Protokol, sıvı hücre TEM ve ışık aydınlatmasının kombinasyonunun, ışık aydınlatması üzerine fotosensitizör ile kapsüllenen bakterilerdeki yapısal değişiklikleri gözlemlemek için nasıl kullanılabileceğini sunar. Bu tekniğin temel avantajı basitliğidir. Protokol zor numune hazırlama gerektirmez ve bakterilerin fotosensitizör çözeltisi ile yeterli kapsüllenmesini sağlar.
Başlamak için, optik fiberi objektif lensin üstündeki mikroskop sütununa bağlayarak iletim elektron mikroskobunu değiştirin. Objektif lens ile kondansatör lens arasında birkaç santimetre boşluk bırakın, ayrıca aksesuarlar için boş bir yuva bırakın. Amorf karbonla kaplı iki işlenmemiş TEM ızgarasını, karbon kaplı tarafı üste bakacak şekilde iki çapraz cımbız arasına yerleştirin.
Izgaraları kenara mümkün olduğunca yakın tutun. Izgaralardan birine dört mikrolitre bakteri çözeltisi koyun. Numunenin optik yoğunluğu beş ila 10 arasında olmalıdır.
60 saniye bekleyin ve filtre kağıdı kullanarak sıvıyı dikkatlice kurulayın. İşlem sırasında sıvıyı tüm ızgara yüzeyine yaymaya çalışın. Aynı ızgaraya dört mikrolitre fotosensitizör koyun.
Beş saniye sonra, sıvıyı lekeleyin. Substrat üzerinde çok ince bir sıvı tabakası bırakın. Kuru ızgarayı sıvı ile kaplı olanın üzerine hızlıca yerleştirin.
Üst ızgarayı yavaşça ikincisinin kenarına hareket ettirin ve cımbız kullanarak kenarlardaki substratları sıkın. Sıkmayı dikkatlice tekrarlayın. Sıvı hücreyi cımbız arasında bir dakika bekletin.
Hazırlığı bitirdikten hemen sonra numuneyi TEM tutucuya yerleştirin. Numuneyi mikroskopa yerleştirdikten sonra, uygun bir gözlem alanı bulmak için gözlemleri düşük büyütme modunda başlatın. Gözlemler sırasında elektron dozunu mümkün olduğunca düşük tutun.
Pozlama süresini genişletin. Sıvıyla çevrili hücreleri, uzun pozlama süresiyle uygun büyütmede bulun ve ilk görüntüyü hemen yakalayın. Elektron dozunu sabit tutun ve değişiklikleri gözlemlemek için her 30 saniyede bir görüntü toplayın.
Görüntüleri dikkatlice inceleyin ve hücrelerdeki ilk görünür değişikliklere karşılık gelen toplam elektron dozunu hesaplayın. Deneye başlamadan önce, mevcut değeri ayarlayarak lazer ışık yoğunluğunu ayarlayın. Numuneyi mikroskopa yerleştirin ve gözlem alanını bulun.
Numunenin aydınlatılmasına başlamadan önce hücrenin ilk görüntüsünü yakalayın ve elektron ışınlamasının etkilerinden kaçınmak için elektron ışınını kapatmak için ışın karartıcıyı kullanın. Lazeri açın. Lazer ışığı nispeten yüksek yoğunluğa sahip olduğu için kısa bir aydınlatma süresi ile başlayın.
Bu süreden sonra, ışık kaynağını kapatın. Kiriş karartıcıyı kapatın ve görüntüyü hemen yakalayın. Mümkünse, örneği yalnızca görüntüyü çekmek için gereken süre boyunca ortaya çıkarmak için otomatik bir algoritma kullanın.
Görüntüleme için kullanılan elektron dozunu hesaplamak için elektron ışınlama süresini dikkatlice ölçün. Bir dakika sonra fotosensitizörün daha hafif radyasyonu ile üretilen reaktif oksijen türlerinin neden olduğu hücrenin dış tabakasında kayda değer bir bozulma gözlenir. Daha fazla ışık aydınlatması, değişiklikleri daha görünür hale getirdi.
Yeterli sıvıya sahip uygun gözlem noktaları, bu alanlar daha koyu ve bulanık göründüğü için düşük büyütmede kolayca bulunabilir. Sıvı kaplı bakteriler kuru olanlardan daha az görünürdür, ancak yine de ayırt edilebilir. Görüntüleme sırasında sıvı sınırına bakmak yararlıdır ve hareketi kolayca tespit edilebilir, bu da seçilen alanın uygun ve dengesiz olabileceği anlamına gelir.
Gözlemler sırasındaki bir diğer konu, suyun buharlaşması ve bakterileri çevreleyen alanlar da dahil olmak üzere numunenin rastgele alanlarında meydana gelebilecek çözeltinin çökelmesidir. Bakterilerin kapsüllenmesi grafen ve silikon nitrat membranları kullanılarak da gerçekleştirilebilir. Numune hazırlama daha zordur, ancak sıvı hücrenin stabilitesi daha iyi olacaktır.
Sunulan yöntem, sıvı üzerindeki ışık kaynaklı reaksiyonların gözlemleri için kullanılabilir. Örneğin, ışığın metal malzemeler, ışık kaynaklı katalizörler ve fotokimyasal reaksiyonlar üzerindeki etkisi.
