Bu yaklaşım, yenidoğan ex vivo fare kalbinin retrograd perfüzyonunu üç dakikadan kısa sürede güvenilir bir şekilde kurar. Böylece mümkün olan en genç çalışma yaşını birkaç haftadan doğum sonrası 10 güne düşürür. Bu izole retrograd perfüze model, genetik olarak değiştirilebilir ve düşük maliyetli bir türde kritik bir kardiyak gelişim döneminde yenidoğan kalbinin incelenmesine izin verir.
Bu model, yenidoğan kalbindeki iskemi-reperfüzyona fizyolojik ve farmakolojik yanıtların incelenmesine kendini borçludur. Ayrıca kardiyomiyosit izolasyonu için de kullanılabilir. Yenidoğan fare aort kanülünü imal etmek için, iğne lümeninin çapını kıvırmamaya veya kısıtlamamaya dikkat ederek, ucu kesmek ve 26 gauge paslanmaz çelik iğnenin ucunu köreltmek için keskin makas kullanın.
Ardından, laboratuvar tezgahının üstündeki körelmiş ucu bir to-fro hareketi kullanarak hafifçe kazıyarak çapakları gidermek için kesme kenarını yumuşatın. Daha sonra, imal edilmiş kanülü Langendorff aparatına takın ve akışı ve direnci değerlendirin. Bir dakikalık bir aralıkta tampon miktarını toplayıp ölçerek kanül boyunca akış hızlarını ölçün.
Krebs-Heneseleit tamponu akarken kanül boyunca basınç farkını ölçmek için, kanül takılı olsun veya olmasın sistemdeki basıncı ölçün. Ardından aşağıdaki formülü kullanarak kanül direncini hesaplayın. Ardından, 26 gauge kanülü Langendorff cihazından çıkarın ve cihazdaki kanülasyon bölgesine yüksek basınçlı bir boru takın.
Daha sonra aort kanülünü borunun distal ucuna takın ve boruyu ve kanülü oksijenli tamponla havalandırarak tüm kabarcıkların çıkarılmasını sağlayın. Koroner mikrotrombüs oluşumunu önlemek için, bir mililitrelik bir şırınga üzerinde 26 gauge iğne kullanarak 10 günlük bir fare yavrusuna intraperitoneal heparin enjeksiyonu uygulayın. Herhangi bir anestezik enjeksiyonuna devam etmeden önce heparinin dolaşması için birkaç dakika bekleyin.
Daha sonra, anestezi uygulanan fareyi sırtüstü pozisyona yerleştirin ve bilinç kaybından hemen sonra uzuvları sabitleyin. İlk diseksiyon sırasında hayvan kendiliğinden nefes alırken, hayvan ayak parmağı sıkışmasına yanıt vermediği anda hasada başlayın. Düz diseksiyon makası kullanmak, karın boşluğunu açığa çıkaran hayvan genişliği boyunca enine bir subksifoid kesi yapar.
Bir asistandan ksifoid süreci forsepslerle kavramasını isteyin, ardından göğüs kafesini orta aksiller çizgi boyunca iki taraflı olarak sefalad yönünde kesin ve torasik organları açığa çıkarmak için sternum ve kaburgaları kraniyal olarak yansıtın. Diyaframı üstün bir şekilde tanımladıktan sonra, ön kısmı tamamen kesin. Karaciğerin üzerindeki infradiafragmatik inferior vena kavayı tanımlayın ve kavisli bir İris makası ile transekte ederken, İris forseps ile proksimal segmentteki sefalad gerginliğinde hafif iç kısım koruyun.
Daha sonra, inferior vena kavayı göğüs boşluğundan yukarı ve dışarı çekerken kavisli İris makası kullanarak omurganın iç yüzeyi boyunca posterioral olarak kesin. Kalp harekete geçtikçe, makası önden açın ve kalbi ve akciğerleri tamamen çıkarmak için büyük damarları üstün bir şekilde ayırın. Numuneyi derhal buz gibi soğuk Krebs-Henseleit tamponuna veya salinine batırın.
Kalp saniyeler içinde atmayı bırakmalıdır. Kanülasyon sırasında kalbi stabilize etmek için sürtünme sağlamak için sığ bir Petri kabının dibine bir parça kağıt havlu yerleştirin. Kalbin yapışmasını önlemek için kağıt havluyu buz gibi soğuk Krebs-Henseleit tamponuyla nemlendirin.
