Bu çalışma NIA R00 AG053412 (KEF) tarafından desteklendi.

Tüm prosedürler, Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'ndaki önerilere uygun olarak ve Hayvanları İçeren Biyomedikal Araştırmalar için Uluslararası Rehberlik İlkelerine göre gerçek gerçekleştirildi. Protokol, Charlotte Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'nde (Protokol #19-020) Kuzey Carolina Üniversitesi tarafından onaylandı.
1. Kültüre hazırlık
NOT: Bu işlemler doku kültürüne göre belirlenmiş bir biyogüvenlik kabininde steril koşullarda yapılmalıdır. Medya ve çözümler için Tablo 1'e bakın.
<ol><li>Kendinden sızdırmaz sterilizasyon torbalarında otoklavlayarak tüm diseksiyon aletlerini sterilize edin.</li>
	<li>12 kuyulu kültür yemeklerinin tedavisi için poli-D-lizin çalışma stoklarını hazırlayın.<ol>
<li>Poli-D-lizini 1x borat tamponunda 100 μg/mL (10x konsantre) konsantrasyonda çözün. Yaklaşık 1 mL aliquots'u ihtiyaç duyulana kadar -20 °C'de saklayın.</li>
		<li>DPBS'de 10x konsantre poli-D lizin'i 10 μg/mL 'ye (1x) seyreltin ve sterilize edin.</li>
		<li>12 kuyulu kültür plakalarını 1x poli-D-lizin kuyusu başına 0,5 mL ile oda sıcaklığında en az 1 saat veya ertesi gün kullanmak için bir gecede tedavi edin. Poli-D-lizin hacminin kültür alanının altını tamamen kaplayacak kadar yeterli olduğundan emin olun.</li>
		<li>Kullanımdan hemen önce, poli-D-lizini kültür plakasından çıkarın, steril suda 3x durulayın ve hücreleri kaplamaya hazır olana kadar steril suda saklayın. Hücreleri kaplamadan önce tüm sıvı izlerini kapsamlı bir aspirasyonla çıkarın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Neuron Growth Media ve FACS tamponu hazırlayın. Sterilize edin ve kullanıma kadar 4 °C'de saklayın. Nöron Büyüme Ortamı yaklaşık 2 wks boyunca tutulabilir; FACS arabelleği yaklaşık 4 wks boyunca saklanabilir.</li>
</ol>2. Embriyonik hipokampüsün diseksiyonu
NOT: Bu işlem, menenjitlerin giderilmesi ve hipokampüsün mikro diseksiyonu için stereo mikroskop kullanılmasını gerektirdiğinden tezgahta yapılabilir. Olası kontaminasyonu en aza indirmek için katı aseptik tekniğe uyun.
<ol><li>Embriyonik 18. günde co2 odasında zamanlanmış hamile bir C57BL/6J dişi fareyi ötenazi edin.</li>
	<li>Karın derisini ve kürkü % 70 EtOH ile püskürtün, ardından cildi doku asaları ile sıkıştırın ve cerrahi makasla küçük kesi yapın. İç organları ve uterusun ortaya çıkması için peritonları kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Uterusun standart desenli tokmaklarla kavrayın, boşluktan kaldırın ve mesometrium bağlantısını ince makasla kesin. Embriyolu uterusun buza yerleştirilen 100 mm steril plastik kültür çanaklarına aktarılması.</li>
	<li>İnce makas ve ince tokmaklar kullanarak uterusun dikkatlice kesilmesi ve embriyoların serbest bırakılması için embriyonik keseciklerin çıkarılması. Embriyoları buza yerleştirilen dPBS içeren 100 mm steril plastik kültür kabına aktarın.</li>
	<li>İnce makas kullanarak embriyonik yavruların kafasını kopar ve kafaları buza yerleştirilmiş Hibernate-E ortamı içeren yeni 100 mm steril plastik kültür kabına aktarın.</li>
	<li>Beyni çıkarmak için, bir elinde bir çift ince tokmak ile başı tutun. Kavisli Dumont #7 önps kullanarak, kafatasının tabanınaps ucunu yerleştirin ve kemiği kıstırın ve beyni delmeden ön çizgi boyunca hareket eden cildi aşırı sıkıştırın.</li>
	<li>Kavisli tokalar kullanarak beyni açığa çıkarmak için deriyi ve kafatasını ayırın. Beynin altındaki kavisli tokaları açıkta kalan koku ampulünden beyinciklere süpürerek beyni kafatasından çıkar. Beyni, buza yerleştirilmiş Hibernate-E ortamını içeren 100 mm steril plastik kültür kabına aktarın. Her beyin için tekrarlayın. NOT: Deneye özgü amaçlar için ayrı olmak gerekmedikçe tüm beyinler tek bir kültür çanasında toplanabilir.</li>
	<li>Stereo diseksiyon mikroskobu altında, aynı anda bir beyin ve iki çift steril Dumont #5 toka ile çalışmak, koku ampullerini çimdiklemek ve menenajları çekmek. Menenjitlerin iyice çıkarılması, diğer hücreler tarafından kültür kirlenmesini önlemek ve daha fazla diseksiyona izin vermek için gereklidir.</li>
	<li>Menenjitler düzgün bir şekilde çıkarıldıktan sonra, korteksin üst tarafı yanal olarak açılır ve bu da hipokampusu açığa çıkarır. Dumont #5 tokalarını kullanarak hipokampusu ekli korteksten uzaklaştırın ve izole hipokampusu buz üzerinde 5 mL Hibernate-E ortamı içeren steril 15 mL konik bir tüpe dikkatlice aktarın.</li>
	<li>Her embriyonik fare yavrusu için her iki beyin yarımküresi için diseksiyonu tekrarlayın ve deneye özel amaçlar için ayrı ayrı gerekmedikçe tüm hipokampileri tek bir 15 mL konik tüpte birleştirin.<ol>
<li>Kortikal nöronları kültüre etmek için korteks alt metinden ayrılabilir ve hipokampal nöronlarla aynı şekilde işlenebilir. NOT: Bu noktada, protokol duraklatılabilir. B27 ile desteklenmiş Hibernate-E ortamında beyinleri veya parçalanmış hipokampileri saklayın (%2) 1 aya kadar 4 °C'de, ancak uzatılmış gecikme canlı hücre sayısını tehlikeye atabilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Hipokampal nöronların ayrıştırıcı ve kültlü
NOT: Tüm işlemler steril koşullarda biyogüvenlik kabininde doku kültürüne göre yapılmalıdır.
