Sistematik puanlama analizi, mukozal hasarı değerlendirmek, eğitimli araştırmacılar tarafından yapılabilen histolojik yorumlamayı kolaylaştırmak için kullanılan bir tekniktir. Bu yöntemin ana avantajları ücretsiz ve kullanımı kolay olmasıdır. Kolitli farelerin bağırsaklarından elde edilen histolojik verilerin nicel analizine izin verir.
Bu protokol, farklı genetik geçmişlere sahip hayvanlardan gelen hastalıkları karşılaştırmak için gerekli olan tüm kolonun hastalık şiddetini yorumlamak için hızlı ve tekrarlanabilir bir yol sağlar. Doku hazırlığı için tüm reaktifleri ve malzemeleri düzenlemek önemlidir. Ötenazili bir fareyi bir diseksiyon pedi üzerine supine pozisyonunda yerleştirerek başlayın ve 20 ölçer 1,5 inç iğneler kullanarak fare ekstremitelerini hareketsiz hale getirin.
Önseçim ve makas kullanarak karın derisinde küçük bir kesi yapın ve peritona maruz bırakmak için yana çekin, ardından kasık kemiğinden karın kenarlarına kadar peritonda orta çizgi kesi ile karın boşluğunu açın. Kalın bağırsak görselleşene kadar dokuları ve organları dikkatlice çıkarın. Organı tamamen görselleştirmek için kolonun her iki tarafındaki pelvik kemiği kesin, anüsten cecum'a doğru uzanın.
Organı dikkatlice parçalarken kolona bağlı yağları, küçük damarları ve arterleri yavaşça çıkarın, anüse sadece proksimal ve obtal olarak kesin. Anüsten yerleştirilmiş esnek bir plastik gavage iğnesi kullanarak dışkı içeriğini çıkarmak için kolonu PBS ile dikkatlice yıkayın. Kolonu düz bir çizgiye yerleştirin ve mezenterik arter boyunca uzunlamasına açın.
Kolonu distalden proksimal uca kadar uzunlamasına ikiye ayırın. Dokunun yarısını histolojik analiz için, diğer yarısını batı lekesi, PCR için kullanın veya taze dondurulmuş immünofluoresans mikroskopisi için ikinci bir İsviçre rulosuna yuvarlanın. Tüm kolonun uzunluğu boyunca yaklaşık aynı genişlik elde edilene kadar proksimal kolondan ekstra dokuyu jiletle kesin.
Lümeni açığa çıkarmak için kolonu hizalayın ve esnek bir gavage iğnesi kullanarak dokuyu tamamen düzleştirin. İşlem boyunca dokuyu nemli tutmak için gerekirse daha fazla PBS ekleyin. Kağıt mendili kullanarak fazla PBS'yi çıkarın.
Bir şırınga ve gavage iğnesi ile, dokuyu sabitlemek ve düzleştirmek için iki ila üç dakika boyunca% 10 nötr tamponlu formalin çözeltisi ekleyin, ardından distal kolonun ucunun ucunun tutun ve kolonu distalden proksimal uca eşmerkezli dairelere bükmek için düz forseps kullanın. Kolonu ortaya sabitlemek ve İsviçre rulo şeklini tutmak için 27 kalibrelik bir iğne yerleştirin, ardından İsviçre rulosunu kasete paralel olarak dokuyu yönlendiren histolojik bir örnek kabın içine gömme bir kasete yerleştirin. Dokuyu dört santigrat derecede bir gecede %10 nötr tamponlanmış formalin çözeltisinde sabitle.
Gece sabitlemeden sonra, dokuyu PBS ile üç kez yıkayın. Parafin gömme işleminden önce% 70 etanol ekleyin ve devam etmeden önce iğneyi İsviçre rulosundan çıkarın. Doku, parafin katıştırana kadar oda sıcaklığında etanolde saklanabilir.
Taranan görüntüleri görüntü işleme yazılımında açtıktan sonra, iki nokta üst üste işaretinin tamamının görünür olduğunu ve numunenin eksik alanlarının olmadığını doğrulayın. Etiket görüntüleyiiciyi tıklatarak taranan slaytları düzgün bir şekilde tanımlamak için etiket görüntüleyicİsini ve ölçek çubuğu araçlarını etkinleştirin. Ek açıklamalar aracını ek açıklamaları tıklatarak açın ve İsviçre rulosunun toplam uzunluğunu, iltihaplanmayı veya yaralanmayı ve erozyon veya ülserasyonu ölçmek için yeni katmanı tıklatarak üç farklı katman oluşturun.
