Bu protokol, bağırsakların ve tiroid bezlerinin viral yayılmayı engelleyip engellemediğini belirleyebilir ve Aedes aegypti tarafından bulaşan sivrisinek kaynaklı virüslerin risk değerlendirmelerine yardımcı olabilir. Protokolümüz, arbovirüsün vektör yeterliliğini etkili bir şekilde değerlendirebilen oral beslenme ve intratorasik enjeksiyon olmak üzere iki enfeksiyon yöntemini içeriyordu. Bu protokol, Aedes'te Dang virüsü ve Zika virüsü enfeksiyonu gibi çeşitli sivrisinek vektörlerinde ek arbovirüs enfeksiyonlarına uygulanabilir ve uygulanabilir bir prosedür olduğu kanıtlanabilir.
Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan bir araştırma görevlisi olan Fei Wang olacak. Yapay sivrisinek besleme sistemini kullanarak yapay besleme yapmak için, kollajen membranlarını uygun boyuta kesin ve O-halkalarla rezervuarlara sabitleyin. Rezervuarlara üç mililitre virüs-kan karışımı ekleyin ve sızıntıları önlemek için rezervuarları plastik tapalar kullanarak kapatın.
Sivrisinek içeren plastik bardakları torpido gözüne koyun. Sızdırmaz rezervuarları FU1 besleyiciye vidalayın ve bir kabın üzerine bir rezervuar koyun. Güç ünitesini açın ve sivrisinekleri bir saat boyunca besleyin.
Beslendikten sonra, sivrisinekleri bayılıncaya kadar birkaç saniye buzla uyuşturun. Anestezi altındaki sivrisinekleri buz üzerine yerleştirilmiş bir Petri kabına dökün ve kapağı hızlıca örtün. Forsepsli dişi sivrisinekleri toplayın ve fincan başına 50 dişi sivrisinek ile yeni plastik kaplara aktarın.
Bardağı kesilmiş bir cibinlik ağı ile sarın ve ortasında bir delik bulunan bir kapakla örtün. Süngeri küçük parçalara ayırın ve bardaklara koyun. Plastik tek kullanımlık bir damlalık kullanarak sünger üzerine% 8 glikoz çözeltisi ekleyin.
Dişi sivrisinek içeren bardakları inkübatöre 27 santigrat derecede, 10 gün boyunca% 80 nemde yerleştirin. Her 72 saatte bir yeni bir glikoza doymuş sünger değiştirin. İntratorasik aşılama için, metin makalesinde açıklandığı gibi dişi sivrisinekleri hazırlayın.
Enfeksiyöz virüs seyreltmesini hazırlamak için, virüs stokunu 80 santigrat derece dondurucudan çıkarın ve buz üzerinde çözün. Virüs stoğunu, 100 ila 500 plak oluşturan birim virüs içeren 100 nanolitrelik bir virüs seyreltmesinde,% 10 FBS ve% 1 penisilin-streptomisin içeren RPMI 1640 ortamı ile seyreltin. Virüs seyreltmesini buzun üzerine yerleştirin.
Daha sonra, mikroenjeksiyon iğnelerini, iğne çektirme programındaki parametreler ısı indeksi olarak 450, g cinsinden kuvvet olarak 110, milimetre cinsinden mesafe bire ve saniye cinsinden sıfıra kadar gecikme olarak ayarlanmış bir Çektirme 1000 kullanarak hazırlayın. Çekilen bir iğnenin ucunu 16x büyütmede diseksiyon mikroskobu altında cımbızla kesin. İğneyi tek kullanımlık steril bir şırıngadan mineral yağ ile doldurun.
Makinedeki talimatları izleyerek iğneyi enjektöre takın. İğneyi dikkatlice bulaşıcı bir virüs seyreltmesi içeren bir tüpe yerleştirin. Ardından, iğneye yaklaşık dört mikrolitre virüs seyreltmesini doldurmak için Doldur düğmesine basın.
