يا رفاق، اسمي وانغ يانغدونغ، وأنا من مختبر الدكتور كيريل بياتكيفيتش للهندسة الحيوية الجزيئية في جامعة ويستليك. اليوم، سأريك الإجراء لتصوير أنشطة الخلايا العصبية من قرن آمون في الفئران، في الجسم الحي. قم بتشغيل آلة اللحام وسخنيها إلى درجة الحرارة المطلوبة.
ضبط موقف قنية التصوير وقنية الحقن باستخدام يد العون كما هو مبين في الشكل. باستخدام الحقنة مع الإبرة، وتطبيق كمية صغيرة من النوع المناسب من تدفق على البقع اتصال بين التصوير وحقن القنية لمدة خمس ثوان، ومن ثم إزالة القطيرات. جبل لحام القصدير وتطبيقه على بقعة اتصال تعامل مع تدفق.
تجنب زيادة القصدير لحام لأنها سوف تتطلب أكبر الجمجمة لا لزوم لها لجعل أثناء الجراحة. انتظر القصدير لحام لتهدئة. عادة، يستغرق عدة ثوان.
تأكد من عدم حظر قنية الحقن عن طريق إدخال القنية الوهمية من كلا الاتجاهين. تطبيق الأشعة فوق البنفسجية علاج لاصق بصري على الجانب السفلي من قنية التصوير باستخدام مسواك أو إبرة حقنة قياس 26. استخدام ملاقط غرامة لوضع بعناية غطاء الزجاج من حجم المقابلة لقنية التصوير.
علاج لاصق لمدة ساعة على الأقل عن طريق إضاءة الأشعة فوق البنفسجية من مصباح الأشعة فوق البنفسجية المحمولة القياسية. تخدير الماوس مع isoflurane وفقا للإجراءات المعتمدة IACUC. ضع الماوس في إطار ستيريوتاكسيك على لوحة التدفئة الجراحة.
قم بتأمين الرأس بقضبان الأذن. دفع الرأس قليلا في جميع الاتجاهات للتأكد من تأمين الرأس بحزم. ضعي مرهم العين لمنع جفاف عيون الحيوان أثناء الجراحة.
استخدم كريم التشذيب أو مزيل الشعر لإزالة الفراء من الجزء الخلفي من الرقبة حتى العينين. تعقيم الموقع الجراحي مع بيتادين تليها 70٪ الإيثانول ثلاث مرات قبل إجراء شق. إزالة الجلد على الجزء العلوي من الجمجمة، بدءا من قطع الأفقي في جميع أنحاء قاعدة الرأس، تليها قطعتين في الاتجاه الوردي، والوصول تقريبا الجفون.
ثم اثنين من التخفيضات المائلة التي تتلاقى في منتصف الخط. مع مسحتين من القطن المعقم ، تراجع عن النسيج الرابط ، وكذلك عضلات الجزء الخلفي من الرقبة إلى حواف الجمجمة. تطبيق قطرة من محلول الليدوكائين على سطح periosteum لمدة دقيقتين لتجنب الألم المفرط.
كشط بلطف كامل المنطقة المكشوفة من الجمجمة مع مشرط لخلق سطح جاف وخام. ضع طرف الإبرة على لامبدا لمعرفة ما إذا كان تنسيق AP صفرا لتأكيد أن موضع الرأس عمودي ، وكذلك إذا كان تنسيق ML صفرا ، لتأكيد وضع الرأس أفقيا. إذا لم يكن الأمر كذلك، قم بضبط مقابض المراسل على المحطة المجسمة حتى تكون إحداثيات AP و ML على حد سواء ضمن 0.1 ملليمتر.
تحريك غيض من الإبرة للعثور على النقاط المقابلة لاستئصال القحف ووضع علامة على مواقفها على الجمجمة، وذلك باستخدام علامة غرامة. رسم دائرة على أساس أربع نقاط ملحوظ، فضلا عن الخطوط العريضة لمنطقة قنية الحقن على الجانب القنية من الدائرة. استخدم مثقاب هوائي بسرعة 10,000 طلقة في الدقيقة للحفر برفق على طول المخطط المحدد على الجمجمة.
حفر الجمجمة حتى يتم ترك طبقة رقيقة جدا من العظام، والتي عادة ما يبدأ في تذبذب تحت لمسة لطيف في المركز. تطبيق قطرة من برنامج تلفزيوني عقيمة إلى مركز استئصال القحف. رفع رفرف العظام من الجمجمة مع ملقط يميل رقيقة جدا أو اثنين من الإبر قياس 26 تقترب منه من الجانبين المعاكس.
تطبيق برنامج تلفزيوني تليها تطلعات لطيف، من خلال إبرة قياس 26 حادة عدة مرات لتنظيف سطح دورا. تطبيق شفط لطيف ل ablate القشرة وكذلك كالوسوم كوربوس فوق قرن آمون. القشرة غالبا ما تكون أكثر اصفرارا من كوربوس كالوسوم.
و(كوربوس كالوسوم) عادة ما يكون أوسع من قرن آمون الى جانب ذلك ، فإن كوربوس كالوسوم من السهل حقا التمييز بين الألياف العصبية تسير في الاتجاهات الرأسية والأفقية عند ملاحظتها من الأعلى. النزيف في هذه المرحلة سيؤثر على رؤية أنسجة الدماغ في عملية استئصال القحف.
