Yazar Bhagawat Subramanian, Yi (Jason) Chang, Paul Randazzo ve Carole üst okuma ve el yazması üzerinde yorum için teşekkür etmek istiyor. Bu eser Ulusal Kanser Enstitüsü Intramural araştırma programı tarafından desteklenen Ulusal Sağlık Enstitüleri.

1. kaplama yemekleri (1 gün)
Not: parmak izi ya da kir Kalenin dibinde bu işlerken bırakmamaya dikkat edin.
<ol><li>Fare kollajen IV buz çözme ve 3 mL 10 µg/mL kollajen IV çözeltisi hazırlamak için 50 mM HCl (pH 1.3) ile sulandırmak. Not: Kollajen 37 ° C'de çökelti Bu nedenle kollajen çözüm ise çözülme ve bu modülle çalışmanın bir düşük sıcaklıkta tutmak önemlidir. Uygun büyüklükteki aliquots hazırlayarak tekrarlanan donma-çözülme döngüsü önlemek ve onları-80 ° C'de depolama</li>
	<li>12-şey cam alt plakanın her şey için 250 µL kollajen IV çözüm ekleyin ve uygun ölçekli, kapanış sıkı bir plastik kutuya koyun. Islak kağıt havlu üzerinde ve çevresinde plakaları nemli bir odası imalatı ve kutusunu kapatmak yerleştirin. Gecede, oda sıcaklığında plakaları kuluçkaya. Not: olarak sadece büyüme alanı kaplı olması gerekiyor, bu yalnızca alt plaka kollajen çözüm ile bağlı olduğu kapak notu karşılamak için yeterli olur ( şekil 1A, B bir şematik plaka için bakınız).</li>
	<li>Ertesi sabah, iki kez absorbe olmayan kollajen ve tampon kaldırmak için deiyonize H2O ile plakalar durulayın. Su iyi değil (su sıçrama bu alana pipetted ise) plaka alt ve coverslip tarafından kurulmuş kenarına plaka kenarına doğrudan. Tabakalar laminar akış başlıklı kuruması. Tabak hemen kullanın veya 4 ° C'de 5 güne kadar saklayın. Not: Farklı kaplama, fibronektin veya kollajen gibi ben farklı hücre hatları gerektirebilir.</li>
</ol>2. nokta tahlil (2 gün) kaplama
<ol><li>
Hücre süspansiyon hazırlama
	<ol>
<li>Hücre süspansiyon hazırlamak için 60 mm doku kültürü çanak ile % 5 at serum % 80 izdiham için takıma DMEM/F12 orta artış var hücreleri kullanın.</li>
		<li>Kalsiyum ve magnezyum ücretsiz Dulbecco'nın fosfat tamponlu tuz çözeltisi (DPBS) içeren hücreleri bir kez durulama, 500 µL tripsin-EDTA (oda sıcaklığında) ekleyin ve 3-5 dk 37 ° C, % 5 CO2, oksijen atmosfere bir kuluçka için hücreleri kuluçkaya.</li>
		<li>4.5 mL kültür tripsin etkinliğini durdurur ve bir 20 Say için orta müstakil hücrelerde askıya µL aliquot bir hemasitometre hücre süspansiyon.</li>
		<li>Tarafından Santrifüjü 200 x g 3 dk de 15 mL konik tüp içinde kalan hücreleri cips, süpernatant Aspire edin ve kültür orta 3 x 106 hücre/mL olarak hücrelerde resuspend. Not: diğer kaplama Substratları ve/veya hücre satırları için optimum hücre yoğunluğu seyreltme serideki oluşturulmalıdır. 3 x 106 hücre/mL başlangıç noktası olarak önerilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Kaplama hücreleri
	<ol>
<li>Yer hücre süspansiyon kollajen IV her kapak kayma ortasındaki bir 10 µL damla 12-şey cam alt plaka dokunmadan veya kaplama (şekil 1A, B) tırmalamak kaplı. 30 dk 37 ° c, oksijen atmosfere hücreleri eklemek izin vermek için plaka kuluçkaya. Bir ters mikroskobu hücreleri bağlı olduğu kontrol edin. Not: Bu en iyi damla, kenarında nerede bir monolayer oluşumu (şekil 1C) gözlenen görülebilir. Gerekirse, plaka kadar kuluçkaya 3 h. damla hızlı bir şekilde kuru olabilir gibi nem kuluçka kadar yüksek olduğunu emin olun. Damla birimin bir azalma bu adımı sırasında gözlenen, PBS nem oranı artırmak için kuyu arasında boşluk ekleyin.</li>
		<li>Yavaşça wells kültür iki kez ekli olmayan hücreleri kaldırmak için orta 1 mL ile yıkayın. 1 mL kültür orta her şey için ekleyin. Bir ters mikroskobu kontrol kayan hiçbir hücre kalır, aksi takdirde kuyuları tekrar yıka. Gecede, 37 ° C, % 5 CO2, oksijen atmosfer iyi tanımlanmış hücre yaprak elde etmek için hücreleri kuluçkaya. Not: Yüzen hücreleri yeniden plakasına eklemek ve istenmeyen hücre kolonileri kurmaya muhtemeldir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. uyarıcı hücreleri (3. gün)
<ol><li>Bütün wells kolonileri düzgün büyüdü o hücreye sağlamak için ters bir mikroskop kullanarak kontrol edin. Gerekirse, uygun olmayan wells işaretlemek ve bunları kullanmayın.</li>
	<li>Her şey uygun bir şekilde araştırıldı her koşul için plaka etiketleyin. Her koşul yinelenen veya nüsha çalıştırın.</li>
	<li>DMEM/F12 %0,1 at serum (Aç orta) içeren hücrelerde açlıktan için orta değiştirmek 3 h önce hücreleri uyarılır.</li>
	<li>Hücreleri EGF (5 ng/mL nihai toplama) eklenmesi veya istenilen başka arabulucu tarafından teşvik ve karışımı yavaşça 1 mL micropipettor kullanarak orta veya plaka dönen tarafından.</li>
	<li>Plaka kenar deplasman ve kenar kontur 4.1 bölümünde açıklandığı gibi gözlemlemek 1-4 gün kuluçkaya veya 4.2 bölümünde açıklandığı gibi hızlandırılmış görüntüleme gerçekleştirmek.</li>
</ol>4. hücre kolonileri ve hücre göç görselleştirme
<ol><li>
Hematoksilen-koloni büyüme (4-7 gün) ölçmek için boyama Eozin (o)
	<ol>
<li>% 70 etanol (1 mL/de) ~ 2 min için hücrelerde düzeltmek.</li>
		<li>Çekirdeklerin Hematoksilen (1 mL/de), ~ 2 dk ile leke.</li>
		<li>Musluk suyu (1 mL/de) çekirdeği kadar yıkama hücrelerle mavi, 5-10 dak.</li>
		<li>Sitoplazma Eozin (1 mL/de), ~ 2 dk ile leke.</li>
		<li>Deiyonize su (1 mL/de) ile durulayın. Not: Hematoksilen Eozin çözümler toplanan ve boyama zayıf hale gelinceye kadar birden çok kez kullanılan.</li>
		<li>Plaka kuruması.</li>
		<li>Plaka çevirmek ve bir cetvel ile nokta çapı ölçmek. Alternatif olarak, Resimler plaka kamera ile fotoğraf çekip ImageJ nokta çapı analiz.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Hızlandırılmış mikroskobu (3. gün)
	<ol>
<li>Kuluçka makinesi mikroskobunun geçin ve 37 ° c sıcaklık ayarlama Nemlendirici dH2O. küçültme/büyütme CO%2 5 ile doldurun. Kuluçka odası nemlendirilmelidir ve motorlu sahne özgürce hareket edebilirsiniz olun. Kuluçka odası kapatın ve 37 ° C'ye ayarlamak mikroskop izin Not: Mikroskop (malzemeleri tablo görmek) kullanılan hücreleri odak sürüklenen önlemek için yansıma önce burada 37 ° c en az 3 h için ısıtmalı olabilir.</li>
