Yazarlar, mükemmel teknik yardımları için Lisa Hansen ve Kirsten Vestergaard'a ve el yazmasının eleştirel okuması için P. Scherer, N. Joffin ve C. Crewe'ye minnettardır. Yazarlar, burada açıklanan protokollerin geliştirilmesinde mükemmel rehberlik ve yardım için UTSW Akış Sitometrisi Çekirdeğine teşekkür eder. R.K.G., NIH NIDDK R01 DK104789, NIDDK RC2 DK118620 ve NIDDK R01 DK119163 tarafından desteklenir. J.P., Danimarka İnovasyon Fonu'ndan bir doktora öncesi ödül ile desteklenmektedir.

Tüm hayvan protokolleri ve prosedürleri, Texas Üniversitesi Güneybatı Tıp Merkezi Kurumsal Hayvan Kullanımı ve Bakımı Komitesi tarafından onaylanmıştır.
1. Gonadal beyaz yağ dokusundan stromal vasküler fraksiyonun (SVF) izolasyonu
<ol><li>6-8 haftalık farelerden gonadal beyaz yağ dokusunu inceleyin ve yağ pedlerini 1x PBS çözeltisine yerleştirin.</li>
	<li>4 adede kadar yağ deposunu birleştirin (1-2 fareden 2-4 depo önerilir) ve dokuyu 200 μL sindirim tamponu (1x HBSS,% 1.5 BSA ve 1 mg / mL kollajenaz D) içeren 10 mL'lik bir beherde kıyın.</li>
	<li>Kıyılmış dokuyu 10 mL sindirim tamponu içeren 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.</li>
	<li>Karışımı 37 °C'de bir su banyosunda çalkalayarak 1 saat inkübe edin.</li>
	<li>Sindirilmemiş dokuyu çıkarmak için sindirilmiş dokuyu 100 μm'lik bir hücre süzgecinden süzün.</li>
	<li>Filtrelenmiş numuneyi% 2 FBS içeren PBS ile 30 mL'ye seyreltin ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 600 x g'da santrifüjleyin. Olgun adipositler içeren süpernatanı aspire edin.</li>
	<li>Hemen tercih edilen hücre izolasyon yöntemine geçin.</li>
</ol>2. FACS kullanarak APC'lerin ve FIP'lerin izolasyonu
<ol><li>Tüpü hafifçe sallayarak peleti 1 mL 1x RBC lizis tamponunda çözün.</li>
	<li>RT'de 1-2 dakika inkübe edin.</li>
	<li>10 mL %2 FBS/PBS ekleyin ve 40 μm'lik bir hücre süzgecinden temiz bir 50 mL santrifüj tüpüne geçirin.</li>
	<li>600 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.</li>
	<li>Ortamı aspire edin ve peleti Fc bloğu (1:200) içeren 400-800 μL %2 FBS/PBS'de yeniden süspanse edin.</li>
	<li>4 °C'de 10 dakika inkübe edin.</li>
	<li>mL'de ≤106 hücre içeren 400 μL-800 μL hücre süspansiyonlarını 1.5 mL'lik tüplere aktarın ve antikorlar ekleyin. Antikor konsantrasyonları Malzeme Tablosu bölümünde listelenmiştir.<ol><li>1) boyanmamış hücreler, 2) tek renk kontrolleri ve 3) FMO (floresan eksi bir) kontrolleri için ayrı kontrol tüpleri hazırlayın.</li>
		<li>Örnekleri PDGFRβ, CD45, CD31, CD9, LY6C antikorları ile boyayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Işıktan koruyarak 4 °C'de 15 dakika inkübe edin.</li>
	<li>600 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.</li>
	<li>Ortamı aspire edin ve hücreleri 400 μL'lik %2 FBS/PBS'de yeniden süspanse edin.</li>
	<li>600 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.</li>
	<li>Ortamı aspire edin ve hücreleri 400-800 μL% 2 FBS / PBS'de yeniden süspanse edin. Daha sonra 40 μm filtre kapaklarından FACS için 5 mL polistiren yuvarlak tabanlı tüplere geçirin.</li>
	<li>Geçit için aşağıdaki adımları izleyin.<ol><li>Telafi için lekesiz ve tek renkli kontroller kullanın.</li>
		<li>Deneysel kapıları ayarlamak için FMO kontrollerini kullanın.</li>
		<li>APC'leri ve FIP'leri elde etmek için Şekil 1'de gösterilen geçit stratejisini kullanın. Kapı APC'leri CD45- CD31- PDGFRβ+ LY6C- CD9- ve FIP'leri CD45- CD31- PDGFRβ+ LY6C+ hücreleri olarak kullanın.</li>
	</ol></li>
	<li>Sıralanmış hücreleri 500 μL% 100 serum içeren tüplerde toplayın ve hücreleri buz üzerinde tutun.</li>
	<li>Hücreleri 4 ° C'de 5 dakika boyunca 600 x g'da santrifüjleyin. Hücreleri 4 ° C'de 5 dakika boyunca 600 x g'da tekrar santrifüjleyerek yıkamak için% 2 FBS / PBS ekleyin. Süpernatanı atın, peletlenmiş hücreleri kullanın.</li>
	<li>Peletlenmiş hücreleri, sonraki analiz için uygun hacimde gonadal APC kültür ortamında (hücre kültürü için) veya uygun tamponda yeniden süspanse edin.</li>
</ol>3. Adipojenik ve adipojenik olmayan fraksiyonların immünomanyetik ayrımı
<ol><li>1.1-1.7 adımlarını izleyerek SVF'yi gonadal beyaz yağ dokusundan izole edin.</li>
	<li>Süpernatanı aspire edin ve SVF peletini 10 mL 1x ticari olarak temin edilebilen MS Tamponunda yeniden süspanse edin.</li>
	<li>Hücre süspansiyonunu 40 μm'lik bir hücre süzgecinden süzün.</li>
	<li>600 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.</li>
	<li>Süpernatanı aspire edin ve peletlenmiş hücreleri 100 μL 1x MS Tamponunda yeniden süspanse edin.</li>
	<li>Aşağıda tartışıldığı gibi CD31 + ve CD45 + hücre tükenmesini gerçekleştirin (Şekil 2A, Adım 1). Bu, endotelyal ve hematopoietik soy hücrelerini çıkarmak için yapılır.<ol><li>Bir hücre sayacı kullanarak hücreleri sayın ve konsantrasyonu ≤ 1 x 108 hücre / mL'ye ayarlayın.</li>
		<li>Biyotin konjuge CD31 ve CD45 antikorlarını, her biri 106 hücre başına ≤ 0.25 μg konsantrasyonda hücre süspansiyonuna ekleyin ve 15 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.</li>
		<li>4 mL 1x MS Tampon ekleyerek hücreleri yıkayın.</li>
		<li>600 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.</li>
		<li>Süpernatanı aspire edin ve peleti 100 μL 1x MS tamponu ile yeniden süspanse edin.</li>
		<li>10 μL streptavidin nanoboncuk ekleyin ve hücreleri buz üzerinde 15 dakika inkübe edin.</li>
		<li>4 mL 1x MS tamponu ekleyerek hücreleri yıkayın.</li>
		<li>4 ° C'de 5 dakika boyunca 600 x g'da santrifüjleyin, ardından süpernatanı aspire edin.</li>
		<li>Hücreleri 2.5 mL 1x MS tamponunda yeniden süspanse edin ve 5 mL'lik bir polipropilen tüpe aktarın.</li>
		<li>Tüpü 5 dakika boyunca mıknatıs rafına yerleştirin.</li>
		<li>Hücre süspansiyonunu temiz bir 15 mL santrifüj tüpüne dökerek etiketlenmemiş hücreleri toplayın. NOT: İstenmeyen hücre fraksiyonundan kontaminasyona yol açtığından, asılı damlacıkları sallamaktan veya lekelemekten kaçının.</li>
		<li>Tüpü mıknatıstan çıkarın ve 3.6.9 adımlarını tekrarlayın. 3.6.11'e kadar. toplam 3 yıkama için iki kez daha.</li>
	</ol></li>
	<li>Adipojenik ve adipojenik olmayan fraksiyonların ayrılması (Şekil 2A, Adım 2)<ol><li>Etiketlenmemiş kesir (yani, CD45- CD31- kesir) ile çalışmaya devam edin.</li>
		<li>Etiketlenmemiş hücreler içeren 15 mL'lik tüpü 600 x g'da 4 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin.</li>
		<li>Süpernatanı aspire edin ve peleti 100 μL 1x MS tamponunda yeniden süspanse edin.</li>