تطبيق برنامج تلفزيوني، تليها شفط لطيف، بينما كنت سبيرينج القشرة للتخلص من الدم، يمكن التعرف على كوربوس كالوسوم من خلال اتجاه الألياف البيضاء كما هو مبين تخطيطيا في الرسم البياني. إزالة الألياف كالوسوم كوربوس طبقة طبقة عن طريق تطبيق شفط لطيف في حركة دائرية. يتم تطبيق برنامج تلفزيوني باستمرار للتخلص من تراكم الدم فوق أنسجة الدماغ المكشوفة.
أدخل الغرسة برفق في عملية استئصال القحف. اضغط بقوة على رأس الغرسة مع إبرة على شكل حرف L لوضع النافذة البصرية للزرع في أقرب وقت ممكن إلى السطح المكشوف من قرن آمون. تطبيق برنامج تلفزيوني مرارا وتكرارا على ندبة حول زرع، تليها شفط لإزالة الدم قدر الإمكان أثناء زرع الإدراج.
ضعي طبقة رقيقة من الفقمة السريعة بين الغرسة والجمجمة لمنع أسمنت الأسنان من الاختراق تحت الجمجمة. بمجرد شفاء الختم السريع ، ضع رابطة فائقة بالتساوي على سطح الجمجمة وسطح الختم السريع وسطح الغرسة. مرة واحدة يتم علاج السندات السوبر، وتطبيق الراتنج قاعدة طقم الأسنان فوق السندات السوبر، فضلا عن الجلد حول شق المحرز في بداية الجراحة.
بعد علاج راتنج قاعدة طقم الأسنان ، ضع لوحة الرأس على الراتنج حول الغرسة وجعلها تركز مع قنية التصوير. تطبيق المزيد من الراتنج قاعدة طقم الأسنان حول وفوق لوحة الرأس لإصلاح موقفها. دعه يشفي لعدة دقائق.
تجنب بناء طبقة سميكة من الاسمنت حول القنية لضمان وصول أفضل إلى نافذة التصوير هو العدسة الهدف. تمييع الراتنج قاعدة طقم الأسنان لتقليل لزوجته، مما يسمح لها لملء التجاويف التي يصعب الوصول إليها مع قضيب. ضع شريط مطاطي معزول بلطف فوق النافذة لحماية النافذة من التلوث المحتمل من النطاقات الحيوانية.
إضافة سريع الأخضر صبغ الأسهم حل حل الفيروس تمييعه إلى titer المطلوب في نسبة 1-9، في أنبوب PCR. سحب 600 نانو لتر من محلول الفيروس، وإزالة قنية وهمية وإدراج القنية الداخلية توصيله إلى حقنة الحقن في قنية دليل. غرس الفيروس بسرعة 15 نانو لتر في الدقيقة الواحدة، لمدة 10 دقائق في المجموع.
الحفاظ على القنية الداخلية متصلة لمدة 10 دقائق للسماح للفيروس بالانتشار تحت النافذة. إزالة بلطف القنية الداخلية من قنية دليل وتلخيص ذلك مع قنية وهمية. حث الماوس مع 4٪ isoflurane لبضع دقائق.
إصلاح لوحة الرأس إلى شوكة الرأس، ومن ثم إصلاح شوكة الرأس إلى حلقة مفرغة. استخدم عدسة موضوعية منخفضة التكبير للعثور على أفضل عرض لتصفية التصوير الوظيفي. ثم، قم بالتبديل إلى عدسة موضوعية أعلى لتسجيل الأنشطة العصبية بدقة خلية واحدة.
لتصوير الكالسيوم، كان الفلورسنت الأخضر متحمسا من خلال 470 نانومتر LED متوفر تجاريا باستخدام إحساس فلتر GFP قياسي. للحصول على آثار الفلورسنت، تم تقسيم المناطق ذات الاهتمامات، المقابلة لكتلة الخلايا العصبية يدويا وتحليلها من قبل برنامج ImageJ. لتصوير الجهد باستخدام 40 X عدسة تسجيلات الجهد البصري تم تنفيذها في قناة الأشعة تحت الحمراء القريبة في 830 معدلات اكتساب هيرتز.
استمر تسجيل النشاط العصبي التلقائي بشكل مستمر لمدة تصل إلى 25,000 إطار. هنا، ونحن نصف طريقة للتصوير على المدى الطويل من قرن آمون كمنطقة A1 في سلوك الفئران. وتستند هذه الطريقة على زرع المزمن.
الآن نافذة التصوير حسب الطلب ، والتي تمكن أيضا الإدارة المستهدفة للفيروسات أو الأدوية مباشرة إلى الخلايا العصبية ذات الاهتمام. ونحن نعتقد أن البروتوكول الموصوف سيسهل الدراسات التي تهدف إلى التحقيق في نشاط الخلايا العصبية مع ارتفاع الدقة الزمنية المكانية في قرن آمون من الفئران behaving باستخدام بسيطة وبأسعار معقولة 1 فوتون التصوير المنبثقة.
