Bu protokol, fare kesici kök hücre nişinin etiket tutucu hücrelerinin in vivo ve üç boyutlu görselleştirilmesi ve nicelleştirilmesi için bir yöntem açıklamaktadır. Bu teknik, yeni öğrenenler için zaman kazandıran ve kullanıcı dostudur. 3D görüntüler dokuya zarar vermeden elde edilir.
3B niceliklendirme, verileri daha güvenilir ve doğru hale getirir. Başlamak için, mandibulaları parçalara ayırın. Numuneleri% 4 paraformaldehit içinde sabitleyin ve gece boyunca oda sıcaklığında tutun.
Kuluçkadan sonra, kasları mandibulalardan çıkarın. 37 derecelik bir santigrat derece çalkalayıcıda günlük bir ortam değişimi ile dört gün boyunca kalsifiye etmek için onları 0.5-molar etilendiamintetraasetik asit çözeltisine batırın. Kalan kan hemesini çıkarmak için bir gün boyunca 37 derecelik bir Santigrat çalkalayıcı üzerinde 15 mililitre% 25 Quadrol çözeltisindeki mandibulaların rengini açın.
Tüm montaj 5-etinil-2-asal-deoksiüridin boyama için, metinde belirtildiği gibi taze bir 5-etinil-2-asal-deoksiüridin etiketleme kokteyli hazırlayın. Mandibulaları fosfat tamponlu bir salin ile Tween 20 veya PBST ile 37 santigrat derecelik bir çalkalayıcıda 30 dakika boyunca durulayın. Mandibulaları fosfat tamponlu salin ile her biri üç dakika boyunca üç kez durulamayı tekrarlayın, ardından gece boyunca bir çalkalayıcıda taze hazırlanmış 5-etinil-2-prime-deoksiüridin etiketleme kokteylinde inkübasyona uğrayın.
Fosfat tamponlu tuzlu su yıkamayı üç kez tekrarlayın ve mandibulaları metinde belirtilen çözeltilere her biri 37 santigrat derece çalkalayıcıda altı saat boyunca yerleştirerek seri de-lipidasyon gerçekleştirin. Mandibulaları tert-bütanol-polietilen glikol veya tB-PEG çözeltisinde, günlük ortam değişimi ile iki gün boyunca 37 santigrat derecede dehidrate edin. İki gün sonra, kırılma indisi eşleşmesi elde etmek için ve şeffaflık sağlanana kadar% 75 benzil benzoat,% 22 polietilen glikol-metil-eter metakrilat ortalama 500 veya PEG-MMA500 ve% 3 Quadrol içeren benzil benzoat-polietilen glikol temizleme ortamındaki mandibulayı temizleyin.
Dokudan arındırılmış tüm mandibulayı benzil benzoat-polietilen glikol temizleme ortamındaki marka boşluk slaytlarına monte edin ve cam kapak kızaklarıyla örtün. Konfokal görüntüleme yazılımında, istenen görüntü alma parametrelerini ayarlayın. Floresan uyarma panelinde, floroforları en iyi şekilde uyarmak için gereken lazeri etkinleştirin.
Floresan algılama panelinde, ölçülecek dalga boylarını seçmek için kaydırıcıyı hareket ettirin. Cam kapak kaymasının ve amacın kırılma indisine uyacak şekilde kapak kapağının üzerine kırılma indisi 1.52 olan bir damla daldırma yağı ekleyin ve monte edilmiş mandibulayı mikroskop aşamasına yerleştirin. Floresan lambaları açın ve ilgilendiğiniz bölgeleri görüntülemek için uygun bir büyütme hedefi seçin.
Canlı tarama modunda, mandibulanın tüm bölgesini X ve Y boyutlarında görselleştirmek için görüş alanını tanımlayın. Fare kesici dişindeki kök hücre nişinin hacmini doğru bir şekilde kaplayan üst ve alt Z aşaması edinme parametrelerini ayarlayın. İki mikrometrelik bir Z adım boyutu kullanın veya ihtiyacınıza göre.
Z-stack görüntü dosyalarını lif formatında edinin ve kaydedin. Z-stack görüntü dosyasını yerel biçim dosya türüne dönüştürmek için bir görüntüleme yazılımı dosya dönüştürücüsü kullanın. Görüntüleme yazılımında Arena düğmesini tıklayın, sonra Görüntü'yü seçin.
Orijinal lif dosyasını seçin ve birleştirilmiş dosyayı seçin. Görüntüler görüntüleme yazılımına aktarılacaktır. Görüntü veri kümesini açmak için içe aktarılan dosyayı çift tıklatın.
Görüntüleme yazılımında, Ekran Ayarı panelini ziyaret edin. Ekran Ayarı panelinde, kanalın adını tıklatın. Varsayılan modda genellikle kırmızı olarak etiketlenir.