		<li>Biyotin konjuge LY6C ve CD9 antikorlarını, sırasıyla, 106 hücre başına ≤ 0.25 μg konsantrasyonda ekleyin ve 15 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.</li>
		<li>3.6.3 adımlarını takip edin. 3.6.12'ye kadar. ikinci ayrımı tamamlamak için.</li>
		<li>İlişkilendirilmemiş kesirleri toplayın. Etiketlenmemiş hücreler (LY6C-CD9-), APC'leri içeren adipojenik fraksiyonu temsil eder (Şekil 2A, Adım 3).</li>
		<li>Tüpü mıknatıstan çıkarın, yeniden süspanse edin ve bağlı hücreleri 1x MS tamponunda elüte edin. Elüatlar veya etiketli fraksiyon (LY6C + CD9 +), FIP içeren adipojenik olmayan fraksiyonu temsil eder (Şekil 2A, Adım 3).</li>
		<li>Etiketli ve etiketsiz fraksiyonları 600 x g'da 5 dakika boyunca 4 °C'de pelet hücrelerine santrifüjleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>Hemen hücre kültürüne geçin (adım 6) veya tercih edilen analizler için farklılaşmamış öncüler kullanın (adım 4 ve/veya adım 5).</li>
</ol>4. Akış sitometrisi ile adipojenik ve adipojenik olmayan fraksiyonların saflığını değerlendirin
<ol><li>Fc bloğu (1:200) içeren 200-400 μL'lik %2 FBS/PBS'de boncuk izole hücre fraksiyonlarını yeniden süspanse edin.</li>
	<li>4 °C'de 10 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Hücre süspansiyonunu 1.5 mL'lik tüplere aktarın ve antikorlar ekleyin. Antikor konsantrasyonları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.<ol><li>1) boyanmamış hücreler, 2) tek renk kontrolleri ve 3) FMO kontrolleri için ayrı kontrol tüpleri hazırlayın.</li>
		<li>Örneklere CD45, CD31, CD9 ve LY6C antikorları ekleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>Işıktan koruyarak 4 °C'de 15 dakika inkübe edin.</li>
	<li>600 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.</li>
	<li>Süpernatan aspire edin ve hücreleri 400 μL% 2 FBS / PBS'de yeniden süspanse edin.</li>
	<li>Süspansiyonu 600 °C'de 5 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin.</li>
	<li>Süpernatanı aspire edin ve hücreleri 400-800 μL% 2 FBS / PBS'de yeniden süspanse edin. Akış sitometrisi ile analiz için 40 μm filtre kapaklarından 5 mL polistiren yuvarlak tabanlı tüplere süzün.</li>
	<li>Saflığı değerlendirmek için akış sitometrisi analizi<ol><li>Telafi için lekesiz ve tek renkli kontroller kullanın.</li>
		<li>Deneysel kapıları ayarlamak için FMO kontrollerini kullanın.</li>
		<li>Şekil 2B'de gösterildiği gibi canlı ve tek hücreler için geçit stratejisini kullanın.</li>
		<li>CD2, CD45, LY31C ve CD6 için Şekil 9B'de gösterildiği gibi geçitleme işlemini gerçekleştirin.</li>
		<li>İzole fraksiyonlar içinde CD45- CD31- LY6C- CD9- hücrelerinin (APC'ler) ve CD45- CD31- LY6C + hücrelerinin (FIP'ler) frekanslarını değerlendirmek için akış sitometrisi yazılımını kullanın.</li>
	</ol></li>
</ol>5. FIP'lerin ve APC'lerin saflığını değerlendirmek için kantitatif PCR kullanarak gen ekspresyonu analizi
<ol><li>Üreticinin talimatlarını izleyerek ticari olarak temin edilebilen ekstraksiyon kitini ( Malzeme Tablosuna bakın) kullanarak manyetik veya FACS izole hücrelerden mRNA'yı çıkarın.</li>
	<li>Üreticinin talimatlarını izleyerek bir cDNA Ters Transkriptaz kiti ( Malzeme Tablosuna bakın) kullanarak cDNA'yı sentezlemek için 1 μg RNA kullanın.</li>
	<li>SYBR yeşil PCR ana karışımı kullanarak kantitatif PCR ile APC ve FIP'leri seçici genlerin (Tablo 1) nispi mRNA seviyelerini belirleyin.<ol><li>PCR için numune reaksiyonunu aşağıdaki gibi ayarlayın: 5 μL 2x SYBR yeşil boya, 1 μL cDNA (~50 ng/ μL), her bir ileri ve geri astardan 0.5 μL (10 μM) ve 3 μL su.</li>
		<li>Kantitatif PCR çalıştırması için aşağıdaki standart PCR koşullarını kullanın: tutma aşaması: 50 °C 2 dakika, 95 °C 10 dakika; PCR aşaması (40 döngü): 15 saniye boyunca 95 °C, 1 dakika boyunca 60 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>ΔΔ-Ct'yi hesaplayarak değerleri temizlik geni (Rps18) seviyelerine normalleştirin.</li>
	<li>İstatistiksel anlamlılığı değerlendirmek için, eşleştirilmemiş Öğrenci t-testini gerçekleştirin.</li>
</ol>6. Hücre kültürü ve farklılaşması
<ol><li>Manyetik olarak veya FACS ile izole edilmiş hücreleri 600 x g'da 4 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin.</li>
	<li>Peletleri 500 μL gonadal APC kültür ortamında yeniden süspanse edin ve 48 oyuklu bir kültür plakasındaki her fraksiyondan 40K hücre / kuyu plakalayın.</li>
	<li>Ortamı her 1-2 günde bir değiştirin. APC'ler, birleşmeye yaklaştıkça adipositlere farklılaşmaya başlayacaktır. Aynı ortamda tutulan FIP'ler, adipogenez geçirmeye dirençlidir.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ouchi, N., Parker, J. L., Lugus, J. J., Walsh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipokines+in+inflammation+and+metabolic+disease.">Adipokines in inflammation and metabolic disease.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (2), 85-97 (2011).</li><li>Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+we+talk+about+when+we+talk+about+fat.">What we talk about when we talk about fat.</a> Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).</li><li>Funcke, J. B., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+adiponectin+and+leptin:+adipose+tissue-derived+mediators+of+inter-organ+communication.">Beyond adiponectin and leptin: adipose tissue-derived mediators of inter-organ communication.</a> Journal of Lipid Research. 60 (10), 1648-1684 (2019).</li><li>Eto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+structure+and+cellular+components+of+aspirated+and+excised+adipose+tissue.">Characterization of structure and cellular components of aspirated and excised adipose tissue.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 124 (4), 1087-1097 (2009).</li><li>Hirsch, J., Batchelor, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+cellularity+in+human+obesity.">Adipose tissue cellularity in human obesity.</a> Clinics in Endocrinology and Metabolism. 5 (2), 299-311 (1976).</li><li>Ghaben, A. L., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipogenesis+and+metabolic+health.">Adipogenesis and metabolic health.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (4), 242-258 (2019).</li><li>Hepler, C., Gupta, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expanding+problem+of+adipose+depot+remodeling+and+postnatal+adipocyte+progenitor+recruitment.">The expanding problem of adipose depot remodeling and postnatal adipocyte progenitor recruitment.</a> Molecular Cell Endocrinology. 445, 95-108 (2017).</li><li>Jo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophy+and/or+Hyperplasia:+Dynamics+of+Adipose+Tissue+Growth.">Hypertrophy and/or Hyperplasia: Dynamics of Adipose Tissue Growth.