Bu yöntem ülseratif kolit ve Crohn hastalığı hakkında inflamatuar biyohastalık alanında anahtar sorulara cevap yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, sinyal proteinlerinin ilk anti ve proinfamtory etkilerini değerlendirmek için kullanılabilmesidir. Bu tekniğin etkisi yeni gelişmeler ve inflamasyon gaz anketi uzanır.
Bu yöntem bağırsak iltihabı üzerinde genetik etkisi içine anlayışlar sağlayabilir rağmen. Ayrıca diyetler ve mikrobiyom gibi diğer faktörlere uygulanabilir. Genellikle, bu dönem için yeni bireyler hastalık skar dokusu işleme zor olduğu için mücadele edecek.
Diseksiyon ve doku hazırlama adımları öğrenmek zor çünkü mistalia ve hücre dokusu yapıları değiştirilebilir bu yöntemin görsel gösteri önemlidir. Dekstran sülfat sodyum veya DDS kolit indüklemek için, düzenli içme suyu yerine 3%DSS çözeltisi, yedi gün boyunca lityum ekleyin. Her farenin gövde ağırlığının ölçülmesi, DSS çözüm tüketimi ve günlük dışkı üretimi.
Yedi günlük tedavinin sonunda, fareyi supine pozisyonuna yerleştirin ve karında üç santimetre uzunluğunda orta hat kesisi yapmak için küçük makas kullanın. Hasat dalak ve boyutunu ölçmek. Sonra çevreleyen mezenter ayrılmasıiçin kolon kaldırmak için forseps kullanın.
Ve çekum ve rektum görünür olana kadar tüm kolon ayıklayın. Kolonya kenarboşluğundaki dokuyu taşın. Ve proksimal ve distal kolon serbest pelvis içinde derin, sırasıyla.
İzole edilmiş kolon uzunluğunu ölçün ve kaydedin. Ve illuate temize kadar dışkı ve kan kaldırmak için buz soğuk PBS 10 mililitre ile kolon floş bir gavaj iğnesi ile donatılmış bir 10 mililitreşli şırınga kullanın. Histolojik tanımlama için doku örneklerini eşit büyüklükte proksimal, orta ve distal kesitlere bölün.
Ve bir gecede 4 derece paraformaldehitteki dokuları 4 dereceye kadar düzeltin. İzole kolon dokusunun hematoksilin ve eozin boyama için, ertesi sabah, örneklerin kriyo koruması için tek tek 15 mililitretüplerde bir gecede% 30 sakaroz ve PBS doku parçaları batırın. Ertesi gün, en iyi kesme sıcaklığı veya OCT bileşik dokuları gömmek.
Ve OKT sertleşene kadar eksi 20 santigrat derecede dokuları soğutun. OCT bloklarını kriyostat'a yerleştirin ve kalınlık kadranını 12 mikrometreye ayarlayın. Daha sonra cam mikroskop slaytlar üzerine 12 mikrometre kalınlığında dondurulmuş bölümleri dilimleyin ve toplayın.
Tüm dokular kesitli olduğunda, 20 dakika boyunca bir sıcak tabakta 65 santigrat derece slaytlar ısıtın. Isıtılan bölümleri hematoksilin boyama solüsyonu ile beş dakika boyamadan önce distile suda kısa bir süre yıkayın. Fazla hematoksilin çözeltisini çıkarın ve musluk suyunda beş dakika çalıştırın.
Ve 30 saniye boyunca etanol% 0.5 hidroklorik asit ile bölümleri ayırt, çalışan musluk suyu altında bir dakika durulayın takip. Ardından, pbs bir dakika boyunca örnekleri yıkayın. Ardından, akan musluk suyunun altında beş dakika daha yıkanır.
Yıkamanın sonunda, dokuları artan bir etanol serisinde daldırma başına 10 saniye batırın. Ardından iki dakika boyunca eozinle lekelenme. Örneklerin dehidratasyonu için, slaytları %95 etanol ve iki değişiklik %100 etanolde daldırma başına beş dakika batırın.
Ardından iki, beş dakikalık ksilen değişiklikleri ile takas. Daha sonra her deney grubunun proksimal, orta ve distal kolon doku hasarı puan. İmmünohistokimyasal analiz için, bölümleri sıcak tabakta 20 dakika ısıttınca, slaytları PBS'de üç kez yıkama başına 10 dakika yıkayın.