		<li>Plaka kuluçka mikroskop sahnesinde yerini ve sahne liste oluşturma. Görüntü iki karşıt kenarları ve her hücre nokta (şekil 1A) merkezi.</li>
		<li>Görüntüler her 3 dk, 15-24 h 10 X amacı istimal için tutar. Veri indirme ve görüntü analizi tercih, bir programda devam örneğin, ImageJ veya Matlab.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Liang, C. -. C., Park, A. Y., Guan, J. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+scratch+assay:+a+convenient+and+inexpensive+method+for+analysis+of+cell+migration+in+vitro.">In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro.</a> Nat Protoc. 2 (2), 329-333 (2007).</li><li>Peplow, P. V., Chatterjee, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+the+influence+of+growth+factors+and+cytokines+in+in+vitro+human+keratinocyte+migration.">A review of the influence of growth factors and cytokines in in vitro human keratinocyte migration.</a> Cytokine. 62 (1), 1-21 (2013).</li><li>Hulkower, K. I., Herber, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration+and+invasion+assays+as+tools+for+drug+discovery.">Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery.</a> Pharmaceutics. 3 (1), 107-124 (2011).</li><li>Weiger, M. C., Vedham, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+motion+analysis+reveals+cell+directionality+as+an+indicator+of+breast+cancer+progression.">Real-time motion analysis reveals cell directionality as an indicator of breast cancer progression.</a> PLOS ONE. 8 (3), 58859 (2013).</li><li>Poujade, M., Grasland-Mongrain, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+migration+of+an+epithelial+monolayer+in+response+to+a+model+wound.">Collective migration of an epithelial monolayer in response to a model wound.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (41), 15988-15993 (2007).</li><li>Sunyer, R., Conte, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cell+durotaxis+emerges+from+long-range+intercellular+force+transmission.">Collective cell durotaxis emerges from long-range intercellular force transmission.</a> Science. 353 (6304), 1157-1161 (2016).</li><li>Bazelli&#232;res, E., Conte, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+cell-cell+forces+and+collective+cell+dynamics+by+the+intercellular+adhesome.">Control of cell-cell forces and collective cell dynamics by the intercellular adhesome.</a> Nat Cell Biol. 17 (4), 409-420 (2015).</li><li>Stuelten, C. H., Busch, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+tumor-fibroblast+interactions+increase+tumor+cell+malignancy+by+a+TGF-Beta+mediated+mechanism+in+a+mouse+xenograft+model+of+breast+cancer.">Transient tumor-fibroblast interactions increase tumor cell malignancy by a TGF-Beta mediated mechanism in a mouse xenograft model of breast cancer.</a> PLOS ONE. 5 (3), 9832 (2010).</li><li>Normanno, N., De Luca, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor+receptor+(EGFR)+signaling+in+cancer.">Epidermal growth factor receptor (EGFR) signaling in cancer.</a> Gene. 366 (1), 2-16 (2006).</li><li>Harrison, S. M. W., Knifley, T., Chen, M., O'Connor, K. L., HGF, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LPA,+HGF,+and+EGF+utilize+distinct+combinations+of+signaling+pathways+to+promote+migration+and+invasion+of+MDA-MB-231+breast+carcinoma+cells.">LPA, HGF, and EGF utilize distinct combinations of signaling pathways to promote migration and invasion of MDA-MB-231 breast carcinoma cells.</a> BMC Cancer. 13, 501 (2013).</li><li>Santner, S. J., Dawson, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malignant+MCF10CA1+cell+lines+derived+from+premalignant+human+breast+epithelial+MCF10AT+cells.">Malignant MCF10CA1 cell lines derived from premalignant human breast epithelial MCF10AT cells.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 65 (2), 101-110 (2001).</li><li>Tang, B., Vu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta+switches+from+tumor+suppressor+to+prometastatic+factor+in+a+model+of+breast+cancer+progression.">TGF-beta switches from tumor suppressor to prometastatic factor in a model of breast cancer progression.</a> J Clin Invest. 112 (7), 1116-1124 (2003).</li><li>Lee, R. M., Stuelten, C. H., Parent, C. A., Losert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collective+cell+migration+over+long+time+scales+reveals+distinct+phenotypes.">Collective cell migration over long time scales reveals distinct phenotypes.</a> Convergent science physical oncology. 2 (2), 025001 (2016).</li><li>Lee, R. M., Kelley, D. H., Nordstrom, K. N., Ouellette, N. T., Losert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+stretching+and+rearrangement+in+epithelial+sheet+migration.">Quantifying stretching and rearrangement in epithelial sheet migration.</a> New J Phys. 15 (2), (2013).</li><li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cancer:+the+next+generation.">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li><li>Grada, A., Otero-Vinas, M., Prieto-Castrillo, F., Obagi, Z., Falanga, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+techniques+made+simple:+analysis+of+collective+cell+migration+using+the+wound+healing+assay.">Research techniques made simple: analysis of collective cell migration using the wound healing assay.</a> J Invest Dermatol. 137 (2), 11-16 (2017).</li><li>Rosen, P., Misfeldt, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+density+determines+epithelial+migration+in+culture.">Cell density determines epithelial migration in culture.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (8), 4760-4763 (1980).</li></ol>

Yazar ifşa etmek hiçbir şey vardır.