</a> PLoS Computational Biology. 5 (3), 1000324 (2009).</li><li>Sun, K., Kusminski, C. M., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+remodeling+and+obesity.">Adipose tissue remodeling and obesity.</a> Journal of Clinical Investigation. 121 (6), 2094-2101 (2011).</li><li>Kloting, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-sensitive+obesity.">Insulin-sensitive obesity.</a> American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 299 (3), 506-515 (2010).</li><li>Vishvanath, L., Gupta, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+adipogenesis+to+healthy+adipose+tissue+expansion+in+obesity.">Contribution of adipogenesis to healthy adipose tissue expansion in obesity.</a> Journal of Clinical Investigation. 129 (10), 4022-4031 (2019).</li><li>Choe, S. S., Huh, J. Y., Hwang, I. J., Kim, J. I., Kim, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+Tissue+Remodeling:+Its+Role+in+Energy+Metabolism+and+Metabolic+Disorders.">Adipose Tissue Remodeling: Its Role in Energy Metabolism and Metabolic Disorders.</a> Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 7, 30 (2016).</li><li>Hepler, C., Vishvanath, L., Gupta, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sorting+out+adipocyte+precursors+and+their+role+in+physiology+and+disease.">Sorting out adipocyte precursors and their role in physiology and disease.</a> Genes and Development. 31 (2), 127-140 (2017).</li><li>Burl, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconstructing+Adipogenesis+Induced+by+beta3-Adrenergic+Receptor+Activation+with+Single-Cell+Expression+Profiling.">Deconstructing Adipogenesis Induced by beta3-Adrenergic Receptor Activation with Single-Cell Expression Profiling.</a> Cell Metabolism. 28 (2), 300-309 (2018).</li><li>Hepler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+functionally+distinct+fibro-inflammatory+and+adipogenic+stromal+subpopulations+in+visceral+adipose+tissue+of+adult+mice.">Identification of functionally distinct fibro-inflammatory and adipogenic stromal subpopulations in visceral adipose tissue of adult mice.</a> Elife. 7, 39636 (2018).</li><li>Merrick, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+mesenchymal+progenitor+cell+hierarchy+in+adipose+tissue.">Identification of a mesenchymal progenitor cell hierarchy in adipose tissue.</a> Science. 364 (6438), 2501 (2019).</li><li>Schwalie, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stromal+cell+population+that+inhibits+adipogenesis+in+mammalian+fat+depots.">A stromal cell population that inhibits adipogenesis in mammalian fat depots.</a> Nature. 559 (7712), 103-108 (2018).</li><li>Bagchi, D. P., MacDougald, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+Dissection+of+Diverse+Mouse+Adipose+Depots.">Identification and Dissection of Diverse Mouse Adipose Depots.</a> Journal of Visualized Experiments. (149), e59499 (2019).</li><li>Jeffery, E., Church, C. D., Holtrup, B., Colman, L., Rodeheffer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+depot-specific+activation+of+adipocyte+precursor+cells+at+the+onset+of+obesity.">Rapid depot-specific activation of adipocyte precursor cells at the onset of obesity.</a> Nature Cell Biology. 17 (4), 376-385 (2015).</li><li>Kim, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+white+adipose+hyperplastic+potential+is+associated+with+enhanced+susceptibility+to+insulin+resistance.">Loss of white adipose hyperplastic potential is associated with enhanced susceptibility to insulin resistance.</a> Cell Metabolism. 20 (6), 1049-1058 (2014).</li><li>Vishvanath, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pdgfrbeta++Mural+Preadipocytes+Contribute+to+Adipocyte+Hyperplasia+Induced+by+High-Fat-Diet+Feeding+and+Prolonged+Cold+Exposure+in+Adult+Mice.">Pdgfrbeta+ Mural Preadipocytes Contribute to Adipocyte Hyperplasia Induced by High-Fat-Diet Feeding and Prolonged Cold Exposure in Adult Mice.</a> Cell Metabolism. 23 (2), 350-359 (2016).</li><li>Wang, Q. A., Tao, C., Gupta, R. K., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+adipogenesis+during+white+adipose+tissue+development,+expansion+and+regeneration.">Tracking adipogenesis during white adipose tissue development, expansion and regeneration.</a> Nature Medicine. 19 (10), 1338-1344 (2013).</li><li>Gao, Z., Daquinag, A. C., Su, F., Snyder, B., Kolonin, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDGFRalpha/PDGFRbeta+signaling+balance+modulates+progenitor+cell+differentiation+into+white+and+beige+adipocytes.">PDGFRalpha/PDGFRbeta signaling balance modulates progenitor cell differentiation into white and beige adipocytes.</a> Development. 145 (1), 155861 (2018).</li><li>Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+white+adipocyte+progenitor+cells+in+vivo.">Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo.</a> Cell. 135 (2), 240-249 (2008).</li><li>Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+study+of+adipocyte+precursors.">Isolation and study of adipocyte precursors.</a> Methods Enzymol. 537, 31-46 (2014).</li><li>Buffolo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+Paracrine+Signaling+Mechanism+Linking+CD34(high)+Progenitors+to+the+Regulation+of+Visceral+Fat+Expansion+and+Remodeling.">Identification of a Paracrine Signaling Mechanism Linking CD34(high) Progenitors to the Regulation of Visceral Fat Expansion and Remodeling.</a> Cell Reports. 29 (2), 270-282 (2019).</li><li>Shao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+adipocyte+differentiation+from+Pdgfrbeta(+)+preadipocytes+protects+against+pathologic+visceral+adipose+expansion+in+obesity.">De novo adipocyte differentiation from Pdgfrbeta(+) preadipocytes protects against pathologic visceral adipose expansion in obesity.</a> Nature Communications. 9 (1), 890 (2018).</li><li>Lee, P. Y., Wang, J. X., Parisini, E., Dascher, C. C., Nigrovic, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ly6+family+proteins+in+neutrophil+biology.">Ly6 family proteins in neutrophil biology.</a> Journal of Leukocyte Biology. 94 (4), 585-594 (2013).</li><li>Vijay, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+of+human+adipose+tissue+identifies+depot+and+disease+specific+cell+types.">Single-cell analysis of human adipose tissue identifies depot and disease specific cell types.</a> Nature Metabolism. 2 (1), 97-109 (2020).</li></ol>