<ol><li>Hipokampal ayrışma için embriyo başına 0,5 mL papain ayrıştırma çözeltisi hazırlayın. İhtiyaç duyulan ayrışma çözeltisinin hacmi, parçalanan embriyonik beyin sayısına bağlı olarak değişecektir. NOT: Kortikal nöron kültürü için embriyo başına 1,0 mL papain çözeltisi hazırlayın.<ol>
<li>Yaklaşık 3 dakika boyunca girdap yaparak Hibernate E ortamının 1 mL'si başına 20 μL papain süspansiyonu çözün.</li>
		<li>Papain çözüldükten sonra, çözeltinin 1 mL'si başına 1 μL DNase I ekleyin. Enzimi devre dışı bırakabileceğinden, I. Danoz eklendikten sonra çözeltiyi girdap etmeyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Santrifüj 15 mL konik tüp hipokampal doku içeren (adım 2.10) 1,000 x g 5 dakika boyunca. Üstnatanı çıkarın ve papain çözeltisi ekleyin. Birkaç kez ters çevirerek dokuyu yeniden dirsin. 37 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatırarak, her 10 dakikada bir dokuyu yeniden canlandırmayı tersine çevirin.<ol>
<li>Kortikal nöronları kültlüyorsanız, tüm kortikalleri yeni bir 100 mm steril kültür çanağine aktarın, plakadan medyayı dikkatlice aspire edin ve ince makas veya jiletle kıyma dokusu. Kültür çanağına papain çözeltisi ekleyin ve steril bir transfer pipeti kullanarak papain çözeltisi ile kortikal dokuyu 15 mL konik tüpe aktarın. 37 °C'de 30 dakika boyunca her 10 dakikada bir ajite olan doku ve enzim çözeltisinin kuluçkaya yatır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>30 dakikalık inkübasyon sırasında, 3 yangın cilalı cam Pasteur pipet hazırlayın: 1 tamamen açık, 1 yarı açık ve 1 çeyrek açık.</li>
	<li>30 dk inkübasyondan sonra, sindirilmiş beyin dokularını içeren 15 mL konik tüpü 10 dakika boyunca 125 x g'da santrifüj edin. Enzim çözeltisini çıkarın ve eşit miktarda taze Hibernate E ortamı ile değiştirin.</li>
	<li>Tamamen açık Pasteur pipet kullanarak, dokuyu 10x üçleme. Dokunun 2 dakika yerleşmesine izin verin, ardından süpernatan hücre süspansiyonu steril 50 mL konik tüpe aktarın. Dokuya eşit miktarda Hibernate E ortamı ekleyin.</li>
	<li>Yarı açık Pasteur pipet kullanarak, üçleme dokusu 10x. Dokunun 2 dakika yerleşmesine izin verin, ardından süpernatan hücre süspansiyonu önceki adımda olduğu gibi aynı 50 mL konik tüpe aktarın. Dokuya eşit miktarda Hibernate E ortamı ekleyin.</li>
	<li>Çeyrek açık Pasteur pipet kullanarak, üçleme dokusu 10x. Dokunun 2 dakika yerleşmesine izin verin, ardından süpernatan hücre süspansiyonu tekrar önceki adımlarda olduğu gibi aynı 50 mL konikine aktarın. Ayrışmamış kalan dokuları atın.</li>
	<li>Hücre süspansiyonundan süpernatantı içeren 50 mL konik tüpü 5 dakika boyunca 125 x g'da santrifüj edin. Henüz yapılmamışsa, poli-D-lizin kaplı plakaları steril suyla yıkayın ve santrifüjleme sırasında tüm sıvı izlerini iyice aspirasyonla temizleyin.</li>
	<li>Santrifüjlemeden sonra, süpernatantı atın ve hücre peletini 5 mL Nöron Büyüme Ortamı'nda yeniden dirildi. Trippan mavisi ve hemositometre kullanarak canlı hücreleri sayın.<ol>