Uzak doku çevreleyen doku istila ve uzak siteleri15' e metastaz kökenli tümör ilerleme hücreleri sırasında geçirilir. Geçiş hücre hücre koloni uzak nokta assay olarak görülebilir. Burada, nokta tahlil insan meme kanseri hücrelerinin yanıt EGF olarak göçmen fenotip analiz ederek gösterilmektedir.
Nokta up birkaç adımda doğru ve yinelenebilir sonuçları elde etmek için deneyleri kritik öneme sahiptir. İlk olarak, kaplama plaka olmadığını ve güçlü hücreleri plakasına uygun nasıl ve hücreleri geçirirseniz belirler. Kollajen IV veya diğer hücre dışı matriks ile plaka kaplama deneysel değişkenlik en aza indirmek için homojen özen gösterilmelidir. Ayrıca, bu soruşturma hücreleri ekleyin ve kaplamalı plaka üzerinde göç ve çeşitli konsantrasyonlarda farklı matrisler ile birden fazla deneyler kaplama koşullar için seçilen hücre kültürünü en iyi duruma getirmek gerekli olabilir sağlanması gerekir. İkinci olarak, hücrelerin doğru kaplama tekrarlanabilirlik için çok önemlidir. Hücre açılan ayak izi şeklini yanı sıra cep nokta boyutunu belirler. İdeal olarak, açılan yüzeylere pipet ucu yerleştirilir. Damla şeklinde çoğunlukla yüzey gerilimi tekrarlanabilir çapı dairesel bir ayak izi kaynaklanan plaka yüzeyi tarafından belirlenir. Sonuç olarak, hücre nokta çapı kaplama hücre süspansiyon hacmi değiştirerek değiştirilebilir.
Böylece, nokta tahlil yaparken olması göz önüne almanız gereken birkaç nokta vardır. İlk olarak, hücre süspansiyon hücre yoğunluğu kaplama yanı sıra kullanılan hücre tipi ayarlanması gerekiyor. Genel olarak, damla daha geniş yayılırsa, daha yüksek hücre yoğunluğu Konfluent monolayers plaka hücrelere ihtiyaç vardır. Ayrıca, daha fazla hücre hücreleri küçük ve büyük, Yayilim hücrelere kıyasla ne kadar yaymamak Konfluent monolayer elde etmek için kaplama gerekiyor. İkinci olarak, nokta tahlil farklı plaka biçimlerine kabul edilebilir ve bunun için nokta boyutu kaplama nokta hacmi azaltarak daha küçük kuyu için adapte edilebilir ve istenirse, daha büyük nokta, daha yüksek damla birimi kullanarak kaplama. Üçüncü olarak, bazı hücre hatları plaka 30 dk içinde bu durumda kaplama zaman bağlanacağı değil en fazla 3 saat genişletilebilir. Benzer şekilde, kaplama plaka hücreler geçiş etkin için uygun olmalı ve kaplama hücreleri kaplama zaman değil çizmemeye özen gösterilmelidir. Hücreleri değil iliştirin veya seçilen matrisin üzerinde göç, kaplama, örneğin kollajen 1 veya fibronektin, diğer tür düzenlemelidir veya matris proteinler, kuluçka süreleri ve kuluçka sıcaklıklar konsantrasyonları plakaların kaplama sırasında değişti. Belirli hücre hatları için uygun hücre dışı matriks literatürde bulunabilir.
Nokta tahlil bazı sınırlamalar vardır. Bu iki boyutlu geçiş tahlil ve bir dezavantaj vardır, ancak, üç boyutlu deneyleri için daha fazla karşılaştırıldığında böylece bu kabul edilebilir iki boyutlu deneyleri yapmak zor. Büyük bir sorun belki de hücre çoğalması sonucu, özellikle hızlı Proliferasyona hücre satırları kullanılır ve hücre geçiş burada koloni çapı analiz için 4 gün sonra olduğu gibi uzun süreler boyunca değerlendirildi etkileyebilir var. Benzer şekilde, kazı-kazan deneyleri yara yara kapatma hücre çoğalması hücre sayfası içinde etkilenir; ve özellikle serum veya hücre proliferations neden diğer arabulucu bir chemoattractant kullanılırsa Boyden odası deneyleri, artan hücre çoğalması alt Kamara içinde sonuçları çarpık. Tek hücre izleme özellikle hareketi olmayan Proliferasyona hücre gözlemlemek için kullanılabilir. Ayrıca, hücre çoğalması burada bitmiş gibi (i) serum açlık ve/veya (II) mitoz inhibisyonu yoluyla mitomycin veya diğer nükleer silahların yayılmasına karşı inhibitörleri4,16eklenmesi tarafından azaltılabilir. Hücre çoğalması azaltmak için ancak, zarar için artık geçirebilirsiniz bir ölçüde hücrelere özen göstermelidir. İlginçtir ki, biz benzer bir Kısıtlamasız geçişinde bulundu geçiş4,5sırasında, epitel sayfası bütünlüğünü korumada söz konusu olsa da hücre çoğalması kenar öteleme ile ilişkili değil tahlil 17. Bu ilginç bir soru açar: hücre çoğalması geçiş bir hücre levha, gerekli bir bileşenidir. Bu sayfanın sonunda artık genişletin ve geçiş hücreleri desteklemek mümkün olacak gibi nükleer silahların yayılmasına karşı tamamen bloke edilirse güçlü hücre-hücre yapışıklıklar sayfalarıyla hücre göç içine çevreye olumsuz etkilenecektir bekleniyor. Bu noktada, yavaş veya stop geçiş hücreleri gerekir veya sayfayı bozacaktır. Bunun tersi olarak, düşük hücre-hücre yapışıklıklar sayfalarıyla geçiş hücreleri epitel sayfasının kenarında saçılma gibi bağımsız olarak, geçirilecek sayfası bırakabilirsiniz daha az etkilenen olabilir. Böylece, hücre göç ve Hücre proliferasyonu birbirine bağlı ve çalışma sayfası geçiş hücre çoğalması engelleme girişimleri dikkatle düşünülmesi gerekiyor. Böylece, sayfa geçişi analiz deneyleri çoğunlukla azaltır ancak hücre göç kaldırılması değil serum açlık altında gerçekleştirilir.
Sayfa geçiş iki boyutlu yüzeyler üzerinde çalışmaya diğer geçiş deneyleri çizik veya yara tahlil ve, daha fazla son zamanlarda, silikon veya PDMS Odalar ve kaplama hücre tanımlanmış alanlarda sağlayan şablonlar kullanarak serbest geçiş deneyleri içerir ve hücreleri odası ya da kalıp1,3,4,5,6,7,16çıkarıldıktan sonra serbest geçiş boş hücre alana. Nesnenin şeklini ve boyutunu koloninin hücre kaplama belirler gibi bu ikinci deneyleri ve nokta tahlil yanı sıra unexperienced deneyimli kullanıcıların elinde yüksek tekrarlanabilirlik sunuyoruz. Buna ek olarak, kazı-kazan deneyleri hücresel monolayer in tırmalamak pratik gerektirir ve sıkı monolayers formu hücre hatları kullandıysanız bile uzmanlar parçaları kağıdın elinde yanlışlıkla kandırıldım olmak. Her ne kadar biz hatalı hücre yaprak Ibidi chambers çıkarıldıktan sonra yaralama gözlenen silikon odaları veya şablonlar hücreleri, kaplama için kullanıldığında bu sorun artırıldı. Hücreleri bir koloni kaplama olarak serbestçe büyümeye izin nokta tahlil bu sorunu önler. Aynı nedenlerle, nokta tahlil Ayrıca hücrelere kolayca çizilmemesi veya odası/şablon içinde diğer geçiş deneyleri kaldırma tarafından rahatsız değiştirilmemiş kaplama geçiş sağlar. Ayrıca, hücreleri çizilmemesi veya odaları/şablonlar, kaldırılması tarafından yaralı değil ölüm hücre ve sitokinler odaları/şablonların kaldırılması ile ilişkili ilişkili sürümü nokta tahlil geçişinde üzerinde herhangi bir etkisi yoktur. Son olarak, sık sık sıfırdan deneyleri ve deneyleri odaları veya şablonlar kullanarak aşırı kaplama hücrelerdir. Böylece, hücreleri onları kapalı tırmalama veya hücre geçiş engel fiziksel engellerin kaldırılması takas, hücre monolayer sakin olur ve hücre itti sonra etkin olarak geçirmeden boş hücre alana yayılıyor. Buna ek olarak, nokta assay olarak, hücre sayfaları kendileri gecede önce göç görülmektedir ve gevşeme hücre sayfasının yerine hücre göç gözlenen kurabilirsiniz.
Kolayca herhangi bir özel ekipman yapılabilir, nokta tahlil ödünç vermek kendisi sonraki deneyleri, brüt koloni morfolojisi ve hücre saçılma8, immunostaining8, hızlandırılmış değerlendirmek için hücreleri boyama da dahil olmak üzere bir dizi için görüntü ve sonraki veri analizi ImageJ, Matlab veya diğer görüntü analiz yazılımı13. Korelasyon komşu vektörlerin veya onların ayrılık yörüngeleri daha kesin olarak tespit edilebilir gibi ek parametreler yaprak13içinde hücre hareket tutarlılık açıklar. Hızlandırılmış görüntüleme da immunostaining ile kombine edilebilir ve ImageJ hücre izleme hücre göç daha fazla anlayış kazanmak için desteklenir. Örneğin, nokta immunostained hücre iskeleti proteinleri için hızlandırılmış görüntüleme sonra olabilir ve hücreleri sonra nasıl etkilediği ifade bu proteinlerin hücre göç fenotip analiz etmek için ImageJ kullanılarak izlenebilir. Başka bir gelecek nükleer floresan proteinler hızlı hücreleri tek hücre izleme kullanılır. Önemlisi, nokta tahlil çok iyi levha gerçekleştirilebilir ve bu böyle uygun orta yüksek üretilen iş için Imaging, uyuşturucu veya shRNAs etkisi sayfası geçiş ekran için kolayca erişilebilir ve çok uygun bir araç yapma.

