Melanositler üretmek için doğrudan yeniden programlama bildirilmiştir. Bununla birlikte, farklı çalışmalarda çeşitli transkripsiyon faktörleri kullanılmaktadır. Bu protokolde, transkripsiyon faktörü sayısını hala daha yüksek yeniden programlama verimliliği ile doğruladık ve azalttık.
Sadece üç transkripsiyon faktörü olan Mitf, Sox10 ve PAX3'ü kullanarak melanositler üretmek için doğrudan bir yeniden programlama sistemi kurduk ve kültür sistemini daha kararlı ve sağlam hale getirmek için değiştirdik. Fonksiyonel melanositlerin nasıl yenileneceği, vitiligo gibi depigmentasyon hastalıkları için tedavi sınırlamalarının ele alınmasına yardımcı olabilecek önemli bir sorudur. Doğru yeniden programlama, ileriye dönük bir teknik sağlar Tekniğimiz, tanıtılması ve tekrarlanması daha kolay olan kolaylık, güçlü çalışabilirlik ve kararlılık özelliklerine sahiptir.
Konsantre lentivirüsün üretimine başlamak için, 6 HEK-293T hücresine 1,5 kez 10 kez 60 milimetrelik bir kaba yerleştirin ve normal ortama sahip hücreleri% 5 karbondioksit içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 santigrat derecede kültürleyin. Kuluçkadan 24 saat sonra, HEK-293T hücreleri% 80 ila% 90 akıcılığa ulaştığında, ortamı 3.5 mL DMEM ile değiştirin, ardından hücreleri iki saat boyunca% 5 karbondioksit içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 santigrat derecede inkübe edin. Hücreleri inkübatörden çıkardıktan sonra, ortamı% 2 FBS içeren DMEM ile değiştirin ve taze hazırlanmış transfeksiyon kompleksi karışımını hücrelere damla damla bir şekilde ekleyin.
Sıvı karışımı nazikçe karıştırın. Sekiz saatin sonunda, hücre ortamını 3.5 mL normal ortam ile değiştirin. Virüs süpernatantını 24 ve 48 saatte toplayın.
Daha sonra, iki farklı zaman noktasında toplanan virüs süpernatantlarını karıştırın ve karışımı dört santigrat derecede beş dakika boyunca 200 xg'de santrifüj edin. Daha sonra toplanan süpernatantı 50 mL'lik steril konik bir tüpte filtrat toplamak için 0.45 mikron filtrelerden geçirin. Filtrelenmiş virüs süpernatantını gece boyunca dört santigrat derecede 6.000 xg'de santrifüjleme ile konsantre edin.
İşiniz bittiğinde, virüs peletinin konik tüpün dibinde görünür olduğundan emin olun. Süpernatantı yavaşça dökün. Virüs peletini normal ortamda, virüs süpernatantının 100th * hacminin bir tanesi ile çözmek için.
Homojen bir 100x konsantre virüs karışımı elde edilene kadar yavaşça yukarı ve aşağı pipet yapmak için bir P1000 mikropipet kullanın. Konsantre virüsü 80 santigrat derecede saklamak için mikrosantrifüj tüplerine bölün. 5. HEK-293T hücrelerine 1 kez 10 kez altı delikli bir plakanın bir kuyucuğuna plaka yapın.
Bu hücreleri% 5 karbondioksit içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 santigrat derecede normal ortamla kültürleyin. 24 saat sonra, her bir kuyucuğa 100x floresan konsantre virüsün 0.1 ila 0.2 mikrolitresini ekleyin. Bunu takiben, her bir kuyucuğa katyonik polimerik transfeksiyon reaktifinin mikrolitresi başına dört nanogram eklenmesi takip edilir.
Virüs ile enfeksiyondan yaklaşık sekiz ila on iki saat sonra, ortamı normal ortamla değiştirin. Enfeksiyondan kırk sekiz saat sonra, ölü hücreleri çıkarmak için bulaşığı 1 mL steril PBS ile yıkayın. Daha sonra, oda sıcaklığında altı delikli bir plakanın kuyucuğu başına 250 mikrolitre% 0.05 tripsin-EDTA çözeltisi kullanarak hücreleri tripsinize edin.
Plakayı dört santigrat derecede beş dakika boyunca 200 xg'de santrifüj yapın. Süpernatanı çıkardıktan sonra, hücre peletini bir mL PBS içinde tekrar askıya alın ve hücre süspansiyonunu beş mL'lik polistiren yuvarlak tabanlı bir tüpe ekleyin. Ardından, numuneyi analiz etmek için tüpü akış sitometresine yerleştirin.
