Bu ortak kültür yöntemi, makrofaj fagositozun mezenkimal kök hücre düzenlemesinin arkasındaki hücre temas mekanizmalarını çevreleyen önemli soruların cevaplandırılmasına yardımcı olacak ve bu nedenle MSC'nin doğuştan gelen bağışıklığı düzenlemedeki rolünü aydınlatacaktır. Bu teknik yüksek verimli analizlerde uygulanabilir. Biyopartiküller sadece asidik fagolyozom ortamlarında pH'a duyarlı boyalar floresanlarına konjuge edildi.
Bu nedenle, yıkama ve söndürme gereklidir. Bu yöntem nötrofiller ve diğer fagositleri içeren çeşitli ortak kültür modellerine de uygulanabilir. Prosedürü gösteren ethan Chetkof olacak, şu anda laboratuvarımda bir lisans öğrencisi.
Başlangıç olarak, kültürlü mezenkimal kök hücrelerin birleştiği yer. % 70-80 izdiah elde edildiğinde, 100 milimetrelik bir tabakta kültürlü hücrelerden büyüme ortamını epire edin ve beş mililitre PBS ekleyin. PBS'yi aspire ettikten sonra, iki mililitre % 0.05 tripsin EDTA çözeltisi ekleyin ve hücreleri üç dakika kuluçkaya bırakın.
Üç dakika sonra, ters bir mikroskop kullanarak hücre müfrezesini kontrol edin. Ve hücreler ayrılmazsa, tekrar bir ila iki dakika kuluçkaya yatırın. Tüm hücreler ayrıldıktan sonra, plakaya beş mililitre taze büyüme ortamı ekleyin.
Trypsin orta karışımını kullanarak plakayı durulamadan sonra, hücreleri temiz, steril 50 mililitre konik bir tüpe toplamak için steril bir serolojik pipet kullanın. Daha sonra, hücreleri santrifüjleme ile aşağı doğru pelet. Süpernatantı aspire ettikten sonra, hücre peletini hafifçe yukarı ve aşağı pipetleme ile 10 mililitre taze büyüme ortamında yeniden canlandırın.
Hücre sayımı için, %0,4 Trypan Blue çözeltisinin 30 mikrolitresini içeren 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne 10 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin, ardından hemositometre sayım odasının kapaklarının altına 10 mikrolitre karışım ekleyin. Ters veya Brightfield mikroskobu altında, 10X objektif lens ve dört bir milimetrelik odacık kullanarak ulaşılamayan uygulanabilir hücreleri sayın ve hücre numarasını metin el yazmasında açıklandığı gibi hesaplayın. Hücre süspansiyonunun mililitre başına beşinci hücrelere bir kez 10'luk son konsantrasyonda hazırlanması için gereken taze orta ve hücre süspansiyonunun istenen hacmini belirlemek için C1V1 eşittir C2V2 denklemini kullanın.
Plaka tasarımına göre 96 kuyulu bir plakanın kuyularına hücre süspansiyonunun 100 mikrolitresini eklemek için çok kanallı bir mikropipetter kullanın. Plaka tasarımına göre oda kaydırağının her birine 530 mikrolitre hücre süspansiyonu eklemek ve bir gecede kuluçkaya yatmak için bir mikropipette kullanın. Makrofaj hücrelerini bir 100 milimetrelik tabakta etkinleştirmek için mililitre başına 250 nanogram konsantrasyonda interferon gama içeren 10 mililitre aktivasyon ortamı hazırlayın.
Büyüme ortamını makrofaj hücre kültürlerinden ayırın ve hücreleri interferon gamasından yoksun aktivasyon ortamının beş mililitresi ile durulayın. Deneysel çanaktaki durulama ortamını epire ettikten sonra interferon gama ile desteklenmiş 10 mililitre aktivasyon ortamı ekleyin. Ve kontrol kabına interferon gaması olmadan 10 mililitre aktivasyon ortamı ekleyin, ardından hücreleri 16 ila 24 saat kuluçkaya yatırın.
Kuluçkanın sonunda, ortak kültürleri hazırlamak için, aktivasyon ortamını makrofaj hücrelerinden çıkarın ve beş mililitre taze büyüme ortamı ekleyin. Hücreleri hafifçe kazımak ve hücreleri 50 mililitrelik konik bir tüpe toplamak için bir hücre kaldırıcı kullanın. Daha sonra, Trypan Blue dışlama ve hemositometri kullanarak hücreleri sayın, ardından kontrol hazırlığı ve tedavi makrofaj hücresi süspansiyonları mililitre başına iki kez 10 ila beşinci hücreler konsantrasyonda mezenkimal kök hücreler için daha önce gösterildiği gibi.