Geçiş deneyleri yaygın olarak tümör hücreleri vitroinvaziv ve metastatik potansiyeli değerlendirmek için kullanılır. En sık, yara veya karalama tahlil epitel sayfaları geçiş bir hücre seçili alan1,2,3içine değerlendirmek için kullanılır. Kazı-kazan tahlil gerçekleştirmek için hücre monolayer kaplama ve bir "scratch" veya boş hücre alan bir pipet ucu ile oluşturulur. Kazı-kazan tahlil yaygın olarak bulunan doku kültürü malzemeleri ile kurmak kolaydır ve çok iyi Kaplamalar, birden fazla örnekleri işleme için izin, gerçekleştirilebilir. Ancak, sıfırdan yapılmış gibi hücreleri monolayer fiziksel olarak kaldırılır ve sık sık hücre ölümü tabi. Ayrıca, hücre dışı matriks plakasına bağlı kez tırmalamak işlemi sırasında hasar görmüş. Benzer şekilde, silikon kullanımı ekler (Ibidi odaları4gibi) veya şablonlar5,6,7 hücrelerin mekanik bozulma ve kaplama için kullanılan matris proteinlerin kısmi kaldırma yol açabilir tabaklar. Yara ya da çizik kapatılması izleme deneyleri bir diğer dezavantajı kendi sınırlı bir süre ders gibidir çizik kapatılana kadar hücre göç sadece analiz edilebilir.
Nokta tahlil gerçekleştirmek için hücreleri üzerine kaplamalı veya kaplamasız levha8dairesel bir koloni olarak kaplama. Bu kaplama strateji için gerekçe göç veya boş hücre çevresinde kültür hücreleri veya ekler kaldırılmasını tarafından rahatsız etmeden istila tanımlı kenarları hücre yaprak elde etmektir. Nokta tahlil genel amacı geçiş kenar yer değiştirme veya daha yüksek spatio-zamansal çözünürlük hücrelerinin göçmen fenotip çözümlemek için hızlandırılmış görüntüleme için farklı koloni çapı, de tarafından ölçülen hücre yaprak gözlemlemektir.
Hücre göç microenvironmental yardımlar kemokinler, sitokinler ve büyüme faktörleri gibi EGF gibi çeşitli tarafından etkilenebilir. EGF üzerinden bağlayıcı için onun reseptör, EGF reseptör9, biyolojik etkileri giderek artan ve invaziv ve metastatik tümör hücreleri4,9,10davranışını artan bir büyüme faktörüdür. Burada, nokta tahlil incelemek için kullanılır EGF uyarılmış bir insan invaziv, akciğer kolonisi meme kanseri hücre satırı (MCF10CA1a)8,11,12oluşturan hücre göç.