T.A.P., Novo Nordisk A/S'nin bir çalışanı ve hissedarıdır

Farelerin C57BL / 6 suşu, diyete bağlı obezite çalışmalarında en çok kullanılan fare türüdür. C57BL / 6 fareleri, yüksek yağlı bir diyete (HFD) yerleştirildiğinde hızla kilo alır ve obezite ile ilişkili metabolik sendromun bazı belirgin özelliklerini geliştirir (örneğin, insülin direnci ve hiperlipidemi). Özellikle, yüksek yağlı diyet (HFD) beslemesi ile ilişkili olarak meydana gelen WAT genişlemesi, depoya özgü bir şekilde gerçekleşir 19,20,21,22,23. Subkütan inguinal WAT deposunun (iWAT) genişlemesi neredeyse sadece adiposit hipertrofisi yoluyla gerçekleşirken, gonadal WAT'ın (gWAT) genişlemesi hem adiposit hipertrofisi hem de hiperplazi yoluyla gerçekleşir. Obez farelerin gWAT deposu aynı zamanda önemli bir metabolik inflamasyon bölgesidir. Bu nedenle, diyete bağlı obez farelerin gWAT deposu, obezite ile bağlantılı yağ dokusu yeniden şekillenmesinin birçok özelliğini incelemek için bir modeli temsil eder.
Son birkaç yılda, APC'leri yağ depolarından prospektif olarak izole etmek için en yaygın kullanılan stratejiler, hücreleri CD29, SCA-1 ve CD34 ekspresyonu temelinde seçer (CD29+ CD34+ SCA-1+ CD31- CD45-)24,25. Bu yaklaşım, iWAT ve diğer WAT depolarından APC'lerin seçimi için yararlı olmaya devam etmektedir; bununla birlikte, gonadal WAT deposunda ve diğer karın içi depolarda, CD34 ve SCA-1 ekspresyonu APC'lerden ziyade anti-adipojenik hücrelerde zenginleştirilmiştir15,26. Buffolo ve ark. CD34'ün yüksek ekspresyonu (CD34yüksek) temelinde seçilen gWAT stromal hücrelerinin anti-adipojenik olduğunu göstererek bunun doğrudan kanıtını sağlar26. Bu nedenle, bu WAT deposundan CD34 ve SCA-1 ekspresyonuna dayalı hücre seçimi, muhtemelen FIP'leri içeren heterojen bir popülasyon verir. Bu tür anti-adipojenik hücrelerin varlığı, izole gonadal CD34 + SCA-1 + hücrelerinin, inguinal WAT deposundan25 karşılık gelen hücrelerle karşılaştırıldığında, in vitro olarak sahip olduğu bildirilen adipojenik potansiyel eksikliğini açıklayabilir. Burada tanımladığımız yaklaşım, in vitro olarak yüksek derecede adipojenik olan intraabdominal WAT APC'lerin zenginleştirilmesine izin verir. Ayrıca, lipodistrofik farelere nakledilen APC'ler ektopik bir yağ yastığıoluşturabilir 15. Stratejimiz, gWAT, mezenterik WAT ve retroperitoneal WAT15 dahil olmak üzere hem erkek hem de dişi farelerin çoklu karın içi depolarından APC'lerin izolasyonuna izin verir. Çoklu genetik soy izleme çalışmaları, HFD beslenmesi ile ilişkili olarak gWAT'ta ortaya çıkan adipositlerin, Pdgfrb (PDGFRβ proteini) eksprese eden perivasküler stromal hücrelerden kaynaklandığını göstermektedir21,23. Daha da önemlisi, obez farelerde gWAT'ın sağlığı, PDGFRβ+ hücrelerinin27 adipojenik kapasitesine bağlıdır. Bu veriler, burada açıklanan yaklaşımla izole edilen gWAT APC'lerin fizyolojik öneme sahip olduğu fikrini desteklemektedir.
Bu yaklaşımla izole edilen Gonadal WAT APC'ler, iki boyutlu kültürde birleşmeye ulaştıklarında veya hatta birleşmeden önce hızla adipositlere farklılaşır. Çoğu yerleşik preadiposit hücre hattının aksine, bu birincil APC'ler yaygın olarak kullanılan adipojenik faktörlerin eklenmesini gerektirmez (ör., deksametazon, IMBX veya PPARγ agonisti). Okuyucular, bu protokolde kullanılan ticari olarak kullanılan ITS takviyesinin yüksek düzeyde insülin içerdiğini unutmamalıdır. Ek olarak, adiposit farklılaşması farklı FBS kaynakları/lotları ile önemli ölçüde değişebilir. Farklılaşmayı destekleyen serumu bulmak için bazen birden fazla FBS'yi test etmek gerekir. Ayrıca, FBS'deki değişen endotoksin seviyeleri, APC'lerin ve FIP'lerin başlangıç proinflamatuar fenotiplerini de etkileyebilir.
FACS, APC'leri adipoz SVF'den izole etmek için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. Bu yaklaşım, hücre popülasyonlarının hassas bir şekilde ayrılmasına ve döküntü ve ölü hücrelerin uzaklaştırılmasına izin verir. Bununla birlikte, hücrelere uygulanan süre ve fiziksel stres, gen ekspresyonunu ve / veya hücresel işlevi etkileyebilir. Ayrıca, çok kanallı hücre sıralayıcılar tüm araştırmacılar için hazır olmayabilir. Burada, APC'lerin manyetik boncuk ayırma ile nasıl izole edilebileceğine dair ayrıntılar sunuyoruz. Deneyimlerimize göre, manyetik boncuk ayırma yoluyla her iki popülasyonun verimi, FACS kullanılırken gözlemlenenden daha düşüktür. Ayrıca, yukarıdaki Şekil 2'de gösterildiği gibi, bu yaklaşım bir dereceye kadar saflıktan ödün verir. Bununla birlikte, manyetik boncuk ayırma, yüksek adipojenik potansiyele sahip APC'lerin kültürlerini verir. Bu yaklaşımla izole edilen APC'nin saflığı, tekrarlanan yıkama adımlarıyla muhtemelen artabilir; Ancak, bu verimi tehlikeye atabilir. Protokoldeki kritik bir adım, biyotinile antikorların istenen veya istenmeyen hücrelerin yüzeyindeki hedef antijenlere bağlanmasıdır. Kuluçka süresi yetersizse veya antikor konsantrasyonları çok düşükse, hedef hücreler etiketlenmemiş olarak kalacaktır. Araştırmacıların izolasyonları için antikor konsantrasyonunu optimize etmeleri gerekebilir. Aynı prensip streptavidin nanosferleri ile inkübasyon için de geçerlidir. Streptavid-biyotin komplekslerinin oluşturulmaması, izolasyonun verimliliğini etkileyecektir. Araştırmacılar ayrıca her yıkama adımına daha fazla dikkat etmeli ve mıknatıstan elüatları toplarken veya atarken asılı damlacıkları lekeleme cazibesine direnmelidir; Lekelenme, istenmeyen hücre popülasyonlarından çapraz kontaminasyona neden olabilir. Pozitif bir seçim yapılırken, nanoboncukların hücre fraksiyonundan çıkarılmadığı ve mikroskop altında tespit edilebileceği unutulmamalıdır. Deneyimlerimize göre, bu boncukların varlığı, aşağı akış fonksiyonel tahlillerine müdahale etmez. Araştırmacılar, bu manyetik boncuk ayırma stratejisi altında, APC olmayan fraksiyonun heterojen kaldığını not etmelidir. Bu popülasyon çoğunlukla FIP'leri içerir (% >75 LY6C +); bununla birlikte, diğer hücre tipleri muhtemelen mevcuttur (örneğin, CD9 + mezotelyal hücreler). Bu nedenle, burada sunulan manyetik boncuk ayırma protokolü, amaç APC'leri basitçe izole etmek olduğunda ve FACS makineleri hazır olmadığında veya maliyet engelleyici olmadığında belki de en kullanışlıdır.
Araştırmacılar, burada açıklanan genel sıralama stratejilerinde önemli sınırlamalara da dikkat etmelidir. Her şeyden önce, burada tarif ettiğimiz protokoller şu anda sadece farelerin karın içi WAT depoları için geçerlidir. Farelerde deri altı iWAT deposu PDGFRβ+ adipoz progenitörleri içerir; bununla birlikte, LY6C ekspresyonu, bu depo27 içindeki işlevsel olarak farklı progenitör alt popülasyonlar arasında kolayca ayrım yapmaz. Okuyucular, Merrick ve ark. ve Church ve ark. APC'leri bu depodan izole etmek için protokoller için16,25. Bu sıralama stratejisinin fonksiyonel APC'leri sıçanlardan izole edip edemeyeceğini henüz test etmedik. Ayrıca, insanlarda LY6C için belirgin bir ortolog olmadığı belirtilmelidir28. Bu nedenle, insan APC'leri bu belirteçlere göre sıralanamaz. İnsan adipoz stromal hücrelerinin son tek hücreli dizileme çalışmaları, farklı progenitör popülasyonları insan dokularından izole etmek için yeni stratejilere yol açabilir29. İkincisi, hücrelerin in vitro kullanımında sınırlamalar vardır. FIP'ler oldukça proliferatiftir ve birkaç geçiş için yayılabilir ve işlevsel özelliklerini koruyabilir; bununla birlikte, APC'ler geçişle birlikte adipojenik potansiyellerini önemli ölçüde kaybederler. Bu, yüksek hücre sayıları gerektiren biyokimyasal tahliller yapmayı veya gen ekspresyonunu manipüle etmeyi (örneğin, CRISPR / Cas9 veya RNA girişimi) hedefleyenler için teknik bir zorluk sağlar. Bizim görüşümüze göre, amaç doğrudan hayvan modellerinin karın içi WAT depolarından türetilen doğal APC'lerin ve/veya FIP'lerin sıklığını ve özelliklerini karşılaştırmak olduğunda yaklaşımımız çok uygundur (örneğin, kontrol ve deney hayvanlarında APC frekansı; erkek ve dişi progenitörlerin karşılaştırılması; diyetin, yaşın vb. progenitör sıklığı ve özellikleri üzerindeki etkisi). Bu farklı hücre popülasyonlarını izole bir şekilde inceleme yeteneği, farelerde adipogenezi ve yağ dokusunun yeniden şekillenmesini düzenleyen moleküler mekanizmaları inceleme girişimlerine büyük ölçüde yardımcı olmalıdır.