İğne doldurulduktan sonra, iğneye dokunmayın veya zarar vermeyin. Cımbızla yaklaşık 50 dişi anestezi yapılmış sivrisinek seçin ve bir buz tabağına koyun. Plakayı enjektörün altına yerleştirin ve iğneyi diseksiyon mikroskobu altında sivrisineğin göğüs boşluğuna yerleştirin.
Enjeksiyon hacmini 100 nanolitreye ve hızı saniyede 50 nanolitreye ayarlayın. Virüs çözeltisinin sivrisinek içine akmasına izin vermek için Enjekte düğmesine basın. Başarılı enjeksiyon üzerine, karın hafifçe şişer.
Enfekte olmuş sivrisineği buzun üzerine yerleştirilmiş yeni bir plastik kaba koyun. Enfekte sivrisineklerin sayısı yeterli olduğunda, bardağı kesilmiş bir cibinlik ağı ile sarın ve kapakla örtün. Enfekte dişi sivrisineklerden tükürük toplamak için, anestezi altındaki sivrisinekleri buz üzerine yerleştirilmiş bir Petri kabına dökün ve kapağı hızla kapatın.
Daldırma yağı ile doldurulmuş 10 mikrolitrelik pipet uçlarını kauçuk çamurun üzerine yan yana yerleştirin. Dişi sivrisinekleri cımbızla seçin ve bir buz tabağına koyun. Bacaklarını ve kanatlarını cımbızla çıkarın.
Oda sıcaklığında sivrisinekler tarafından yağa salgılanan tükürüğü toplamak için her pipet ucuna bir sivrisinek ağız kısmını yerleştirin. 45 ila 60 dakika sonra, pipet uçlarını 200 mikrolitre virüs seyreltici ortam içeren 1,5 mililitrelik tüplere yerleştirin. Tükürüğü tüplere atmak için tüpleri dört santigrat derecede beş dakika boyunca 5.000 g'da santrifüj edin.
İletim hızlarının daha sonra belirlenmesi için tükürük içeren tüpleri 80 santigrat derecede saklayın. Tükürük toplandıktan sonra, enfekte olmuş dişi sivrisinekleri disseke edin. Cımbız kullanarak, sivrisineklerin kafalarını kesin ve her kafayı 200 mikrolitre RPMI 1640 ortamı içeren ayrı bir tüpe yerleştirin.
Toraksı bir cımbızla alın. Ardından, karnın sondan bir önceki bölümünü başka bir cımbızla tutun ve bağırsağı dışarı çekin. Herhangi bir başıboş doku ve organ için bağırsağı temizleyin.
Bağırsağı PBS ile yıkayın ve her bir bağırsağı 200 mikrolitre RPMI 1640 ortamı içeren ayrı bir tüpe yerleştirin. Virüsün yayılma ve enfeksiyon hızının daha sonra belirlenmesi için bu tüpleri 80 santigrat derecede saklayın. Bu temsili analizde, enfeksiyondan 10 gün sonra dişi sivrisineklerin bağırsak, baş ve tükürüklerindeki viral RNA'lar belirlenmiştir.
İntratorasik olarak aşılanmış sivrisineklerin bağırsaklarındaki, kafalarındaki ve tükürüklerindeki Ebinur Gölü virüsünün virüs titresi, oral enfekte sivrisineklerden daha yüksekti. İntratorasik olarak aşılanmış sivrisineklerde enfeksiyon ve yayılma oranı %100, oral infeksiyon sivrisineklerde ise sırasıyla %70 ve %38,1 olarak bulundu. İntratorasik olarak aşılanmış sivrisinekler için bulaşma oranı% 90'a kadar ulaştı, ancak oral enfekte sivrisinekler için sadece% 4.8 idiBeslenme miktarı viral içeriği etkilediğinden, tutarlılığı korumak için engorged dişi sivrisinekler seçildi.
