Çocuklar, benim adım Wang Yangdong ve Westlake Üniversitesi'ndeki Dr. Kiryl Piatkevich moleküler biyo-mühendislik laboratuvarından geliyorum. Bugün size hipokampüsün nöronal aktivitelerini farelerde, in vivo'da görüntüleme prosedürünü göstereceğim. Kaynak makinesini açın ve gerekli sıcaklığa kadar ısıtın.
Şekil olarak gösterildiği gibi yardım eden eller kullanarak görüntüleme kolayının ve enjeksiyon kolayının konumunu ayarlayın. Şırıngayı iğne ile kullanarak, görüntüleme ve enjekte kanülleri arasındaki bağlantı noktalarına beş saniye boyunca az miktarda uygun akı uygulayın ve ardından damlacığı çıkarın. Lehim tenekesini monte edin ve akı ile tedavi edilen bağlantı noktasına uygulayın.
Ameliyat sırasında yapılması gereksiz daha büyük kranial gerektireceğinden aşırı lehim tenekesi kaçının. Lehim tenekesi soğumasını bekleyin. Genellikle birkaç saniye sürer.
Her iki yönden de kukla canül takılarak enjeksiyon kolayın engellenmediğini onaylayın. Bir kürdan veya 26 kalibrelik şırınga iğnesi kullanarak görüntüleme kanüllerinin alt tarafına UV kürleme optik yapıştırıcı uygulayın. Görüntüleme canülüne karşılık gelen boyutta bir kapak camını dikkatlice yerleştirmek için ince bir cımbız kullanın.
Yapıştırıcıyı standart bir el UV lambasından UV aydınlatma ile en az bir saat boyunca iyileştirin. IACUC onaylı prosedüre göre fareyi izofluran ile uyuşturun. Fareyi bir ameliyat ısıtma yastığının üzerine stereotaksik bir çerçeveye yerleştirin.
Başı kulak çubuklarıyla sabitleyin. Başın sıkıca sabit olduğundan emin olmak için başı her yöne hafifçe itin. Ameliyat sırasında hayvanın gözlerinin kurumasını önlemek için göz merhemi uygulayın.
Kürkü boynun arkasından gözlere kadar çıkarmak için bir düzeltici veya depilatör krem kullanın. Kesi yapmadan önce cerrahi bölgeyi betadin ve ardından %70 etanol ile üç kez sterilize edin. Kafa tabanının her yerinde yatay kesimden başlayarak kafatasının üstündeki deriyi çıkarın, ardından rostral yönde iki kesik, neredeyse göz kapaklarına ulaşır.
Sonra orta çizgide birleşen iki eğik kesik. İki steril pamuklu çubukla, bağlantı dokusunu ve boynun arkasının kafatasının kenarlarına kaslarını geri çek. Aşırı ağrıyı önlemek için periosteumun yüzeyine iki dakika boyunca bir damla lidokin çözeltisi uygulayın.
Kuru ve pürüzlü bir yüzey oluşturmak için kafatasının tüm açık alanını bir neşterle hafifçe kazıyın. Kafa konumunun dikey olduğunu onaylamak için AP koordinatının sıfır olup olmadığını ve ml koordinatının sıfır olup olmadığını görmek için iğnenin ucunu Lambda'ya yerleştirin. Değilse, AP ve ML koordinatları 0,1 milimetre içinde olana kadar stereotaksik istasyondaki muhabir düğmelerini ayarlayın.
Kraniyotomi için karşılık gelen noktaları bulmak için iğnenin ucunu hareket ettinin ve ince bir işaretleyici kullanarak kafatasındaki konumlarını işaretleyin. Dört işaretli noktaya ve dairenin cannula tarafındaki enjeksiyon cannula alanının ana hatlarına göre bir daire çizin. Kafatasında işaretlenmiş anahat boyunca hafifçe delmek için dakikada 10.000 mermi hızında bir pnömatik matkap kullanın.
Kafatasını, genellikle merkezde hafif bir dokunuşla hareket etmeye başlayan çok ince bir kemik tabakası kalana kadar delin. Kraniyotomi merkezine bir damla steril PBS uygulayın. Kemik kapağını kafatasından çok ince uçlu uzun uçlu uzun uçlu veya karşı taraflardan yaklaşan iki 26'lı iğne ile kaldırın.
Dura yüzeyini temizlemek için 26 kalibrelik künt bir iğneden pbs ve ardından hafif aspirasyonlar uygulayın. Korteksin yanı sıra hipokampüsün üzerindeki Corpus Callosum'u emmek için nazik emiş uygulayın. Korteks genellikle Corpus Callosum'dan daha sarıdır.
Ve Corpus Callosum genellikle hipokampustan daha geniştir. Ayrıca, Corpus Callosum'u yukarıdan gözlemlendiğinde dikey ve yatay yönlere giden nöronal liflerle ayırt etmek gerçekten kolaydır. Bu noktada kanama kraniyotomide beyin dokusunun görünürlüğünü etkileyecektir.