<table style="border-collapse:collapse;width:659pt" width="878">
	<colgroup>
		<col style="width:302pt" width="402" />
		<col style="width:160pt" width="213" />
		<col style="width:131pt" width="175" />
		<col style="width:66pt" width="88" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="width:302pt;height:15.75pt" width="402">MCF10CA1a cells</td>
			<td style="width:160pt" width="213">Karmanos Research Institute</td>
			<td class="xl18" style="width:131pt" width="175">N/A</td>
			<td style="width:66pt" width="88">cells used for asay</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">mouse collagen IV</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td class="xl18">354233</td>
			<td>used to coat plates</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">trypsin / EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td class="xl19">25300054</td>
			<td>used to remove cells from tissue culture plates</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">DPBS&#160;</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td class="xl18">21-031-CV</td>
			<td>used to wash cells</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">DMEM / F12</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td class="xl18">11320082</td>
			<td>used as culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">horse serum</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td class="xl18">26050088</td>
			<td>used to supplement culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">12well glass bottom plate</td>
			<td>MatTek</td>
			<td class="xl18">P12G-1.5-14-F</td>
			<td>used to grow cells for imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">LPA (1-Oleoyl Lysophosphatidic Acid )</td>
			<td>Cayman</td>
			<td class="xl18">10093</td>
			<td>used to stimulate cells</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">EGF (epidermal growth factor, human recombinant)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td class="xl18">AF-100-15</td>
			<td>used to stimulate cells</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">fatty acid free BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td class="xl18">A8806-1G</td>
			<td>used to make buffer for LPA and EGF</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">hematoxylin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td class="xl18">HHS32</td>
			<td>used to stain colonies</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">eosin</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td class="xl18">26051-10</td>
			<td>used to stain colonies</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">37C, 5% CO2 incubator</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td class="xl18">model MCO-18AIC (UV)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">Zeiss AxioObserver with incubator chamber and motorized stage</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td class="xl18">model Axio Observer.Z1</td>
			<td>used for time lapse imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">ORCA Flash LT sCMOS camera</td>
			<td>BioVision</td>
			<td class="xl21">C11440-42U-KIT</td>
			<td>used for timelapse imaging in combination with Zeiss AxioObserver</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">Metamorph</td>
			<td>BioVision</td>
			<td class="xl18">MMACQMIC</td>
			<td>software used for time lapse imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td class="xl18">model IX70</td>
			<td>used to count cells and to check colonies in tissue culture</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">plastic box</td>
			<td>Lock&#38;Lock</td>
			<td class="xl18">N/A</td>
			<td>used as humid chamber (any tight closing plastic box that fits the plates can be used)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using the dot assay to analyze migration of cell sheets

Karmaşık organizmalara statik görünse de, onların dokular altında sürekli cirosu vardır. Yaş hücreleri ölür ve vardır yeni hücreleri tarafından yerine hücreleri doku içinde sıkıca orkestra bir şekilde hareket. Tümör gelişimi sırasında bu denge bozulmuştur ve tümör hücreleri epitel yerel microenvironment, uzak siteler için seyahat etmek ve sonuçta uzak sitelerdeki metastatik tümörler oluşturmak için istila kökenli bırakın. Nokta tahlil bir boş hücre alana hücre yaprak hareket net değerlendirmek ve parametreleri hızlandırılmış Imaging'i kullanma hücre göç çözümlemek için bir basit, iki boyutlu Kısıtlamasız geçiş tahlil olduğunu. Burada, nokta tahlil epidermal büyüme Malign meme kanseri hücrelerinin potansiyelini artırmak için bilinen faktörü (EGF), hücre göç yanıt çözümlenecek bir insan invaziv, meme kanseri hücre kültürünü, MCF10CA1a, şekillendirme akciğer koloni kullanarak gösterilmiştir ve hücre göç fenotip değiştirmek için.

Burada sunulan (şekil 1) nokta tahlil invaziv, kullanarak gerçekleştirilen bir modeli sistem olarak meme kanseri hücreleri (MCF10CA1a) oluşturan akciğer koloni. Yeni başlayanlar, yapım o a uygun elinde bile son derece tekrarlanabilir hücre nokta nokta tahlil verimleri ve tahlil (şekil 1D) yürütmek kolay. O boyama veya hızlandırılmış görüntüleme nokta tahlil Birleşik ve sonraki partikül imaj velosimetri (PIV) deplasman epitel kenarları, hücre hızı ve hücre yön hücreler kenarlı olarak dahil olmak üzere çeşitli geçiş parametreleri çalışma sağlar epitel bir levha bir boş hücre alanına geçirin. Başlangıçta, faz kontrast görüntüleme hücre nokta invaziv, akciğer koloni oluşturan meme kanseri hücreleri (MCF10CA1a) Mezenkimal fenotip stimülasyon ile EGF sonra korumak olduğunu ortaya koydu. Ancak, tek hücreleri sayfa bırakarak EGF uyarılmış hücre noktalar (Şekil 2, oklar) daha sık gözlenir. MCF10CA1a hücreleri cevaben EGF daha da o tarafından değerlendirildi EGF ile 4 gün için teşvik kültürlerin boyama. Nitekim, EGF-stimülasyon bir artan koloni çapı (şekil 3) sonuçlandı. Bu gözlemler o geçiş gösterir EGF teşvik hücreleri değişmiş olabilir.
Bu nedenle, nokta tahlil sonraki dinamik geçiş fenotip MCF10CA1a hücre yaprak daha ayrıntılı bir analizini gerçekleştirmek için kullanılmıştır. Hücreleri yaprak kenarlarında 9 h EGF (Video 1 ve Video 2) içeren hücrelerin uyarılması takip için görüntüsü ve görüntüleri daha sonra Matlab4,13,14' te PIV tarafından analiz edildi. PIV EGF hücre hızı (şekil 4A) 0,63 µm/dak için kontrol hücreleri 0,45 µm/dk dan çıkar ortaya. Aynı zamanda yön hücre EGF artmış ve bu bir azalma 0,79 EGF uyarılmış kültürlerde (şekil 4B) için hücre yön (açısal yaymak) üzerinden kontrol kültürde 0,95 değişkenliği tarafından belirtilir. EGF epitel kenar 356 µm (şekil 4), 257 µm üzerinde 9 h Radyal deplasman da o dört gün sonra (şekil 3) Boyama tarafından gözlendi olarak arttı. Böylece, öyle ki hücre hız ve yön arttı, EGF MCF10CA1a hücreleri yaprak kenarlarında geçiş bir artan koloni RADIUS kaynaklanan değiştirir ki farklı sonraki deneyleri ile birlikte nokta tahlil kullanımını göstermektedir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56451/56451fig1.jpg"> Şekil 1: Nokta tahlil Imaging. (A, B) Hücrelerin ortasındaki cam alt plaka Wells döngüsel bir koloni olarak kaplama. Geçiş analizi için görüntüleri ortasına koloni(a)yanı sıra iki karşıt kenarları alınır. (C) karanlık alan görüntü hücre nokta (solda) kaplama sırasında ve daha yüksek büyütme (Faz kontrast) kenarına açılan ve hücre nokta kenarına sonra plaka (Merkezi) bağlı hücreleri gösteren. Ekli hücreleri düz ve poligonal, ekli olmayan hücreleri (sağda) yuvarlak iken. (D) Nokta çapını son derece tekrarlanabilir. Noktalar kaplama hemen sonra ve önce hücreleri teşvik ve çapı ImageJ kullanarak kararlı görüntüsü. Nokta boyutu farklı kullanıcılar arasında bir deney içinde de son derece tekrarlanabilir ve küçük eğitim hücre noktalar kaplama yeterlik kazanmak için gerekli (E = 10 yıldan fazla deneyimi doku kültürü, ben doku c deneyimi az 4 hafta = ulture). n grup başına 12 nokta =. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56451/56451fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56451/56451fig2.jpg"> Resim 2: EGF modüle MCF10CA1a hücre morfolojik fenotip. MCF10CA1a hücrelerin 3 h DMEM/F12 EGF ile uyarılan önce %0,1 at serum ile takviye için aç (5 ng/mL). EGF uyarılmış kolonileri kenarında tek hücreleri (oklar) sayfası dışında geçirmek eğilimindedir. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56451/56451fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56451/56451fig3.jpg"> Şekil 3 : EGF artırır hücre kolonileri net büyüme. MCF10CA1a hücrelerin EGF ile uyarılan önce %0,1 at serum ile desteklenmiş DMEM/F12 orta 3 h için aç (5 ng/mL). 4 gün sonra sabit ve Hematoksilen ve Eozin ile lekeli etanol hücreleri vardı. EGF uyarılmış nokta 4 gün sonra daha yüksek bir çapa sahip. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56451/56451fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56451/56451fig4.jpg"> Şekil 4 : EGF MCF10CA1a hücre göç fenotip modüle. MCF10CA1a hücrelerin EGF ile uyarılan önce %0,1 at serum ile desteklenmiş DMEM/F12 orta 3 h için aç (5 ng/mL). 9 h. sonraki partikül imaj velosimetri analiz Matlab13' te gerçekleştirilen için hücreleri her 3 dakikada görüntüsü. Hız değerleri ortalama hızı her alan için zamanla temsil eder. Açısal hız vektörel çizimler yayılmasını olarak hesaplanmıştır: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56451/56451eq1.jpg">nerede <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56451/56451eq2.jpg"> </img>ve aralıkları (yüksek yön) 0 <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56451/56451eq3.jpg"> (düşük yön). Açısal yayılmış bir düşüş bir artış içinde yön olarak kabul edilir. Radyal deplasman koloni RADIUS t çıkarılarak hesaplanan t koloni RADIUS üzerinden 0 h = 9 h. EGF-stimülasyon hücre noktalar artan hücre hızı (A; doğru üst kapı) sonuçlandı, açısal yayılmış azalmıştır veya artmış yön (B; orta MCF10CA1a = paneli) ve artan koloni RADIUS (C; alt paneli). Verileri temsil eden ortalama ± SEM n = 3 deneyler. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56451/56451fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Movie 1" src="/files/ftp_upload/56451/56451movie1.jpg"> Video 1: Unstimulated MCF10CA1a hücre zaman hata görüntüleme. Görüntüler her 3 dakikada 9 h. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56451/A1-L_ctrl_Substack_(1-181-3).avi" target="_blank">için lütfen bu videoyu izlemek için buraya tıklayın alınmıştır. (İndirmek için sağ tıklatın.)</a>
<img alt="Movie 2" src="/files/ftp_upload/56451/56451movie2.jpg"> Video 2: Hızlandırılmış MCF10CA1a hücrelerinin Imaging EGF ile uyarılmış (5 ng/mL). Görüntüler her 3 dakikada 9 h. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56451/B1-L_EGF_Substack_(1-181-3).avi" target="_blank">için lütfen bu videoyu izlemek için buraya tıklayın alınmıştır. (İndirmek için sağ tıklatın.)</a>

