.
Septinlerin daha yüksek konsantrasyonlarında, veziküllerde periyodik deformasyonlar gözlendi. Büyük unilamellar veziküllere veya LUV'lara bağlı septin filamentlerinin kendi kendine montajı, kriyo elektron mikroskobu görüntüsü ile incelendi ve eğik bir seriden 3D rekonstrüksiyon elde edildi. Septin filamentlerinin eğriliğe bağlı düzenlemesi taramalı elektron mikroskobu ile görselleştirildi.
Düşük büyütmede, negatif ve pozitif eğriliklerin periyodikliğine sahip dalgalı bir desen görülüyordu. Septin filamentlerinin ultra-yapısal organizasyonu daha yüksek büyütmede görüldü. NOA, bozulmayı önlemek için hafifçe soyulmalıdır.
Görüntülemeden sonra, filament aralığı ve filamentin oryantasyonu gibi SCM tarafından görselleştirilen ultra yapı özelliklerini ölçmek için bazı görüntü analizleri yapılabilir. Mevcut yöntem septinlere uygulanmıştır, ancak diğer sitoiskelet proteinleri veya uzun filamentler olarak organize olan ve böylece eğriliğe duyarlı olan proteinler için de kullanılabilir.