Katman rengini tıklatarak her katman için farklı bir renk seçin. Kas mukozasını izleyen bir çizgi çizmek için kalem aracını tıklatarak, analiz için bitişik alanı görselleştirmek için işaretçiyi gerektiği gibi hareket ettirerek her katmanın veya kategorinin uzunluğunu ölçün. Muscularis mukozasının yeterli görselleştirilmesini kolaylaştırmak için görüntüyü 400 mikrometre yakınlaştırmada görüntüleyin.
Kalem her durdurulduğunda, küçük bir yeni katman bölgesi oluşturulur. Katman bölgeleri sekmesiyle görselleştirilebilir ve düzenlenebilir. Referans olarak kas mukozası kullanılarak ölçülen toplam uzunluğu, iltihabı veya yaralanmayı ve erozyon veya ülserasyonu gözden geçirin.
Tüm katmanlar tanımlandıktan sonra, katman bölgeleri seçeneklerinin içindeki metin dosyasına dışa aktarma kılavuzını kullanarak verileri dışa aktarın. Metin dosyalarını açın ve verileri bir elektronik tablo yazılımına kopyalayın. Her bölgedeki tüm segmentleri toplayın ve toplam uzunluğa göre yaralanma ve ülserasyon yüzdesini hesaplayın.
Histolojik kolit skorunu hesaplamak ve hastalığın şiddetini değerlendirmek için üç ana özelliği göz önünde bulundurun. Kripto luminal eksendeki organize epitel hücreleri, az sayıda bağışıklık hücresine sahip lamina propria ve subjacent muscularis mukozası ile karakterize sağlıklı bağırsak mukozasını kontrol edin. Daha sonra, zayıflatılmış veya kısmen eksik epitel hücreleri ve kriptolara nötrofil infiltrasyonlu mukozal inflamasyon ile karakterize edilen iltihap veya yaralanma olup olmadığını kontrol edin.
Son olarak, yüzey epitelden yoksun alanlar veya ilişkili lökositler ile veya ilişkili lökositler olmadan epitel mahzenlerinden tamamen yoksun alanlarla karakterize edilen erozyon veya ülserasyon varlığını kontrol edin. Bu histolojik kolit skor analizinin mukozal hasar bağlamında güvenilirliğini göstermek için, sekiz C57BL6 yabani tip farenin içme suyunda beş gün boyunca% 2.5 DSS uygulandı ve ardından beş gün boyunca düzenli su ile bir geri kazanım süresi uygulandı. DSS'nin akut yönetimi sırasında vücut ağırlığı sabit kaldı, ancak fareler düzenli musluk suyu içmeye başladığında önemli ölçüde azaldı.
Kan ve yumuşak dışkı üç günlük DSS yönetiminden sonra ortaya çıktı ve deneyin sekizinci gününe kadar devam etti. Bu gözlemler, DSS'ye maruz kalmanın en zararlı etkilerinin beş ila sekiz gün arasındaki iyileşme döneminde gözlendiğini ileri sürmektedir. 10. günde kolon uzunluğunun ölçümü, deneyin sonunda önemli bir kısalma olduğunu doğruladı.
Kolonlar sıfır, iki, beş, yedi, sekiz ve 10 günde parafin İsviçre ruloları yapmak için hasat edildi. Doku H&E ile boyandı ve histolojik kolit skoru ile yaralanma ve ülserasyon yüzdesini hesaplamak için yüksek çözünürlüklü taramalar analiz edildi. Tedavi edilmeyen farelerde normal mahzen mimarisi gözlendi.
İki günlük DSS yönetiminden sonra bağışıklık hücresi alımı gözlendi. Beşinci günde, epitel hücreleri hasarlı görünür ve epitel yaralanması ile ilişkili epitel boyunca nötrofillerin sızması vardı. Beşinci günden sekize kadar iltihaplanma ve ülserasyon ile epitel kaybı bölgeleri gözlendi.
10. günde, epitel hücreleri ülserli bölgeleri yenilemeye ve yeniden doldurmaya başladı ve kolonik mukozayı yavaşça geri yükledi. Bu protokolü denerken, düzgün yönlendirilmiş ve iyi korunmuş bir İsviçre rulosu oluşturmak ve mukozal inflamasyonu veya yaralanmayı ve ülserasyon veya erozyonu doğru bir şekilde tanımlamak önemlidir. Bu yöntem, TMS veya T hücre transfer modeli gibi diğer kolit modellerinde kolonik mukozanın tüm uzunluğu boyunca yaralanmayı nicel olarak değerlendirmek için kullanılabilir.