Beyaz yağ dokusu (WAT), memelilerde enerji depolamanın ana bölgesini temsil eder. Bu doku içinde, adipositler veya "yağ hücreleri", büyük tek gözlü lipid damlacıkları halinde paketlenmiş trigliserit formunda fazla kaloriyi depolar. Ayrıca, adipositler, enerji homeostazınınçeşitli yönlerini düzenleyen çok sayıda faktör salgılar 1,2,3. Adipositler, WAT hacminin büyük kısmını oluşturur; bununla birlikte, adipositler, WAT 4,5'te bulunan toplam hücrelerin yalnızca %50'sinden daha azını temsil eder. WAT'ın adiposit olmayan bölmesi veya stromal-vasküler fraksiyon (SVF) oldukça heterojendir ve vasküler endotel hücreleri, dokuda yerleşik bağışıklık hücreleri, fibroblastlar ve adiposit öncü hücre (APC) popülasyonlarını içerir.
WAT, enerji depolama talebi arttıkça boyut olarak genişleme konusundaki olağanüstü kapasitesi açısından olağanüstüdür. Bu doku plastisitesinin korunması önemlidir, çünkü lipitlerin WAT'ta yeterli depolanması, adipoz olmayan dokulara zararlı ektopik lipid birikimine karşı koruma sağlar6. Bireysel WAT depolarının kalori fazlalığına yanıt olarak bu genişlemeye maruz kalma şekli, obezite ortamında insülin duyarlılığının kritik bir belirleyicisidir7. Metabolik sendromlu obez bireylerde gözlenen patolojik WAT genişlemesi, metabolik olarak uygun deri altı yağ dokusu pahasına viseral WAT depolarının tercihli genişlemesi ile karakterizedir. Ayrıca, obezitede insülin direnci, WAT'ın patolojik yeniden şekillenmesi ile ilişkilidir. Bu, mevcut adipositlerin hipertrofik büyümesi (boyutta artış), yetersiz anjiyogenez, kronik metabolik inflamasyon, hücre dışı matris bileşenlerinin birikimi (fibroz) ve doku hipoksisiile karakterizedir 8,9. Obezitenin bu WAT fenotipleri, lipodistrofi durumunda gözlenene benzer şekilde hepatik steatoz ve insülin direnci ile ilişkilidir (fonksiyonel WAT yokluğu). Buna karşılık, metabolik olarak sağlıklı obez popülasyonda sağlıklı WAT genişlemesi gözlenir ve koruyucu deri altı WAT'ın tercihli genişlemesi ve adiposit hiperplazisi10 yoluyla depo genişlemesi ile karakterize edilir. Yeni adipositlerin alımına, adiposit öncü hücrelerinden (APC'ler) ("adipogenez" olarak adlandırılır) de novo adiposit farklılaşması aracılık eder. Adiposit hiperplazisi, nispeten daha düşük derecelerde WAT fibrozu ve metabolik inflamasyon ile çakışır 6,11. WAT mikro çevresindeki çok sayıda hücre tipi, obezitede WAT'ın sağlığını ve genişletilebilirliğini doğrudan etkiler12. Bu nedenle, WAT'ta bulunan çeşitli hücre tiplerinin işlevini tanımlamak, alan için yüksek bir öncelik olmaya devam etmektedir.
Son on yılda, yerel APC'leri insan ve fare WAT SVF13'ten tanımlamak ve izole etmek için çeşitli stratejiler kullanılmıştır. Bu tür stratejiler, antikor bazlı hücre ayırma teknikleri kullanarak ortak mezenkimal kök / progenitör hücre belirteçlerinin hücre yüzeyi ekspresyonuna dayalı olarak APC'leri izole eder. Bu yaklaşımlar, florofor işaretli antikorlar kullanılarak floresanla aktive edilen hücre sınıflandırmasını (FACS) veya immünomanyetik boncuk ayrımını (yani kimyasal olarak modifiye edilmiş antikorlar) içerir. APC'lerin izolasyonu için hedeflenen hücre yüzey proteinleri arasında PDGFRα, PDGFRβ, CD34 ve SCA-1 bulunur. Bu yaklaşımlar APC'ler için zenginleştirmeye yardımcı oldu; Bununla birlikte, bu belirteçlere dayalı olarak izole edilen hücre popülasyonları oldukça heterojendir. Çok yeni tek hücreli RNA dizileme (scRNA-dizilimi) çalışmaları, murin WAT14,15,16,17'nin izole edilmiş stromal-vasküler fraksiyonu (SVF) içindeki stromal hücrelerin moleküler ve fonksiyonel heterojenliğini vurgulamıştır. Kendi scRNA-seq ve fonksiyonel analizlerimizden, yetişkin farelerde intraabdominal WAT'ın stromal bölmesinde fonksiyonel olarak farklı bağışıklık modüle edici ve adipojenik PDGFRβ+ perivasküler hücre alt popülasyonlarını tanımladık ve karakterize ettik15. Fibro-inflamatuar öncüler veya FIP'ler, PDGFRβ+ hücrelerinin belirgin bir alt popülasyonunu temsil eder ve LY6C ekspresyonuna (LY6C + PDGFRβ+ hücreleri) dayalı olarak izole edilebilir15. FIP'ler adipojenik kapasiteden yoksundur, çeşitli uyaranlara güçlü bir pro-inflamatuar yanıt verir, kollajen üretir ve anti-adipojenik faktörler salgılar15. Bu hücrelerin pro-enflamatuar ve fibrojenik aktivitesi, farelerde obezite ile ilişkili olarak artar ve bu hücreleri WAT yeniden şekillenmesinin düzenleyicileri olarak gösterir. LY6C- CD9- PDGFRβ+ alt popülasyonu, adiposit öncü hücrelerini (APC'ler) temsil eder. Bu APC'ler, Pparg ve diğer pro-adipojenik genlerin ekspresyonu ile zenginleştirilir ve in vitro ve in vivo15 olarak olgun adipositlere kolayca farklılaşır. Burada, bu farklı hücre popülasyonlarının FACS kullanılarak yetişkin farelerin karın içi WAT depolarından izolasyonu ve biyotinile antikorlarla immünomanyetik boncuk ayrımı için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, yetişkin erkek ve dişi farelerin birden fazla karın içi WAT deposundan fonksiyonel olarak farklı adipoz progenitör alt popülasyonları izole etmek için kullanılabilir15. Bu fonksiyonel olarak farklı hücre popülasyonlarını izole edilmiş olarak incelemek, sağlık ve hastalıkta adipogenezi ve intraabdominal yağ dokusunun yeniden şekillenmesini düzenleyen moleküler mekanizmalar hakkındaki mevcut anlayışımıza büyük katkı sağlayabilir.
Aşağıdaki protokol, murin epididimal WAT'tan adipoz progenitörlerin izolasyonunu detaylandırmaktadır; bununla birlikte, aynı prosedür, hem erkek hem de dişi farelerin mezenterik ve retroperitoneal WAT depolarından karşılık gelen hücreleri izole etmek için kullanılabilir15. Farelerde bu depoların nasıl tanımlanacağı ve izole edileceğine dair ayrıntılı bir protokol Bagchi ve ark.18'de bulunabilir. Bu protokol, 6-8 haftalık farelerin kullanımı için optimize edilmiştir. APC'lerin sıklığı ve farklılaşma kapasitesi yaşlanma ile ilişkili olarak azalabilir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mechanical Tissue Preparation and SVF Isolation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 and 100 &#181;m cell strainers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352340/352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21040CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml polypropylene tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digestion Buffer (for 10mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml HBSS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mg Collagenase D (1 mg/ml final cc.)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11088882001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.15 g BSA (1.5 % final cc.)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1605-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunomagnetic separation of APCs and non-APCs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5X MojoSort Buffer (MS buffer)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>480017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml MojoSort Magnet (MS magnet)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>480019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;L MojoSort Streptavidin Nanobeads</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>480015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purity Check and FACS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Red Blood Cell Lysis Buffer</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-4300-54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc block (Mouse CD16/CD32)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>553141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin CD45</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>103103</td>
			<td>Concentration: &#8804; 0.25 &#181;g per 10^6 cells 
			Species: Mouse 
			Clone: 30-F11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin CD31</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>102503</td>
			<td>Concentration: &#8804; 0.25 &#181;g per 10^6 cells 
			Species: Mouse 
			Clone: MEC13.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin CD9</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>124803</td>
			<td>Concentration: &#8804; 0.25 &#181;g per 10^6 cells 
			Species: Mouse 
			Clone: MZ3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin LY6C</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>128003</td>
			<td>Concentration: &#8804; 0.25 &#181;g per 10^6 cells 
			Species: Mouse 
			Clone: HK1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31-PerCP/Cy5.5</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>102419</td>
			<td>Concentration: Dilution 1:400 
			Species: Mouse 
			Clone: 390</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45-PerCP/Cy5.5</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>103131</td>
			<td>Concentration: Dilution 1:400 
			Species: Mouse 
			Clone: 30-F11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD140b PDGFR&#946;-PE</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>136006</td>
			<td>Concentration: Dilution 1:50 
			Species: Mouse 
			Clone: APB5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LY6C-APC</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>128016</td>
			<td>Concentration: Dilution 1:400 
			Species: Mouse 
			Clone: HK1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD9-FITC</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>124808</td>
			<td>Concentration: Dilution 1:400 
			Species: Mouse 
			Clone: MZ3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture and Differentiation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gonadal APC Culture media (for 500mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>288 mL DMEM with 1 g/L glucose</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-014-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>192 mL MCDB201</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Fetal bovine serum (FBS)** lot#14E024</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>12303C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL 100% ITS premix</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>354352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL 10 mM L-ascorbic acid-2-2phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8960-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 &#181;L 100 g/ml FGF-basic</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>3139-FB-025/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Pen/Strep</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-001-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 &#181;L Gentamycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>**NOTE: The adipogenic capacity of primary APCs can vary from lot to lot of commercial FBS. Multiple lots/sources of FBS should be tested.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of adipogenic and fibro-inflammatory stromal cell subpopulations from murine intra-abdominal adipose depots

Beyaz yağ dokusunun (WAT) stromal-vasküler fraksiyonu (SVF) oldukça heterojendir ve yetişkinlikte WAT'ın genişlemesine ve yeniden şekillenmesine işlevsel olarak katkıda bulunan çok sayıda hücre tipinden oluşur. Bu hücresel heterojenliğin etkilerini incelemenin önündeki muazzam bir engel, in vitro ve in vivo analizler için işlevsel olarak farklı hücre alt popülasyonlarını WAT SVF'den kolayca izole edememektir. Tek hücreli dizileme teknolojisi, son zamanlarda yetişkin farelerin karın içi WAT depolarında fonksiyonel olarak farklı fibro-inflamatuar ve adipojenik PDGFRβ+ perivasküler hücre alt popülasyonlarını tanımlamıştır. Fibro-inflamatuar progenitörler ("FIP'ler" olarak adlandırılır), proinflamatuar bir fenotip uygulayabilen adipojenik olmayan kollajen üreten hücrelerdir. PDGFRβ+ adiposit öncü hücreleri (APC'ler), hücre transplantasyonu üzerine hem in vitro hem de in vivo olarak oldukça adipojeniktir. Burada, bu stromal hücre alt popülasyonlarının murin intraabdominal WAT depolarından izolasyonu için birden fazla yöntem tanımlanmıştır. FIP'ler ve APC'ler, floresanla aktive edilen hücre sınıflandırması (FACS) ile veya biyotinile antikor bazlı immünomanyetik boncuk teknolojisinden yararlanılarak izole edilebilir. İzole edilmiş hücreler moleküler ve fonksiyonel analiz için kullanılabilir. Stromal hücre alt popülasyonunun fonksiyonel özelliklerini izole olarak incelemek, hücresel düzeyde fizyolojik veya patolojik koşullar altında yağ dokusunun yeniden şekillenmesi hakkındaki mevcut bilgilerimizi genişletecektir.