Hazırlanan Petri kabını diseksiyon mikroskobunun altına yerleştirin ve odağı ayarlayın. Şimdi, yüksek basınçlı uzatma borusuna tutturulmuş aort kanülünü, diseksiyon mikroskobunun altına, göbeğinin etrafına gevşek bir şekilde bağlanmış 5-0 ipek bir sütür ile birlikte yerleştirin. Eksize edilmiş torasik organları Petri kabına yerleştirdikten sonra, timusu beyaz parlaklığı ve iki lobuyla tanımlayın ve numuneyi timus ön ve üstün olacak şekilde yönlendirin.
Daha sonra, forseps kullanarak, büyük damarları açığa çıkaran timüsün loblarını açıkça ayırın. Daha sonra aort arkının ayırt edici dallanma özelliklerini bularak aortu tanımlayın ve ince keskin makas kullanarak subklaviyen arter kalkışına sadece proksimal olarak aktarın. Şimdi kuyumcu tarzı ince kavisli forseps kullanarak transekte aortu nazikçe kavrayın ve aort kapağına zarar vermemeye dikkat ederek 26 gauge künt iğne ile aortu dikkatlice kanüle edin.
İnce kavisli forseps kullanarak, kanülün etrafındaki aortu kavrayın ve iskemik zamanı sınırlamak için retrograd perfüzyonu başlatın. Asistandan gevşek bağlanmış dikişin uçlarını kavramasını isteyin ve aortu kanülün etrafına dikkatlice sokun. Sütürü ince kavisli forsepslerin üstünde veya altında sıkıştırın, ardından sütürü sıkın ve koroner akışın yeterliliğini onaylayın.
Yüksek basınçlı boruyu Langendorff cihazından ayırın, kanülün göbeğini kavrayın ve künt iğneyi yüksek basınçlı uzatma borusundan ayırın. Ardından kanülün göbeğini hızla cihaza takın. Kalp Langendorff aparatına normal pozisyonda asıldıktan sonra, yeterli bir perfüzyon doğrulanır.
Akciğer, timus ve fazla dokuyu dikkatlice kesin. Daha sonra koroner sinüs atık suyunun serbestçe damlamasına izin vermek için sağ atriyumu kesin. 5-0'lık ipek dikişin sonunda küçük bir düğüm yapın, ardından iğneyle küçük bir parafin filmi parçasını delin ve parafini düğümlü uca kaydırın.
İğneyi ventrikülün tepesinden dikkatlice geçirin ve parafin filmi ventrikülün lateral duvarına yaslanana kadar sütürü kalpten çekin. İğneyi Langendorff aparatının su dolu ısıtma ceketinin açıklığından geçirin, böylece kalp kaplanabilir ve ısıtılabilir. Daha sonra iğneyi koroner sinüs damlamasını önleyen kuvvet dönüştürücüsüne takın.
Sütürü, diyastolik gerilim veya nadir niyet izleme ile belirtildiği gibi bir ila iki gram bazal gerginlik uygulayacak şekilde ayarlayın. Daha sonra elektrokardiyogramı kaydetmek için yüzey elektrotlarını kalbin üst ve alt kutuplarına yerleştirin. Son olarak, 24 gauge intravenöz kateter kullanarak analiz için koroner sinüs atık suyunu örnekleyin.
Yüzey elektrotları, içsel hız ve ritmin belirlenmesine izin veren sürekli bir elektrokardiyogramı kaydetmek için kullanıldı. Yeterince perfüze edilmiş tüm kalpler sinüs ritminde kendiliğinden atar. Bu perfüzyon stratejisi, ihmal edilebilir laktat üretimi ve düşük yüzde oksijen ekstraksiyonu ve glikoz tüketimi göz önüne alındığında, yenidoğan fare kalbinin metabolik ihtiyaçlarını karşıladı.
Ortalama denervasyonlu intrinsik kalp hızı ve ortalama gözlenen aort perfüzyon basınçları gibi fizyolojik değişken araçlar da kaydedildi ve hesaplandı. Yenidoğan preparasyonunun tutarlılığını sağlamak için reperfüzyonu başlatmak için gereken süre, aritmi süresi ve aort perfüzyon basıncı gibi bazı dışlayıcı kriterler göz önünde bulundurulmalıdır. Perfüzyonun kurulmasından sonra, ilaç verilmesi, iskemi-reperfüzyon hasarının indüklenmesi, metabolitlerin değiştirilmesi veya kardiyomiyosit izolasyonu için enzimatik ajanların verilmesi gibi girişimler meydana gelebilir.