Mezenkimal kök hücreler içeren deneysel kuyulardan ortamı hafifçe aspire edin. Tedavi edilen 100 mikrolitreyi eklemek ve plaka tasarımına göre uygun deneysel kuyularda makrofaj hücresi süspansiyonlarını kontrol etmek için çok kanallı bir mikropipette kullanın ve gösterildiği gibi bir gecede kuluçkaya yatırın. Mezenkimal kök hücreler içeren dört duvarlı oda kaydıraktan ortamı hafifçe aspire edin.
Tasarıma göre uygun kuyulara 530 mikrolitre makrofaj hücresi süspansiyonu eklemek ve bir gecede kuluçkaya yatmak için bir mikropipette kullanın. Bir miligram Zymosan parçacığı içeren şişeye bir mililitre canlı hücre görüntüleme ortamı ekleyin ve orta parçacık karışımını bir cam kültür tüpüne toplayın. Şişeyi ek bir mililitre görüntüleme çözeltisi ile duruladıktan sonra, durulanmış görüntüleme ortamını cam tüpe aktarın, ardından mililitre Zymosan parçacık süspansiyonu başına 0,2 miligram elde etmek için üç mililitre ek görüntüleme çözeltisi ekleyin.
Vortex the Zymosan süspansiyonu 30 ila 60 saniye boyunca hızlı darbeler kullanarak, ardından süspansiyonu 60 hızlı darbe ile sonicate etmek için bir prob sonicator kullanın. Ortamı aspire ettikten sonra, deneysel kuyuları ve reaktif boş kuyuları 100 mikrolitre canlı hücre görüntüleme çözeltisi ile durulayın. Daha sonra, canlı hücre görüntüleme solüsyonını kuyulardan epire edin ve Zymosan süspansiyonunun 100 mikrolitresini ekleyin.
Dokunmatik yüzey arayüzünü kullanarak floresan okuyucunun plaka tepsisini açın. Tabağı sol üst köşede A1 kuyusu ile tepside kapaksız olarak ayarlayın. Dokunmatik yüzeyi kullanarak tepsiyi kapatın ve üst menüdeki yeşil okuma düğmesine tıklayın.
Fagositoz testini yapmak için, görüntüleme ortamının 750 mikrolitresi ile ilk deneysel kuyuyu durulamadan sonra, kalan kuyuları büyüme ortamında bırakarak Zymosan süspansiyonunun 400 mikrolitresini ekleyin. Ardından, slaydı görüntüleme sisteminin inkübe edilmiş aşamasına yerleştirin. Görüntüleme yazılımını kullanın.
Bul sekmesinin altındaki Brightfield seçeneğini belirleyin ve göz merceği simgesine tıklayın. 10X hedefiyle, hücrelere odaklanmak için göz merceği ve odaklama düğmesini kullanın. Edinme sekmesini seçin.
Deneme açılır menüsünü açın ve pH'a duyarlı boyanın 509 nanometresini ekscitasyon ve 533 nanometre emisyon dalga boylarını barındıracak EGFP filtre setini içeren bir dalga boyları kümesi seçin. Zamanlayıcıda yaklaşık iki dakika kaldığında, hedefi 20X olarak değiştirmek için nesnel menüdeki 20X simgesine tıklayın, ardından kanallar menüsüne tıklayın, EGFP filtrelerini seçin ve pozlama menüsünde pH'a duyarlı yeşil floroforu tespit etmek için pozlama süresini 400 milisaniye olarak ayarlayın ve ardından canlı yayına tıklayın. Odağı ayarladıktan sonra, ışığı kapatmak için dur'a tıklayın ve üst zaman atlamalı deneysel ayarın yanındaki kutuyu işaretleyin.
Odaklama stratejisi menüsünde, yazılım otomatik odaklama'yı seçin ve açılır menüden, otomatik odaklama çalışırken ışığa maruz kalma süresini azaltmak için akıllı ve çekirdek ayarları seçin. Zaman atlamalı menüde, istenen alım sayısını 30 ila 60, aralık süresini bir dakika olarak ayarlayın ve ardından edinmeye başlamak için denemeyi başlat düğmesine tıklayın. Interferon gamanın ortak kültür üzerindeki etkisi incelenmiştir.
Temsili sonuçlar, makrofajların mezenkimal kök hücrelerle ortak kültürünün makrofajın fagositik aktivitesini artırdığını göstermektedir. Interferon gama tedavisi makrofajın aktivitesini azaltır. Ancak mezenkimal kök hücrelerin varlığında makrofaj fagositik aktivitesi kısmen kurtarıldı.
Bu çalışmalarda optimal hücre yoğunlukları kritik öneme sahiptir. Makrofaj hücreleri çok düşük yoğunlukta kaplandığında floresan yoğunluğunda değişiklikler tespit edildi. Makrofaj hücreleri yüksek yoğunlukta kaplandığında, floresan yoğunluğu tüm gruplarda hızla yükselmiş ve farklılıklar farkedilmemektedir.
Bu işlem sırasında en önemli şeylerden biri, hücre yoğunluklarının optimize edilmesini ve deneyler arasında tutarlı tutulmasını sağlamaktır.