Bu protokol, yetişkin farelerin karın içi WAT depolarından farklı stromal hücre popülasyonlarının izolasyonuna izin veren iki stratejiyi tanımlar. APC'ler ve FIP'ler, FACS (Şekil 1) veya biyotinile antikorlarla immünomanyetik boncuk ayırma (Şekil 2) ile izole edilebilir. Her iki yaklaşım da ticari olarak temin edilebilen reaktifleri ve antikorları kullanır. İmmünomanyetik boncuk ayrımı, gWAT SVF'den adipojenik olmayan hücrelerden adipojenik hücrelerin ayrılmasına yol açar. Akış sitometri analizi, adipojenik fraksiyon içindeki hücrelerin %75'inin LY6C-CD9-APC'leri temsil ettiğini gösterdi. Adipojenik olmayan fraksiyonun% >75'i FIP'leri (LY6C + hücreleri) temsil etti.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61610/61610fig01.jpg"> Şekil 1: PDGFR β + stromal hücre alt popülasyonlarının gonadal WAT'tan FACS ile izolasyonu. (A) Prosedürün şematik genel bakışı: Stromal vasküler fraksiyon (adiposit olmayan hücreler), enzimatik doku sindirimi ve santrifüjleme ile olgun adipositlerden ayrıldı. Floresanla aktive edilen hücre sınıflandırması (FACS) daha sonra endotelyal (CD31+) ve hematopoietik (CD45+) soy hücrelerini çıkarmak ve LY6C+ PDGFRβ+ hücrelerini (FIP'ler) ve LY6C-CD9-PDGFRβ+ hücrelerini (APC'ler) izole etmek için kullanıldı. (B) Temsili FACS toplama kapıları. Panel A, ref.11'den izin alınarak çoğaltılmıştır. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61610/61610fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61610/61610fig02.jpg"> Şekil 2: Adipojenik ve adipojenik olmayan stromal hücrelerin immünomanyetik boncuk ayırma ile ayrılması. (A) Prosedürün şematik genel bakışı: Adım 1: CD31 + ve CD45 + hücreleri mıknatısa bağlanır. Bu, hem endotelyal hem de hematopoietik soy hücrelerini ortadan kaldırır. CD31- ve CD45- hücreleri içeren elüat toplandı ve daha sonra sırasıyla LY6C ve CD9'u tanıyan antikorlarla inkübe edildi. Adım 2: CD9 + ve LY6C + hücreleri mıknatısa bağlanır. Adım 3: CD9- ve LY6C- hücrelerini içeren süpernatan (bağlanmamış fraksiyon), adipojenik fraksiyonu (APC'ler) temsil ettiği için toplandı. Nanosferlere bağlı adipojenik olmayan CD9 + ve LY6C + hücreleri, FIP'leri içeren APC olmayan fraksiyon olarak ayrıştırıldı. (B) Sırasıyla adipojenik ve adipojenik olmayan fraksiyonlar içinde APC'lerin (LY6C-CD9-) ve FIP'lerin (LY6C +) sıklığını değerlendirmek için akış sitometrisi analizi. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61610/61610fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Işık mikroskobu ve gen ekspresyon analizi, 6-8 haftalık farelerin FAC'leri veya gWAT'tan manyetik boncuk ayrılması yoluyla izole edilen APC'lerin, Gonadal APC Kültür ortamında hücrelerin ilk kaplamasını takip eden 7-10 gün içinde lipid içeren adipositlere yüksek derecede farklılaştığını göstermektedir (Şekil 3). Buna karşılık, adipojenik olmayan öncüller (fibro-inflamatuar öncüler veya FIP'ler gibi) fibroblast benzeri kaldı ve aynı kültür ortamında (Gonadal APC Kültür Ortamı) tutulduğunda adiposithaline gelmedi (Şekil 3). APC olmayan kültürlerdeki az sayıda hücrenin bir miktar lipid birikimi gösterdiğine dikkat edilmelidir (Şekil 3D). Bunlar muhtemelen hücre izolasyonu sırasında APC kontaminasyonundan kaynaklanmaktadır. Ek yıkamalar bu fraksiyonun saflığını artırabilir.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61610/61610fig03.jpg"> Şekil 3: Yetişkin farelerin gWAT'ından izole edilen PDGFR β + stromal hücre popülasyonlarının in vitro farklılaşması. (İ.Ö.) 6-8 haftalık fare gWAT SVF'den immünomanyetik boncuk ayırma (AB) veya FACS (CD) ile izole edilen farklılaşmış stromal hücre alt popülasyonlarının temsili parlak alan görüntüleri. Görüntüler, hücrelerin Gonadal APC Kültür Ortamında kaplanmasından yedi gün sonra çekildi. Kaplamadan sonraki 7-10 gün içinde APC'ler spontan adiposit farklılaşmasına uğrar. Büyütme 10X. Ölçek = 250 μM. (E-F) A-D'de gösterilen diferansiye kültürlerde adiposit seçici genlerin mRNA seviyeleri. Çubuk grafikler ortalama + <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61610/61610fig03large.jpg" target="_blank">SEM'i temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Fıps</td>
			<td>Zenginleştirilmiş Genler (APC'lere karşı)</td>
			<td colspan="2">İleri Astar 5'-3'</td>
			<td colspan="2">Ters Astar 5'-3'</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>Ly6c1</td>
			<td colspan="2">ACTGTGCCTGCAACCTTGTCT</td>
			<td colspan="2">GGCCACAAGAAGAAGAATGAGCAC</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>CD9 (İngilizce)</td>
			<td colspan="2">GCGGGAAACACTCAAAGCCAT</td>
			<td colspan="2">AAAGCTGTTTCTTGGGGCAGG</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>Kasım</td>
			<td colspan="2">GTTCCAAGAGCTGTGGAATGG</td>
			<td colspan="2">CTCTTGTTCACAAGGCCGAAC</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>Efhd1</td>
			<td colspan="2">GGCCGCTCTAAGGTCTTCAAT</td>
			<td colspan="2">GTCAATAAAGCCGTCCCTTCC</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>Stmn4</td>
			<td colspan="2">ACCTGAACTGGTGCGTCATCT</td>
			<td colspan="2">CTTGGGAGGGAGGCATTAAAC</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>Dact2 (İngilizce)</td>
			<td colspan="2">AGCCCCCTAAAGGAAGAAACC</td>
			<td colspan="2">GGTCCTTGGCCACAGTCATTA</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>Il33</td>
			<td colspan="2">ATTTCCCCGGCAAAGTTCAG</td>
			<td colspan="2">AACGGAGTCTCATGCAGTAGA</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>Ccl2</td>
			<td colspan="2">CCACAACCTCAAGCACTTC</td>
			<td colspan="2">AAGGCATCACAGTCCGAGTCAC</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>Tgfb2</td>
			<td colspan="2">GGTGTTGTTCCACAGGGGTTA</td>
			<td colspan="2">CGGTCCTTCAGATCCTCCTTT</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>Fn1</td>
			<td colspan="2">GAGAGCACACCCGTTTTCATC</td>
			<td colspan="2">GGGTCCACATGATGGTGACTT</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>DPP4 (DPP4)</td>
			<td colspan="2">TGGTGGATGCTGGTGTGTATT</td>
			<td colspan="2">AAGGGGCCTCTCTTCTCTTCCT</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>Thy1</td>
			<td colspan="2">TCTTCTTTCCCTTGCCTCTG</td>
			<td colspan="2">AGGTTGCAAGACTCTCGCTGT</td>
		</tr><tr><td colspan="6"></td>
		</tr><tr><td>APC'ler</td>
			<td>Zenginleştirilmiş Genler (FIP'lere karşı)</td>
			<td colspan="2">İleri Astar 5'-3'</td>
			<td colspan="2">Ters Astar 5'-3'</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>Agt</td>
			<td colspan="2">GTTCTGGGCAAAACTCAGTGC</td>
			<td colspan="2">GAGGCTCTGCTGCTCATCATT</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>Cxcl14</td>
			<td colspan="2">TGGACGGGTCCAAGTGTAAGT</td>
			<td colspan="2">TCCTCGCAGTGTGGGTACTTT</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>Mmd2</td>
			<td colspan="2">ATCTGGGAGCTGATGACAGGA</td>
			<td colspan="2">AGTGGGTACCAGCACCAAATG</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>PDE11a</td>
			<td colspan="2">CGAGCTTGTCAGGAAAGGAGA</td>
			<td colspan="2">TTCAGCCACCTGTCTGGAGAT</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>Lrn1</td>
			<td colspan="2">CAACATGGGAGAGCTGGTTTC</td>
			<td colspan="2">GCACACTACGGAAAGCCAAAC</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>Pparg (Panor)</td>
			<td colspan="2">GCATGGTGCCTTCGCTGA</td>
			<td colspan="2">TGGCATCTCTGTGTCAACCATG</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>Fabp4</td>
			<td colspan="2">ACTGGGCGTGGAATTCGATGA</td>
			<td colspan="2">ACCAGCTTGTCACCATCTCGT</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>Lpl</td>
			<td colspan="2">CATCGAGAGAGGATCCGAGTGAA</td>
			<td colspan="2">TGCTGAGTCCTTTCCCTTCTG</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>Cd36 (İngilizce)</td>
			<td colspan="2">GAGTTGGCGAGAAAACCAGTG</td>
			<td colspan="2">GAGAATGCCTCCAAACACAGC</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 1: FIP'lerin ve APC'lerin izolasyonunu doğrulamak için kullanılan qPCR primer dizileri

Read this Scientific Article Protocol about Isolation of Adipogenic and Fibro-Inflammatory Stromal Cell Subpopulations from Murine Intra-Abdominal Adipose Depots at JoVE.com

Isolation of Adipogenic and Fibro-Inflammatory Stromal Cell Subpopulations from Murine Intra-Abdominal Adipose Depots

Bu protokol, adipojenik ve fibro-inflamatuar stromal hücre alt popülasyonlarını murin karın içi beyaz yağ dokusu (WAT) depolarından floresanla aktive edilen hücre sınıflandırması veya immünmanyetik boncuk ayırma yoluyla izole etmek için teknik yaklaşımı açıklar.