Fibroblastların doğrudan yeniden programlanması için, altı kuyucuklu bir hücre kültürü plakasının bir kuyucuğunu, oda sıcaklığında 1 mL% 0.1 jelatin çözeltisi ile kaplayın. 15 ila 30 dakika sonra, kuyu tamamen jelatin ile kaplandığında,% 0.1 jelatin çözeltisini aspire edin. Daha sonra, 4. fare embriyonik fibroblastlarına veya MEF'lere 5 kez 10 kez,% 0.1 jelatin ile kaplanmış altı kuyucuklu bir plakanın bir kuyucuğuna plakalayın ve% 5 karbondioksit içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde hücreleri 37 santigrat derecede normal ortamla gece boyunca kültürleyin.
24 saat sonra, MEF'ler% 40 ila% 50 akıcılığa ulaştığında, ortamı normal ortamla değiştirin. Daha sonra, donmuş, konsantre virüsü buz üzerinde eritin. Denklemi kullanarak eklenecek virüsün hacmini hesaplayın ve ardından hesaplanan hacme göre altı transkripsiyon faktörü için konsantre virüsü her bir kuyucuğa ekleyin.
Katyonik polimerik transfeksiyon ajanının mL'si başına dört mikrogramı kuyucuğa ekleyin. Bunu lentivirüs enfeksiyonunun sıfır günü olarak düşünün. İlk gün, 8 ila 12 saatlik enfeksiyondan sonra, virüsü içeren ortamı taze normal ortamla değiştirin, kararlı enfekte hücre hatlarını taramak için mL puromisin başına 0.5 mikrogram ekleyin.
İkinci günde, enfeksiyondan 48 saat sonra, süpernatant ortamı yavaş yavaş yeniden programlama ortamı ile değiştirin. Üç mikromolar CHIR99021 eklemeden önce toplam orta hacmin dörtte birini değiştirin. Üçüncü günden yedinci güne kadar, hücrelerin durumuna bağlı olarak, beş gün içinde tam yeniden programlama ortamına geçmek için ortamı kademeli olarak daha yüksek oranda yeniden programlama ortamıyla değiştirerek ortamı değiştirin.
Daha sonra, hücreleri oda sıcaklığında üç dakika boyunca 500 mikrolitre% 0.05 tripsin-EDTA sindirim enzimi ile ayırın. Hücrelerin yaklaşık yüzde altmışı yüzdüğünde, sindirim enziminin hacminin iki katı olan normal ortamı ekleyerek sindirimi durdurun. Hücre süspansiyonunu 15 mL'lik steril konik bir tüpte toplayın ve dört santigrat derecede beş dakika boyunca 200 xg'de santrifüj yapın.
Hücre peletini yeniden programlama ortamıyla yeniden askıya almadan önce süpernatantı çıkarın. İşiniz bittiğinde, yeniden askıya alınan hücreleri 60 milimetrelik steril bir kapta tabaklayın. Hücreleri nemlendirilmiş% 5 karbondioksit inkübatöründe 37 santigrat derecede kültürleyin.
HEK-293T hücrelerinde kırk sekiz saatlik lentivirüs enfeksiyonundan sonra, konsantre lentivirüs üretiminin başarısı, GFP'nin floresan yoğunluğunu gözlemleyerek veya akış sitometrisi ile değerlendirildi. Konsantre virüsün titresinin 10 ila 8. TU / mL'de yüksek olduğu bulundu. Fibroblastların doğrudan yeniden programlanması sırasında, hücre morfolojisi yavaş yavaş uzatılmış hücre sinapsına ve genişlemiş hücre çekirdeklerine dönüştü.
Bununla birlikte, hücreler yirmi günden sonra giderek yaşlanır. Transkripsiyon faktörlerinin, Mitf, Pax3 veya Sox10'un çıkarılması, melanositik genlerin, Tyr, Tyrp1 ve Mlana'nın ekspresyonunun susturulmasıyla sonuçlandı ve bu da fibroblastın melanositlere dönüşümü üzerindeki en büyük etkiyi gösterdi. Bu nedenle, üç transkripsiyon faktörü ile doğrudan programlama tarafından indüklenen melanositik genlerin ekspresyonu, altı transkripsiyon faktörü ile karşılaştırıldığında daha yüksekti.
MEF ile indüklenen melanositleri veya iMel'leri tanımlamak için, melanositik belirteçlerin, TYRP1 ve DCT'nin ekspresyonu, immünofloresan boyama kullanılarak tespit edildi. Ayrıca, DOPA ve Masson-Fontana boyama gibi melanine özgü boyama yöntemleri olumlu sonuçlar göstermiştir. 293T hücreleri eşit olarak dağıtılmalıdır.
Ayrıca, hücrelere transfeksiyon karışımının eklenmesi, hücrelerin yüzmesini önlemek için nazikçe yapılmalıdır. Protokol kararlı ve pratiktir ve diğer hücre türlerini yeniden programlamak için kullanılabilir. Gelecekteki tıpta melanosit rejenerasyonunda in vivo doğrudan yeniden programlama için bir referans ve strateji sağlamayı beklemektedir.
