Chlamydomonas reinhardtii'de Demembrane Hücre Modellerinin Reaktivasyonu

Bu yöntem, hangi faktörlerin kirpik hareketliliğini etkilediğini anlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, sadece geçici olarak in vivo olarak meydana gelen fenomenlerin, kirpiklerdeki kalsiyum iyon konsantrasyonlarının bu şekilde tersine çevrilmesinin in vitro olarak sürekli olarak gözlemlenebilmesidir. Bu yöntem özellikle hareketli kirpiklerin araştırma alanına katkıda bulunur.

Yeni başlayanlar için hatırlama adımını gerçekleştirmek zor olurdu. Bu nedenle, adımların nazikçe ama kesin bir şekilde yapılması şiddetle tavsiye edilir. Yaklaşık 10 mililitre Chlamydomonas reinhardtii kültürünü üç dakika boyunca 20 santigrat derecede 1.000 RCF'de santrifüj ederek başlayın.

Süpernatantı boşaltın ve kalıntıyı bir Pasteur pipetle aspire edin. Çökeltileri yaklaşık beş mililitre yıkama tamponunda yeniden askıya alın. Yıkama tamponundaki hücreleri 1.000 RCF'de 20 santigrat derecede üç dakika boyunca santrifüj yapın.

Süpernatantı bir pipetle dikkatlice atın. Hücre peletine yaklaşık 0,5 mililitre demembranasyon tamponu ekleyin. Tampondaki hücreleri kabaca askıya almak için tüpü hafifçe çalkalayın, ardından tüpü buzun üzerine koyun.

Kalan hücre peletini bir pipetle nazikçe askıya alın ve tüpü tekrar buzun üzerine yerleştirin. Hücre modelinin 5 ila 10 mikrolitresini alın, seyreltme tamponu ile on kat seyreltin ve tüm hücre modellerinin hatırlandığını ve yüzmediğini doğrulamak için mikroskop altında gözlemleyin. 0.5 mililitrelik bir tüpte, tüpe dokunarak 80 mikrolitre reaktivasyon çözeltisi, 10 mikrolitre ATP çözeltisi ve 10 mikrolitre hücre modelini karıştırın.

Karışık çözeltinin yaklaşık 30 mikrolitresini bir cam slayt üzerine koyun ve hücre modeline mekanik bir şoku önlemek için ara parçalarla üzerine yavaşça bir kapak kayması yerleştirin. Yeniden aktive edilmiş hücre modellerini mikroskop altında gözlemleyin. C.reinhardtii kültürünün hatırlanmasından sonra, tüm hücre modelleri hareketsiz hale geldi ve demembrane edilen kirpikler hücre gövdesine bağlı kaldı ve hücre modellerinin hareketsizliğinin siliasyondan kaynaklanmadığını doğruladı.

Hücre modellerini ATP'deki reaktivasyon tamponu ile karıştırdıktan sonra, hücre modellerinin% 50'sinden fazlası hareketli hale geldi. ATP rejenerasyon sistemi olmasa bile, yeniden aktive edilen hücreler, yavaş yavaş durmadan önce bir milimolar'lık son ATP konsantrasyonu ile yaklaşık 90 dakika boyunca hareket etmeye devam etti. Hatırlama adımı kritiktir.

Tüm hücreler yüzmeyi bırakmalı, ancak siliyasyonun meydana gelmesine neden olacak kadar güçlü bir şekilde karıştırılmamalıdır. Araştırmacılar bu protokolü kalsiyum iyonları veya siklik AMP gibi reaktifleri içerecek şekilde değiştirebilir veya biyolojik rollerini tanımlamak için belirli bir proteinden yoksun bir mutantla deneyler yapabilirler.