Watch this Scientific Journal Video about Using the Dot Assay to Analyze Migration of Cell Sheets at JoVE.com

Using the Dot Assay to Analyze Migration of Cell Sheets

Geçiş hücre yaprak analiz etmek için nokta tahlil kullanarak

Hücre göç geliştirme, doku bakım ve onarım ve tumorigenesis için çok önemlidir ve büyüme faktörleri, kemokinler ve sitokinler tarafından düzenlenmiştir. Bu iletişim kuralı nokta yöntemi, ekli, uyumlu cep yaprak yanıt microenvironmental ipuçlarını göçmen fenotip değerlendirmek için bir iki boyutlu, serbest geçiş tahlil açıklar.

Although complex organisms appear static, their tissues are under a continuous turnover. As cells age, die, and are replaced by new cells, cells move ...

using-the-dot-assay-to-analyze-migration-of-cell-sheets

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Cancer Research

6.8K Görüntüleme.  National Institutes of Health. Hücre göç geliştirme, doku bakım ve onarım ve tumorigenesis için çok önemlidir ve büyüme faktörleri, kemokinler ve sitokinler tarafından düzenlenmiştir. Bu iletişim kuralı nokta yöntemi, ekli, uyumlu cep yaprak yanıt microenvironmental ipuçlarını göçmen fenotip değerlendirmek için bir iki boyutlu, serbest geçiş tahlil açıklar.

Video: Using the Dot Assay to Analyze Migration of Cell Sheets

Intracarotid Cancer Cell Injection to Produce Mouse Models of Brain Metastasis

Metastasis, the spread and growth of malignant cells at secondary sites within a patient&#39;s body, accounts for &#62; 90% of cancer-related mortality. Recently, impressive advances in novel therapies have dramatically prolonged survival and improved quality of life for many cancer patients. Sadly, incidence of brain metastatic recurrences is fast rising, and all current therapies are merely palliative. Hence, good experimental animal models are urgently needed to facilitate in-depth studies of the disease biology and to assess novel therapeutic regimens for preclinical evaluation. However, the standard in vivo metastasis assay via tail vein injection of cancer cells produces predominantly lung metastatic lesions; animals usually succumb to the lung tumor burden before any meaningful outgrowth of brain metastasis. Intracardiac injection of tumor cells produces metastatic lesions to multiple organ sites including the brain; however, the variability of tumor growth produced with this model is large, dampening its utility in evaluating therapeutic efficacy. To generate reliable and consistent animal models for brain metastasis study, here we describe a procedure for producing experimental brain metastasis in the house mouse (Mus musculus) via intracarotid injection of tumor cells. This approach allows one to produce large number of brain metastasis-bearing mice with similar growth and mortality characteristics, thus facilitating research efforts to study basic biological mechanisms and to assess novel therapeutic agents.

Brain metastasis has become an urgent unmet medical need as its incidence has increased while therapeutic options have remained palliative. Creating experimental animal models of brain metastasis via intracarotid arterial injection of cancer cells facilitates mechanistic studies of the disease biology and evaluation of novel intervention regimens.

Intracarotid Kanser Hücre Enjeksiyon Beyin metastaz Fare modelleri üretmek için

Metastasis, the spread and growth of malignant cells at secondary sites within a patient&#39;s body, accounts for &#62; 90% of cancer-related mortality. ...