Image Properties (Görüntü Özellikleri) penceresinde, Mapped Color (Eşlenen Renk) sekmesine tıklayın. Renk Sekmesi Dosyası seçeneğinde, Yangın Akışı'nı seçin ve ardından Tamam'a tıklayın. Arka plan floresansını ve pozitif floresansı numuneden ayırt etmek için ekran rengini seçin. Ekranın sol üst tarafında, Sahne Özellikleri bölmesinde, Yeni Yüzey Ekle etiketli mavi simgeye tıklayın.
Arka plan floresansının çoğunu kaldırmak için Ses Düzeyi simgesinin seçimini kaldırın, böylece pozitif floresan manuel segmentasyon sırasında belirgin bir şekilde görülebilir. Ardından, Oluştur sekmesine tıklayıp Otomatik oluşturmayı atla, manuel olarak düzenle sekmesini seçerek ilgili bölgenin veya YG'nin manuel olarak segmentasyonunu başlatın. Manuel yüzey oluşturma sihirbazında, YG'yi kolayca şekillendirmek için numunelere göre yönlendirmeyi seçmek üzere Kontur sekmesine tıklayın.
Ardından, sağ köşedeki işaretçi menüsünün Seç modunda olduğundan emin olun. Dokudaki YG'yi bulmak için dilim konumunu ayarlayın. Daha önce de belirtildiği gibi, çoğu arka plan floresanı zaten kaldırılmıştır.
Çiz düğmesine tıklayın ve geçici bir ilgi alanı çizin. YG dışındaki diğer alanlardan gelen etkileşimi önlemek için Görünürlük seçeneğini Yok olarak belirleyin ve ardından ilgilenilen bölgeyi dilim dilim bölümlere ayırın. ROI çizimi tamamlandıktan sonra, ROI'nin 3B geometrisini almak için Yüzey Oluştur'a tıklayın.
Manuel yüzey oluşturma sihirbazındaki Düzenle düğmesine tıklayın ve Tümünü Maskele'yi seçin. Açılan Maske Kanalı penceresinde, Kanal Seçimi seçeneklerinde Kanal 1'i seçin. Daha sonra, maskeyi uygulamadan önce Kanalı çoğalt'ı seçin.
Maske ayarlarında İç/dışta sabit'i seçin ve voksel dış yüzeyini sıfıra ayarlayın. Sahne Özellikleri bölmesinde, Yüzey nesnesinin seçimini kaldırın ve Birim nesnesini seçin. Görüntü Ayarı'nda, orijinal Kırmızı kanalın seçimini kaldırın ve Maskelenmiş Kırmızı kanalı seçin.
İstenilen 3D işlenmiş ve pozitif etiketli floresan yatırım getirisini elde etmek için renk yoğunluklarını ayarlayın. 3B olarak oluşturulmuş etiket tutma hücreleriyle karşılaştırılabilir şekilde örtüşen 3B noktalar oluşturarak 3B olarak oluşturulmuş etiket tutma hücrelerini ölçmek için Noktalar simgesine tıklayarak yeni bir spot nesnesi oluşturun. Nokta oluşturma sihirbazındaki adımlar arasında geçiş yapmak için alt okları kullanın.
Son düğmesine tıklayın ve İstatistik düğmesini seçin. Ardından, görüntüdeki toplam nokta sayısının değerini bulmak için Genel sekmesini seçin. 5-etinil-2-asal-deoksiüridin etiketleme ve polietilen glikol ile ilişkili çözücü sistemi doku temizleme işleminden sonra, şeffaf mandibula elde edildi.
Modifiye edilmiş numune, doku temizleme işlemi olmayan normal bir mandibula ile karşılaştırıldı ve 5-etinil-2-prime-deoksiüridin etiketlemeli şeffaf bir mandibula konfokal görüntülemeye tabi tutuldu. Kesici dişin optik bölümü, XY düzlemindeki kesici tepenin kök hücre nişinde etiket tutucu hücreler gösterdi. Bir kesici tepenin 3D görüntü yapısı, hem epitel hem de mezenkimal kök hücre nişinde 5-etinil-2-prime-deoksiüridin pozitif etiket tutucu sessiz kök hücreleri gösterdi.
5-etinil-2-asal-deoksiüridin pozitif hücreler, mezenkimal etiket tutucu hücrelerle karşılaştırılabilir şekilde örtüşen niceleme için noktalara aktarıldı. Sadece mezenkimal etiket tutucu hücreler ve sadece epitel etiket tutucu hücreler için oluşturulan lekeler görüntüde görülebilir. Epitel ve mezenkimal etiket tutucu hücrelerin nicelleştirilmesi de yapıldı.
İşleme ve temizleme özellikleri en önemli adımlardır ve tatmin edici sonuçlar elde etmek için dokunun kullanımına göre optimize edilmelidir. Bu yöntem ayrıca S2VGFP seviyesindeki LRC'leri görselleştirmek ve hücre soy izlemede soy konumu ve bunların niceliği veya katkıları hakkında ayrıntılı bilgi edinmek için değiştirilebilir.