Murin İntraabdominal Yağ Depolarından Adipojenik ve Fibroinflamatuar Stromal Hücre Alt Popülasyonlarının İzolasyonu

The stromal-vascular fraction (SVF) of white adipose tissue (WAT) is remarkably heterogeneous and consists of numerous cell types that contribute ...

isolation-adipogenic-fibro-inflammatory-stromal-cell-subpopulations

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

2.5K Görüntüleme.  Novo Nordisk A/S. Bu protokol, adipojenik ve fibro-inflamatuar stromal hücre alt popülasyonlarını murin karın içi beyaz yağ dokusu (WAT) depolarından floresanla aktive edilen hücre sınıflandırması veya immünmanyetik boncuk ayırma yoluyla izole etmek için teknik yaklaşımı açıklar.

Video: Isolation of Adipogenic and Fibro-Inflammatory Stromal Cell Subpopulations from Murine Intra-Abdominal Adipose Depots

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for isolating precursor B-cells at four different stages of differentiation. Because genes are expressed and epigenetic modifications occur in a tissue specific manner, it is vital to discriminate between tissues and cell types in order to be able to identify alterations in the genome and the epigenome that may lead to the development of disease. This method can be adapted to any type of cell present in umbilical cord blood at any stage of differentiation.	
This method comprises 4 main steps. First, mononuclear cells are separated by density centrifugation. Second, B-cells are enriched using biotin conjugated antibodies that recognize and remove non B-cells from the mononuclear cells. Third the B-cells are fluorescently labeled with cell surface protein antibodies specific to individual stages of B-cell development. Finally, the fluorescently labeled cells are sorted and individual populations are recovered. The recovered cells are of sufficient quantity and quality to be utilized in downstream nucleic acid assays.

Here we describe a protocol for isolating subsets of precursor B-cells from umbilical cord blood. A sufficient quantity and quality of nucleic acids may be extracted from the cells and used in subsequent assays utilizing DNA or RNA.

Kordon Kanı gelen Prekürsör B-hücreli altkümeleri İzolasyonu

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Isolation of Adipose Tissue Immune Cells

The discovery of increased macrophage infiltration in the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an intensification of interest in immune cell contribution to local and systemic insulin resistance. Isolation and quantification of different immune cell populations in lean and obese AT is now a commonly utilized technique in immunometabolism laboratories; yet extreme care must be taken both in stromal vascular cell isolation and in the flow cytometry analysis so that the data obtained is reliable and interpretable. In this video we demonstrate how to mince, digest, and isolate the immune cell-enriched stromal vascular fraction. Subsequently, we show how to antibody label macrophages and T lymphocytes and how to properly gate on them in flow cytometry experiments. Representative flow cytometry plots from low fat-fed lean and high fat-fed obese mice are provided. A critical element of this analysis is the use of antibodies that do not fluoresce in channels where AT macrophages are naturally autofluorescent, as well as the use of proper compensation controls.

Adipose tissue (AT) is a site of intense immune cell activation and interaction. Almost all cells of the immune system are present in AT and their ratios are altered by obesity. Proper isolation, quantification, and characterization of AT immune cell populations are critical for understanding their role in immunometabolic disease.

Yağ Doku Bağışıklık Hücre İzolasyonu

The discovery of increased macrophage infiltration in  the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an  intensification of interest in ...

Isolation of Cortical Microglia with Preserved Immunophenotype and Functionality From Murine Neonates

Isolation of microglia from CNS tissue is a powerful investigative tool used to study microglial biology ex vivo. The present method details a procedure for isolation of microglia from neonatal murine cortices by mechanical agitation with a rotary shaker. This microglia isolation method yields highly pure cortical microglia that exhibit morphological and functional characteristics indicative of quiescent microglia in normal, nonpathological conditions in vivo. This procedure also preserves the microglial immunophenotype and biochemical functionality as demonstrated by the induction of morphological changes, nuclear translocation of the p65 subunit of NF-&#954;B (p65), and secretion of the hallmark proinflammatory cytokine, tumor necrosis factor-&#945; (TNF-&#945;), upon lipopolysaccharide (LPS) and Pam3CSK4 (Pam) challenges. Therefore, the present isolation procedure preserves the immunophenotype of both quiescent and activated microglia, providing an experimental method of investigating microglia biology in ex vivo conditions.

One key to successful investigation of microglial biology is the preservation of microglial immunofunction ex vivo during isolation from CNS tissue. Isolating microglia via rotary shaking results in highly pure and immunofunctional cell cultures as assessed by fluorescent imaging, immunocytochemistry, and ELISA following microglia activation with the proinflammatory stimuli lipopolysaccharide (LPS) and Pam3CSK4 (Pam).

Kemirgen Yenidoğan itibaren Korunan immunfenotipine ve İşlevselliği ile Kortikal mikrogliya İzolasyonu

Isolation of microglia from CNS tissue is a powerful investigative tool used to study microglial biology ex vivo. The present method details a procedure ...

Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and differentiation of lymphocytes. Various stromal cell subsets have been identified by the expression of the adhesion molecule CD31 and glycoprotein podoplanin (gp38), T zone reticular cells or fibroblastic reticular cells, lymphatic endothelial cells, blood endothelial cells and FRC-like pericytes within the double negative cell population. For all populations different functions are described including, separation and lining of different compartments, attraction of and interaction with different cell types, filtration of the draining fluidics and contraction of the lymphatic vessels. In the last years, different groups have described an additional role of stromal cells in orchestrating and regulating cytotoxic T cell responses potentially dangerous for the host. 
Lymph nodes are complex structures with many different cell types and therefore require a appropriate procedure for isolation of the desired cell populations. Currently, protocols for the isolation of lymph node stromal cells rely on enzymatic digestion with varying incubation times; however, stromal cells and their surface molecules are sensitive to these enzymes, which results in loss of surface marker expression and cell death. Here a short enzymatic digestion protocol combined with automated mechanical disruption to obtain viable single cells suspension of lymph node stromal cells maintaining their surface molecule expression is proposed.

Isolation of lymph node stromal cells is a multistep procedure including enzymatic digestion and mechanical disaggregation to obtain fibroblastic reticular cells, lymphatic and blood endothelial cells. In the described procedure, a short digestion is combined with automated mechanical disaggregation to minimize surface marker degradation of viable lymph node stromal cells.

Kemirgen Lenf Düğümü Stromal Hücrelerinin İzolasyonu

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and ...

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing fetus. This tolerance is initiated during coitus, established during fecundation and implantation, and maintained throughout pregnancy. Active cellular and molecular mediators of maternal-fetal tolerance are enriched at the site of contact between fetal and maternal tissues, known as the maternal-fetal interface, which includes the placenta and the uterine and decidual tissues. This interface is comprised of stromal cells and infiltrating leukocytes, and their abundance and phenotypic characteristics change over the course of pregnancy. Infiltrating leukocytes at the maternal-fetal interface include neutrophils, macrophages, dendritic cells, mast cells, T cells, B cells, NK cells, and NKT cells that together create the local micro-environment that sustains pregnancy. An imbalance among these cells or any inappropriate alteration in their phenotypes is considered a mechanism of disease in pregnancy. Therefore, the study of leukocytes that infiltrate the maternal-fetal interface is essential in order to elucidate the immune mechanisms that lead to pregnancy-related complications. Described herein is a protocol that uses a combination of gentle mechanical dissociation followed by a robust enzymatic disaggregation with a proteolytic and collagenolytic enzymatic cocktail to isolate the infiltrating leukocytes from the murine tissues at the maternal-fetal interface. This protocol allows for the isolation of high numbers of viable leukocytes (&#62;70%) with sufficiently conserved antigenic and functional properties. Isolated leukocytes can then be analyzed by several techniques, including immunophenotyping, cell sorting, imaging, immunoblotting, mRNA expression, cell culture, and in vitro functional assays such as mixed leukocyte reactions, proliferation, or cytotoxicity assays.