Kanser Araştırmaları

Live-imaging of Breast Epithelial Cell Migration After the Transient Depletion of TIP60

The wound-healing assay is efficient and one of the most economical ways to study cell migration in vitro. Conventionally, images are taken at the beginning and end of an experiment using a phase-contrast microscope, and the migration abilities of cells are evaluated by the closure of wounds. However, cell movement is a dynamic phenomenon, and a conventional method does not allow for tracking single-cell movement. To improve current wound-healing assays, we use live-cell imaging techniques to monitor cell migration in real time. This method allows us to determine the cell migration rate based on a cell tracking system and provides a clearer distinction between cell migration and cell proliferation. Here, we demonstrate the use of live-cell imaging in wound-healing assays to study the different migration abilities of breast epithelial cells influenced by the presence of TIP60. As cell motility is highly dynamic, our method provides more insights into the processes of wound healing than a snapshot of wound closure taken with the traditional imaging techniques used for wound-healing assays.

Here, we present the real-time monitoring of cell migration in a wound-healing assay using TIP60-depleted MCF10A breast epithelial cells. The implementation of live-cell imaging techniques in our protocol allows us to analyze and visualize single-cell movement in real time and across time.

Meme epitel hücre göç TIP60 geçici tükenmesi sonra canlı görüntüleme

The wound-healing assay is efficient and one of the most economical ways to study cell migration in vitro. Conventionally, images are taken at the ...

Evaluation of the Cell Invasion and Migration Process: A Comparison of the Video Microscope-based Scratch Wound Assay and the Boyden Chamber Assay

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration and invasion abilities to understand how cancer cells disseminate, with the aim of developing new treatment strategies. Analysis of the cellular and molecular basis of these abilities has led to the characterization of cell mobility and the physicochemical properties of the cytoskeleton and cellular microenvironment. For many years, the Boyden chamber assay and the scratch wound assay have been the standard techniques to study cell invasion and migration. However, these two techniques have limitations. The Boyden chamber assay is difficult and time consuming, and the scratch wound assay has low reproducibility. Development of modern technologies, especially in microscopy, has increased the reproducibility of the scratch wound assay. Using powerful analysis systems, an &#34;in-incubator&#34; video microscope can be used to provide automatic and real-time analysis of cell migration and invasion. The aim of this paper is to report and compare the two assays used to study cell invasion and migration: the Boyden chamber assay and an optimized in vitro video microscope-based scratch wound assay.

This study reports two different methods for the analysis of cell invasion and migration: the Boyden chamber assay and the in vitro video microscope-based wound-healing assay. The protocols for these two experiments are described, and their benefits and disadvantages are compared.

Cep işgali ve geçiş işlemi değerlendirilmesi: Video mikroskop esaslı çizik karşılaştırılması tahlil ve Boyden odası tahlil yara

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration ...

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay

The inactivation of the von Hippel-Lindau (VHL) tumor suppressor gene plays a crucial role in the development of hemangioblastomas (HBs) within the human central nervous system (CNS). However, both the cytological origin and the evolutionary process of HBs (including neovascularization) remain controversial, and anti-angiogenesis for VHL-HBs, based on classic HB angiogenesis, have produced disappointing results in clinical trials. One major obstacle to the successful clinical translation of anti-vascular treatment is the lack of a thorough understanding of neovascularization in this vascular tumor. In this article, we present a comprehensive procedure to evaluate in vitro whether classic tumor angiogenesis exists in HBs, as well as its role in HBs. With this procedure, researchers can accurately understand the complexity of HB neovascularization and identify the function of this common form of angiogenesis in HBs. These protocols can be used to evaluate the most promising anti-vascular therapy for tumors, which has high translational potential either for tumors treatment or for aiding in the optimization of the anti-angiogenic treatment for HBs in future translations. The results highlight the complexity of HB neovascularization and suggest that this common form angiogenesis is only a complementary mechanism in HB neovascularization.

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay

This paper presents a comprehensive procedure to evaluate in vitro whether classic tumor angiogenesis exists in hemangioblastomas (HBs) and its role in HBs. The results highlight the complexity of HB-neovascularization and suggest that this common form of angiogenesis is only a complementary mechanism in the HB-neovascularization.

Sözde Hemangioblastoma tahlil çimlenme küresel kullanarak neovaskülarizasyon Vitro performansını değerlendirmek için kapsamlı bir yordam

The inactivation of the von Hippel-Lindau (VHL) tumor suppressor gene plays a crucial role in the development of hemangioblastomas (HBs) within the human ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include rapid proliferation and pervasive invasion into the normal brain. Recurrence is thought to result from the presence of radio- and chemo-resistant brain tumor stem cells (BTSCs) that invade away from the initial cancerous mass and, thus, evade surgical resection. Hence, therapies that target BTSCs and their invasive abilities may improve the otherwise poor prognosis of this disease. Our group and others have successfully established and characterized BTSC cultures from GBM patient samples. These BTSC cultures demonstrate fundamental cancer stem cell properties such as clonogenic self-renewal, multi-lineage differentiation, and tumor initiation in immune-deficient mice. In order to improve on the current therapeutic approaches for GBM, a better understanding of the mechanisms of BTSC migration and invasion is necessary. In GBM, the study of migration and invasion is restricted, in part, due to the limitations of existing techniques which do not fully account for the in vitro growth characteristics of BTSCs grown as neurospheres. Here, we describe rapid and quantitative live-cell imaging assays to study both the migration and invasion properties of BTSCs. The first method described is the BTSC migration assay which measures the migration toward a chemoattractant gradient. The second method described is the BTSC invasion assay which images and quantifies a cellular invasion from neurospheres into a matrix. The assays described here are used for the quantification of BTSC migration and invasion over time and under different treatment conditions.

Here, we describe live-cell imaging techniques to quantitatively measure the migration and invasion of glioblastoma brain tumor stem cells over time and under multiple treatment conditions.

Canlı hücre görüntüleme deneyleri için çalışma Glioblastoma Beyin tümör kök hücre göç ve işgali

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful immunotherapies. Several studies have indicated that tumor infiltrating myeloid cells (e.g., myeloid-derived suppressor cells (MDSCs) and tumor-associated macrophages (TAMs)) suppress cytotoxicity of CD8+ T cells in the tumor microenvironment, and that targeting these regulatory myeloid cells can improve immunotherapies. Here, we present an in vitro assay system to evaluate immune suppressive effects of monocytic-MDSCs and TAMs on the tumor-killing ability of CD8+ T cells. To this end, we first cultured na&#239;ve splenic CD8+ T cells with anti-CD3/CD28 activating antibodies in the presence or absence of suppressor cells, and then co-cultured the pre-activated T cells with target cancer cells in the presence of a fluorogenic caspase-3 substrate. Fluorescence from the substrate in cancer cells was detected by real-time fluorescence microscopy as an indicator of T-cell induced tumor cell apoptosis. In this assay, we can successfully detect the increase of tumor cell apoptosis by CD8+ T cells and its suppression by pre-culture with TAMs or MDSCs. This functional assay is useful for investigating CD8+ T cell suppression mechanisms by regulatory myeloid cells and identifying druggable targets to overcome it via high throughput screening.

