Glioblastoma için tedavi bulmak, tümörlerde var olan hücresel çeşitlilik ve çeşitli mikro ortamlar arasındaki etkileşimler nedeniyle zordur. Organoidler bu mekansal çeşitliliğin bir kısmını yeniden yaratmaya yardımcı olabilir ve bunu tümörlerin biyolojisini daha iyi anlamak için kullanabiliriz. Geleneksel hücre kültürü yöntemleri homojen tümör hücresi popülasyonları üretme eğilimindeyken, organoidler glioblastomun moleküler ve hücresel çeşitliliğini daha iyi taklit edebilir ve intratümöral etkileşimleri daha iyi modelleyebilir.
Organoidler ilaç etkinliğini ve direnç mekanizmalarını araştırmak için kullanılabilir. Klinik tedavilere direnç, bu hastalığın klinik gerçekliğini yansıtan geleneksel küre kültüründe değil, sadece organoidlerde ortaya çıkabilir. Organoidler, kemoterapilerin bölgesel etkilerini göstermeye yardımcı olabilir.
Yeni niş spesifik terapileri keşfetmek için kullanılabilirler ve gelecekte kişiselleştirilmiş tıp için öngörücü bir araç olarak da hareket edebilirler. Organoidleri oluşturmak için kullanılan bazı malzemeler sıcaklığa duyarlıdır ve bu malzemeleri uygun sıcaklıklarında tutmayı ihmal etmek, organoidlerin oluşturulmasında veya korunmasında zorluklara yol açabilir. Balmumu kağıdını parafilm tabakasından çıkarıp iki steril 96 delikli polimeraz zincir reaksiyonu veya PCR plakası arasına yerleştirerek organoid kalıpları bir kültür başlığı altında hazırlamaya başlayın.
Parafilmin içinin temiz olduğundan emin olun. Parafilmde delik açmadan iki milimetre derinliğinde küçük çukurlar oluşturmak için üst plakaya eşit basınç uygulayın. Plakaları ayırın.
Çukurlu parafilm üst plakaya yapışacaktır. Ardından üst plakayı 30 saniye boyunca kuru buz üzerine yerleştirin. Parafilmi üst plakadan hızlı bir hareketle çekmek için steril forseps kullanın.
Dondurulmuş parafilmin çıkarılması daha kolaydır. Tamamlanan parafilm kalıbını kaplı, steril 10 santimetrelik bir hücre kültürü kabına yerleştirin. Tek hücreli süspansiyonu glioblastoma veya GBM yapışkan kültürden hazırlamak için, kullanılan ortamı plakadan çıkarın.
Daha sonra plakaya oda sıcaklığında iki mililitre hücre ayırma çözeltisi ekleyin ve plakayı üç dakika boyunca 37 derecede inkübe edin. Mikroskop altında plakadan hücre ayrılmasını doğruladıktan sonra, hücre ayrılma çözeltisini nötralize etmek için sekiz mililitre Nörobazal Orta tam veya NBMc ortamı ekleyin. Süspansiyonu 70 mikronluk tek bir hücre süzgecinden süzün.
Hücreleri beş dakika boyunca 120 kez G'de döndürün. Daha sonra süpernatantı çıkarın ve hücreleri bir mililitre NBMc'de yeniden askıya alın.
Tek hücreli bir süspansiyondan organoidler yapmak için, bir buz kovasında veya soğuk blokta küçük bir santrifüj tüpüne uygun miktarda laminin bakımından zengin hücre dışı matris veya lrECM ekleyin. Organoid başına 20.000 hücre içeren bir hücre karışımı hazırlayın. Hücrelerin yerleşmesini önlemek için lrECM hücre süspansiyon karışımını iyice karıştırın, bu da düzgün olmayan organoid oluşumuna neden olur.
Daha sonra, inci benzeri bir damlacık oluşturmak için karışımın 20 mikrolitresini bir parafilm kalıbına dikkatlice pipetleyin. LrECM polimerizasyonunu önlemek için pipet ucunu her iki ila üç organoidde bir soğuttuğunuzdan emin olun. İstenilen sayıda organoid, 10 santimetrelik bir kültür plakasında parafilm kalıbına pipetlendikten sonra, organoidleri bir hücre kültürü inkübatöründe bir ila iki saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.
Organoidler katılaştıktan sonra, organoidleri bir P1000 ucu kullanarak NBMc ortamı ile parafilm kalıbından yavaşça yıkayın ve bunları 20 mililitre NBMc içeren yeni bir 10 santimetrelik kültür plakasına toplayın. Dört gün sonra, plakadaki ortamı değiştirin.
Bunu yapmak için, hücre kültürü plakasının altına bir parça koyu renkli kağıt yerleştirin. Plakayı eğin ve 20 saniye bekleyin. Organoidler kabın dibine tamamen yerleştikçe, ortamı büyük açılı bir cam pipetle yavaşça çıkarın.
Yeni medya ekledikten sonra, plakayı inkübatöre 80 RPM'de bir yörüngesel çalkalayıcı üzerine yerleştirin ve bundan sonra her iki ila üç günde bir ortam alışverişinde bulunun. Organoidin büyümesi ışık mikroskobu kullanılarak gözlendi. Merkez görünümde, erken organoid büyümesi lrECM yoluyla göç ve tek hücreli invazyon gösterdi.
Yedi haftadaki olgun organoidler bir kuruşun büyüklüğüne göreydi. GBM organoidlerinin fosfo-histon H3 ile immünohistokimyasal boyanması, organoid çevrede çekirdeğe kıyasla kahverengi veya mor görünümlü oldukça proliferatif hücreler ortaya çıkardı. %0.1 DMSO'daki organoidler için hücre canlılığı verileri, intraorganoid ve interorganoid tutarlılık göstermiştir.
Organoid biyokütle ve medya asitlenmesine dikkat edin. Organoidler ortamdan çok hızlı geçiyorsa, medyayı daha sık değiştirdiğinizden veya organoidleri ek plakalar arasında böldüğünüzden emin olun. Olgun organoidler, terapilerle yapılan deneyler için kullanılabilir veya immünohistokimya veya immünofloresan ile kullanım için gömülü ve kesitli olarak kullanılabilir.
Ayrışmış organoidler FACS analizi için kullanılabilir. Bu organoidler son zamanlarda mekansal olarak farklı kanser kök hücre nişlerinde gerekli olan hedefleri keşfetmek için üç boyutlu fonksiyonel taramada kullanılmıştır. Bu modelleri, in vivo testlerden önce farklı ilaçlara ve tedavilere öncelik vermek için de kullanıyoruz.