Described herein is a protocol to isolate and analyze the infiltrating leukocytes of tissues at the maternal-fetal interface (uterus, decidua, and placenta) of mice. This protocol maintains the integrity of most cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications including flow cytometry analysis.

Maternal Fetal Arayüz at Fare Dokular lökosit İzolasyonu

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

Isolation, Expansion, and Adipogenic Induction of CD34+CD31+ Endothelial Cells from Human Omental and Subcutaneous Adipose Tissue

Obesity is accompanied by an extensive remodeling of adipose tissue primarily via adipocyte hypertrophy. Extreme adipocyte growth results in a poor response to insulin, local hypoxia, and inflammation. By stimulating the differentiation of functional white adipocytes from progenitors, radical hypertrophy of the adipocyte population can be prevented and, consequently, the metabolic health of adipose tissue can be improved along with a reduction of inflammation. Also, by stimulating a differentiation of beige/brown adipocytes, the total body energy expenditure can be increased, resulting in weight loss. This approach could prevent the development of obesity co-morbidities such as type 2 diabetes and cardiovascular disease.
This paper describes the isolation, expansion, and differentiation of white and beige adipocytes from a subset of human adipose tissue endothelial cells that co-express the CD31 and CD34 markers. The method is relatively cheap and is not labor-intensive. It requires access to human adipose tissue and the subcutaneous depot is suitable for sampling. For this protocol, fresh adipose tissue samples from morbidly obese subjects [body mass index (BMI) &#62;35] are collected during bariatric surgery procedures. Using a sequential immunoseparation from the stromal vascular fraction, enough cells are produced from as little as 2&#8211;3 g of fat. These cells can be expanded in culture over 10&#8211;14 days, can be cryopreserved, and retain their adipogenic properties with passaging up to passage 5&#8211;6. The cells are treated for 14 days with an adipogenic cocktail using a combination of human insulin and the PPAR&#947; agonist-rosiglitazone.
This methodology can be used for obtaining proof of concept experiments on molecular mechanisms that drive adipogenic responses in adipose endothelial cells, or for screening new drugs that can enhance the adipogenic response directed either towards white or beige/brown adipocyte differentiation. Using small subcutaneous biopsies, this methodology can be used to screen out non-responder subjects for clinical trials aimed to stimulate beige/brown and white adipocytes for the treatment of obesity and co-morbidities.

The differentiation of white and beige adipocytes from adipose tissue vascular progenitors bears potential for metabolic improvement in obesity. We describe protocols for a CD34+CD31+ endothelial cell isolation from human fat and for a subsequent in vitro expansion and differentiation into white and beige adipocytes. Several downstream applications are discussed.

Yalıtım, genişleme ve Adipojenik indüksiyon CD34 + CD31 + insan Omental ve deri altı yağ dokusu endotel hücrelerden

Obesity is accompanied by an extensive remodeling of adipose tissue primarily via adipocyte hypertrophy. Extreme adipocyte growth results in a poor ...

Isolation of Extracellular Vesicles from Murine Bronchoalveolar Lavage Fluid Using an Ultrafiltration Centrifugation Technique

Extracellular vesicles (EVs) are newly discovered subcellular components that play important roles in many biological signaling functions during physiological and pathological states. The isolation of EVs continues to be a major challenge in this field, due to limitations intrinsic to each technique. The differential ultracentrifugation with density gradient centrifugation method is a commonly used approach and is considered to be the gold standard procedure for EV isolation. However, this procedure is time-consuming, labor-intensive, and generally results in low scalability, which may not be suitable for small-volume samples such as bronchoalveolar lavage fluid. We demonstrate that an ultrafiltration centrifugation isolation method is simple and time- and labor-efficient yet provides a high recovery yield and purity. We propose that this isolation method could be an alternative approach that is suitable for EV isolation, particularly for small-volume biological specimens.

Here, we describe two extracellular vesicle isolation protocols, ultrafiltration centrifugation and ultracentrifugation with density gradient centrifugation, to isolate extracellular vesicles from murine bronchoalveolar lavage fluid samples. The extracellular vesicles derived from murine bronchoalveolar lavage fluid by both methods are quantified and characterized.

Üzerinden Ultrafiltrasyon tekniği Santrifüjü kullanarak fare Bronchoalveolar lavaj sıvı ekstrasellüler veziküller yalıtım

Extracellular vesicles (EVs) are newly discovered subcellular components that play important roles in many biological signaling functions during ...

Simultaneous Study of the Recruitment of Monocyte Subpopulations Under Flow In Vitro

The recruitment of monocytes from the blood to targeted peripheral tissues is critical to the inflammatory process during tissue injury, tumor development and autoimmune diseases. This is facilitated through a process of capture from free flow onto the luminal surface of activated endothelial cells, followed by their adhesion and transendothelial migration (transmigration) into the underlying affected tissue. However, the mechanisms that support the preferential and context-dependent recruitment of monocyte subpopulations are still not fully understood. Therefore, we have developed a method that allows the recruitment of different monocyte subpopulations to be simultaneously visualized and measured under flow. This method, based on time-lapse confocal imaging, allows for the unambiguous distinction between adherent and transmigrated monocytes. Here, we describe how this method can be used to simultaneously study the recruitment cascade of pro-angiogenic and non-angiogenic monocytes in vitro. Furthermore, this method can be extended to study the different steps of recruitment of up to three monocyte populations.

Here, we present an integrated protocol that measures monocyte subpopulation trafficking under flow in vitro by use of specific surface markers and confocal fluorescence microscopy. This protocol can be used to explore sequential recruitment steps as well as to profile other leukocyte subtypes using other specific surface markers.

Monosit altgrupları Vitro akışında altında alımı eş zamanlı çalışma

The recruitment of monocytes from the blood to targeted peripheral tissues is critical to the inflammatory process during tissue injury, tumor development ...

Isolation of Single Intracellular Bacterial Communities Generated from a Murine Model of Urinary Tract Infection for Downstream Single-cell Analysis

In this article, we outline a procedure used to isolate individual intracellular bacterial communities from a mouse that has been experimentally infected in the urinary tract. The protocol can be broadly divided into three sections: the infection, bladder epithelial cell harvesting, and mouth micropipetting to isolate individual infected epithelial cells. The isolated epithelial cell contains viable bacterial cells and is nearly free of contaminating extracellular bacteria, making it ideal for downstream single-cell analysis. The time taken from the start of infection to obtaining a single intracellular bacterial community is about 8 h. This protocol is inexpensive to deploy and uses widely available materials, and we anticipate that it can also be utilized in other infection models to isolate single infected cells from cell mixtures even if those infected cells are rare. However, due to a potential risk in mouth micropipetting, this procedure is not recommended for highly infectious agents.

This protocol describes a simple method of isolating single, infected-bladder epithelial cells from a murine model of urinary tract infection.

İdrar yolu enfeksiyonu aşağı akım tek hücreli analiz için bir fare modelinden oluşturulan tek hücre içi bakteriyel toplulukların yalıtım

In this article, we outline a procedure used to isolate individual intracellular bacterial communities from a mouse that has been experimentally infected ...

Isolation of Lamina Propria Mononuclear Cells from Murine Colon Using Collagenase E

The intestine is the home to the largest number of immune cells in the body. The small and large intestinal immune systems police exposure to exogenous antigens and modulate responses to potent microbially derived immune stimuli. For this reason, the intestine is a major target site of immune dysregulation and inflammation in many diseases including but, not limited to inflammatory bowel diseases such as Crohn&#8217;s disease and ulcerative colitis, graft-versus-host disease (GVHD) after bone marrow transplantation (BMT), and many allergic and infectious conditions. Murine models of gastrointestinal inflammation and colitis are heavily used to study GI complications and to pre-clinically optimize strategies for prevention and treatment. Data gleaned from these models via isolation and phenotypic analysis of immune cells from the intestine is critical to further immune understanding that can be applied to ameliorate gastrointestinal and systemic inflammatory disorders. This report describes a highly effective protocol for the isolation of mononuclear cells (MNC) from the colon using a mixed silica-based density gradient interface. This method reproducibly isolates a significant number of viable leukocytes while minimizing contaminating debris, allowing subsequent immune phenotyping by flow cytometry or other methods.

The goal of this protocol is to isolate mononuclear cells that reside in the lamina propria of the colon by enzymatic digestion of the tissue using collagenase. This protocol allows for the efficient isolation of mononuclear cells resulting in a single cell suspension which in turn can be used for robust immunophenotyping.

Lamina Propria Mononükleer Hücrelerin Murine Kolondan Kollajenaz E Kullanarak İzolasyon

The intestine is the home to the largest number of immune cells in the body. The small and large intestinal immune systems police exposure to exogenous ...