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

We describe here a protocol to investigate cytotoxicity of pre-activated CD8+ T cells against cancer cells by detecting apoptotic cancer cells via real-time microscopy. This protocol can investigate mechanisms behind myeloid cell-induced T cell suppression and evaluate compounds aimed at replenishing T cells via blockade of immune suppressive myeloid cells.

Gerçek zamanlı hafiye-in Vitro tümör hücre Apoptosis içinde CD8 tarafından indüklenen+ T hücreleri Myeloid hücrelerin tümör infiltre bağışıklık baskılayıcı işlevlerini çalışmaya

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

A Simple Migration/Invasion Workflow Using an Automated Live-cell Imager

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great significance. Migration assays provide basic insight of cell movement at a 2D level, whereas invasion assays are more physiologically relevant, mimicking in vivo cancer cell dislodgment from the original site and invading through the extracellular matrix. The current protocol provides a single workflow for migration and invasion assays. Together with the integrated automated microscopic camera for real-time HD images and built-in analysis module, it gives researchers a time-efficient, simple and reproducible experimental option. This protocol also includes substitutions for the consumables and alternative analysis methods for users to choose from.

The current protocol describes an integrated method investigating cancer cell migration and invasion on a single platform in real-time, providing an easily reproducible and time-efficient option to study cell mobility and morphology.

Otomatik bir canlı hücre Imager kullanarak basit geçiş/işgali iş akışı

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great ...

Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods

The rapidly accelerated fibrosarcoma (RAF) family kinases play a central role in cell biology and their dysfunction leads to cancers and developmental disorders. A characterization of disease-related RAF mutants will help us select appropriate therapeutic strategies for treating these diseases. Recent studies have shown that RAF family kinases have both catalytic and allosteric activities, which are tightly regulated by dimerization. Here, we constructed a set of practical and feasible methods to determine the catalytic and allosteric activities and the relative dimer affinity/stability of RAF family kinases and their mutants. Firstly, we amended the classical in vitro kinase assay by reducing the detergent concentration in buffers, utilizing a gentle quick wash procedure, and employing a glutathione S-transferase (GST) fusion to prevent RAF dimers from dissociating during purification. This enables us to measure the catalytic activity of constitutively active RAF mutants appropriately. Secondly, we developed a novel RAF co-activation assay to evaluate the allosteric activity of kinase-dead RAF mutants by using N-terminal truncated RAF proteins, eliminating the requirement of active Ras in current protocols and thereby achieving a higher sensitivity. Lastly, we generated a unique complementary split luciferase assay to quantitatively measure the relative dimer affinity/stability of various RAF mutants, which is more reliable and sensitive compared to the traditional co-immunoprecipitation assay. In summary, these methods have the following advantages: (1) user-friendly; (2) able to carry out effectively without advanced equipment; (3) cost-effective; (4) highly sensitive and reproducible.

In this article, we presented a set of practical and feasible methods for characterizing disease-related mutants of RAF family kinases, which include in vitro kinase assay, RAF co-activation assay, and complementary split luciferase assay.

Bir dizi pratik ve uygulanabilir yöntem kullanarak RAF aile Kinazlarının hastalıkla ilgili mutantları karakterize etme

The rapidly accelerated fibrosarcoma (RAF) family kinases play a central role in cell biology and their dysfunction leads to cancers and developmental ...

Impedance-based Real-time Measurement of Cancer Cell Migration and Invasion

Cancer arises due to uncontrolled proliferation of cells initiated by genetic instability, mutations, and environmental and other stress factors. These acquired abnormalities in complex, multilayered molecular signaling networks induce aberrant cell proliferation and survival, extracellular matrix degradation, and metastasis to distant organs. Approximately 90% of cancer-related deaths are estimated to be caused by the direct or indirect effects of metastatic dissemination. Therefore, it is important to establish a highly reliable, comprehensive system to characterize cancer cell behaviors upon genetic and environmental manipulations. Such a system can give a clear understanding of the molecular regulation of cancer metastasis and the opportunity for successful development of stratified, precise therapeutic strategies. Hence, accurate determination of cancer cell behaviors such as migration and invasion with gain or loss of function of gene(s) allows assessment of the aggressive nature of cancer cells. The real-time measurement system based on cell impedance enables researchers to continually acquire data during a whole experiment and instantly compare and quantify the results under various experimental conditions. Unlike conventional methods, this method does not require fixation, staining, and sample processing to analyze cells that migrate or invade. This method paper emphasizes detailed procedures for real-time determination of migration and invasion of glioblastoma cancer cells.

Cancer is a lethal disease due to its ability to metastasize to different organs. Determining the ability of cancer cells to migrate and invade under various treatment conditions is crucial to assessing therapeutic strategies. This protocol presents a method to assess the real-time metastatic abilities of a glioblastoma cancer cell line.&#160;

Empedans tabanlı Gerçek Zamanlı Kanser Hücre Göçü ve İstilası Ölçümü

Cancer arises due to uncontrolled proliferation of cells initiated by genetic instability, mutations, and environmental and other stress factors. These ...

A Reporter Assay to Analyze Intronic microRNA Maturation in Mammalian Cells

MicroRNAs (miRNAs) are short RNA molecules that are widespread in eukaryotes. Most miRNAs are transcribed from introns, and their maturation involves different RNA-binding proteins in the nucleus. Mature miRNAs frequently mediate gene silencing, and this has become an important tool for comprehending post-transcriptional events. Besides that, it can be explored as a promising methodology for gene therapies. However, there is currently a lack of direct methods for assessing miRNA expression in mammalian cell cultures. Here, we describe an efficient and simple method that aids in determining miRNA biogenesis and maturation through confirmation of its interaction with target sequences. Also, this system allows the separation of exogenous miRNA maturation from its endogenous activity using a doxycycline-inducible promoter capable of controlling primary miRNA (pri-miRNA) transcription with high efficiency and low cost. This tool also allows modulation with RNA-binding proteins in a separate plasmid. In addition to its use with a variety of different miRNAs and their respective targets, it can be adapted to different cell lines, provided these are amenable to transfection.

We developed an intronic microRNA biogenesis reporter assay to be used in cells in vitro with four plasmids: one with intronic miRNA, one with the target, one to overexpress a regulatory protein, and one for Renilla luciferase. The miRNA was processed and could control luciferase expression by binding to the target sequence.

Memeli Hücrelerinde Intronic mikroRNA Olgunlaşmasını Analiz Etmek İçin Bir Muhabir Testi

MicroRNAs (miRNAs) are short RNA molecules that are widespread in eukaryotes. Most miRNAs are transcribed from introns, and their maturation involves ...