PBS uygulayın, ardından hafif emiş uygulayın, kandan kurtulmak için korteksi arzularken, Corpus Callosum şemada şematik olarak gösterildiği gibi beyaz liflerin yönü ile tanınabilir. Corpus Callosum liflerini dairesel bir hareketle hafif emiş uygulayarak katman katman çıkarın. PBS, maruz kalan beyin dokusunun üzerinde biriken kanlardan kurtulmak için sürekli olarak uygulanır.
İmplantı kraniyotomi içine hafifçe yerleştirin. İmplantın optik penceresini hipokampüsün maruz kalan yüzeyine mümkün olduğunca yakın konumlandırmak için L şeklindeki iğne ile implantın üzerine sıkıca bastırın. İmplant etrafındaki yara izine tekrar tekrar PBS uygulayın, ardından implant yerleştirilmesi sırasında kanı mümkün olduğunca çıkarmak için emme uygulayın.
Diş çimentosunun kafatasının altına nüfuz etmesini önlemek için implant ve kafatası arasına ince bir hızlı conta tabakası uygulayın. Hızlı conta iyileştikten sonra, kafatasının yüzeyine, hızlı contanın yüzeyine ve implantın yüzeyine eşit olarak süper bağ uygulayın. Süper bağ iyileştikten sonra, ameliyatın başında yapılan kesi etrafındaki cildin yanı sıra süper bağın üzerine protez bazlı reçine uygulayın.
Protez tabanı reçinesi iyileştikten sonra kafa plakasını implantın etrafındaki reçinenin üzerine yerleştirin ve görüntüleme kanı ile konsantre olmasını sağlamak. Konumunu sabitlemek için kafa plakasının etrafına ve üstüne daha fazla protez taban reçinesi uygulayın. Birkaç dakika tedaviye bırakın.
Görüntüleme penceresine daha iyi erişimin objektif mercek olmasını sağlamak için canül etrafında kalın bir çimento tabakası oluşturmaktan kaçının. Viskozitesini azaltmak için protez taban reçinesini seyreltin, böylece ulaşılması zor olan boşlukları bir aplikatörle doldurmasını sağlar. Pencereyi hayvan bantlamadan olası kirlenmeye karşı korumak için pencerenin üzerine yavaşça yalıtımlı bir kauçuk bant yerleştirin.
Virüs çözeltisine Hızlı Yeşil boya stok çözeltisi ekleyin, bir PCR tüpünde bir ila dokuz oranında istenen titreye seyreltin. Virüs çözeltisinin 600 nano litresini çekin, kukla kanülünü çıkarın ve iç kanülleri enjeksiyon şırıncığına kılavuz kanüle bağlayın. Virüsü dakikada 15 nano litre hızında, toplamda 10 dakika boyunca demleyin.
Virüsün pencerenin altına yayılması için iç canülleri 10 dakika bağlı tutun. İç canülleri kılavuz canülden hafifçe çıkarın ve kukla canül ile yeniden yakalayın. Fareyi birkaç dakika boyunca% 4 izofluran ile teşvik edin.
Kafa plakasını kafa çatalı üzerine sabitleyin ve sonra kafa çatalını koşu bandına sabitleyin. İşlevsel görüntüleme için görünümü filtrelemek için en iyisini bulmak için düşük büyütme nesnel lensi kullanın. Ardından, nöronal aktiviteleri tek hücre çözünürlüğünde kaydetmek için daha yüksek objektif bir lense geçin.
Kalsiyum görüntüleme için yeşil floresan, standart bir GFP filtre duyusu kullanılarak piyasada bulunan 470 nanometre LED ile heyecanlandı. Floresan izler elde etmek için, nöronal hücre kütlesine karşılık gelen ilgi alanları manuel olarak segmentlere ayrılmıştır ve ImageJ yazılımı tarafından analiz edilmiştir. 40 X lens optik voltaj kaydı kullanılarak gerilim görüntüleme için yakın kızılötesi kanalda 830 Hertz alım oranlarında gerçekleştirildi.
Spontan sinirsel aktivite kaydı 25.000 kareye kadar sürekli olarak sürdü. Burada, hipokampüsün farelerde A1 bölgesi olarak uzun süreli görüntülenmesi için bir yöntem tarif ediyoruz. Yöntem kronik implantasyona dayanmaktadır.
Şimdi, virüslerin veya ilaçların doğrudan ilgi çekici nöronlara hedefli bir şekilde yönetilmesini sağlayan özel yapım görüntüleme penceresi. Açıklanan protokolün, basit ve uygun fiyatlı 1 foton görüntüleme kurulumları kullanarak farelerin hipokampusunda yüksek mekansal zamansal çözünürlükle nöronal aktiviteyi araştırmayı amaçlayan çalışmaları kolaylaştıracağına inanıyoruz.