Ve 10 dakika% 3 hidrojen peroksit kuluçka ile endojen peroksidaz ortadan kaldırmak. Kuluçka sonunda, numuneleri gösterildiği gibi PBS'de üç kez yıkayın ve oda sıcaklığında en az bir saat boyunca tamponu bloke ederek spesifik olmayan herhangi bir bağlamayı engelleyin. Ardından, engelleme tamponu ile birincil antikor kokteylini değiştirin.
4 santigrat derecede bir gecede kuluçka için. Ertesi sabah, aşırı primer antikor çözeltisi aspire ve PBS üç kez slaytlar yıkayın. Son yıkamadan sonra, uygun biyotinylated ikincil antikor kokteyli ile slaytlar inkübün.
Oda sıcaklığında streptavidin horseradish peroksidaz kompleksi ile etiketleme izledi. İmmünoreaktif hücreleri görselleştirmek için, açık veya koyu kahverengi renk gelişene kadar örnekleri DAB ile etiketleyin. Ve hematoksilin ve% 0.3 seyreltilmiş amonya ile kesitler karşı leke.
Slaytlar kuruduğunda, 10x büyütme altında doku bölümlerinin parlak alan görüntülerini elde etmek için bir ışık mikroskobu kullanın. Ve epitel ve lamina propria hem de işaretli bağışıklık hücrelerinin popülasyonu tanımlamak ve ölçmek için bir görüntü işleme programı kullanın. DSS tedavi kolonlarda gen ekspresyonu analizi için, standart RNA ekstraksiyon protokollerine göre eksi 80 santigrat derece çözülmüş kolon doku örneklerinden RNA ayıklayın.
Ve 20 milimolar oligo deoksitimidin 12 ile 18 astar ve moloney murine lösemi virüsü ters transkriptaz bir mikrolitre 2.5 mikrolitre ile toplam RNA ile bir mikrogram karıştırın. 42 santigrat derecede 60 dakikalık bir kuluçkadan sonra, cDNA'nın bir mikrolitresini, ilgi nin sitokineleri ve 2x floresan yeşil boya için uygun ileri ve ters nicel PCR astarlarının %0,5 mikrolitresiyle karıştırın. Daha sonra nicel PCR'yi uygun parametreler altında çalıştırın ve göreli gen ekspresyonunu standart protokollere göre hesaplayın.
Wildtype fareler ile karşılaştırıldığında, alfa gustducin nakavt fareler aşırı kilo kaybı ile daha şiddetli bir kolit sergilemek, ishal ve bağırsak kanaması. DSS uygulamasından yedi gün sonra, kolon bölümlerinin histolojik analizi nakavt farelerin proksimal, orta ve distal kolonlarında yabani tip benzerlerine göre daha ağırlaştırılmış doku hasarı ortaya koymaktadır. Bu aşırı immün aktivasyon immünohistokimyasal analiz ile gözlenen nakavt hayvan kolon çeşitli inflamatuar hücrelerin sağlam bir infiltrasyon ile kolit indüksiyon yol açar.
Ayrıca, kantitatif PCR analizi TGF beta bir ekspresyon hiçbir fark ile wildtype fare kolonları ile karşılaştırıldığında, eleme de, TNF alfa ve inferon gama ekspresyonu daha yüksek düzeyde gösterir ama IL-5, 10 ve 13 daha düşük ifade gösterir. Bu prosedürü çalışırken, bu metin southvater sodyum dozajı ve gösteri süresi optimize etmek için hatırlamak önemlidir. Bu prosedürü niçin iletme, bağırsak dokusu kaynaklı iltihabın etkisi gibi ek soruları anlamak için kültür edinme gibi başka bir yöntem de uygulanabilmekte.
Bu teknik, geliştirilmeden sonra, bağırsak iltihabı alanında araştırmacılar ın gen mutasyonlarının biyohastalık erozyonlarının ve diğer omurgalıların şiddetine olan katkılarını keşfetmelerinin bir yolunu aramaktadır. Hastalık bağırsak dokusu ve içeriği ile çalışan son derece tehlikeli olabilir ve uygun şeyler giyen gibi yankıları unutmayın, kişisel koruma kalıcı bu işlemi yaparken her zaman alınmalıdır.