<li>Kortikal nöronları kültlüyorsanız, daha az yoğun hücreler ve daha doğru sayım için en az 10 mL Nöron Büyüme Ortamı ekleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ml başına 5 x 10 5 uygulanabilir hücrenin son kaplama yoğunluğu için hücreleri Nöron Büyüme Ortamı ile seyreltin ve 12 kuyu plakasının her kuyusuna 1 mL seyreltilmiş hücre süspansiyonu ekleyin. %5 CO2ile nöronları 37 °C'de koruyun. NOT: Tipik olarak, 1 embriyonik fare beyninden hipokampi, yani 2 hipokampi, yaklaşık 1 x 106 canlı hücre verir. Bu sayı yalnızca deneme planlaması amacıyla sağlanır ve her kültür için hücreleri saymak için bir ikame olarak düşünülmemelidir.</li>
	<li>Her kuyudan medya hacminin yarısını, yani 0,5 mL'yi kaldırarak kültürden sonraki gün büyüme medyasını değiştirin ve kültürlü hücreleri bozmamak için kuyunun kenarına eşit miktarda taze ortam ekleyin. Kültürün ömrü boyunca haftada iki kez yarım medya değişikliklerini tamamlayın.</li>
</ol>4. MHCI ekspresyonlarının akış sitometrisi ile değerlendirilmesi
<ol><li>Interferon beta (IFNβ) veya Nöron Büyüme Ortamı'nda eşit miktarda seyrelterek tedaviyi hazırlayın. Medya değişikliği yarım hacimli bir değişiklik olacağından, 2x konsantre IFNβ ile tedavi ortamı hazırlayın. yani, 100 U/mL IFNβ ile 12 kuyu plakasının 3 kuyusunun tedavisi için, 200 U/mL IFNβ ile 1,5 mL veya medya ile tedavi edilen kontroller için eşit hacimde IFNβ seyreltici hazırlayın.</li>
	<li>Her nöron kuyusundan 0,5 mL çıkarın ve her kuyuya IFNβ olsun veya olmayın 0,5 mL Nöron Büyüme Ortamı ekleyin. Deneysel koşullara ve sinyal optimizasyonuna bağlı olarak6-72saat boyunca normal büyüme koşullarında (%37 °C, %5 CO 2) kuluçkaya yatın.</li>
	<li>Tedavi süresinden sonra, tüm kültür medyasını çıkarın ve takviyeleri olmayan soğuk Nörobasal medyada bir kez hafifçe yıkayın (B27, L-glutamin, Pen-Strep).</li>
	<li>Her kuyuya 1 μg/mL Fc bloğu ve 1 μg/mL floresan konjuge anti-MHCI antikoru içeren 0,5 mL takviyesiz soğuk Nörobakal ortam ekleyin. 4 °C'de kuluçkaya yatarak 45 dakika boyunca ışıktan korunsun.</li>
	<li>Antikor içeren ortamı çıkarın ve soğuk dPBS'de bir kez dikkatlice yıkayın. Her kuyuya 0,5 mL oda sıcaklığı enzimsiz hücre ayrıştırma tamponu ekleyin ve hücreleri yerinden çıkarmak için ajite edin. Ters doku kültürü mikroskobu kullanarak ayrışmalara dikkat edin.</li>
	<li>Hücreler kültür çanaktan ayrıldıktan sonra, her kuyuya 0,5 mL FACS arabelleği ekleyin, kümeleri dağıtmak için hücreleri üç katına çıkarın ve her kuyunun toplam hacmini tek tek 1,7 mL mikrosantrifüj tüplerine aktarın.</li>
	<li>5 dakika boyunca 1.000 x g'da santrifüj. Süpernatant çıkarın, hücre peletini 100 μL FACS tamponunda yeniden çıkarın ve her tüpün toplam hacmini 96 kuyu U-alt plakasının ayrı kuyularına aktarın.</li>
	<li>Her kuyuya 100 μL sabitleyici reaktif ekleyin. Hücrelerin topaklanmaması için birkaç kez tritüre edin ve ışıktan korunan oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya yatsın.</li>
	<li>5 dakika boyunca 500 x g'da santrifüj. 200 μl FACS arabelleği içinde süpernatant ve resuspend çıkarın.</li>
	<li>5 dakika boyunca 500 x g'da santrifüj. Her kuyuya floresan konjuge anti-NeuN antikoru (1:100 seyreltme) içeren 100 μL permeabilizasyon reaktifinde süpernatantı ve resüspend'i çıkarın. İyice karıştırın, ardından 20 dakika boyunca sallanan ışıktan korunan oda sıcaklığında kuluçkaya yatın.</li>
	<li>Kuluçkadan sonra, 5 dakika boyunca 500 x g'da santrifüj. 100 μL FACS arabelleği içinde süpernatant ve resuspend çıkarın. 2x'i tekrarlayın.</li>
	<li>Son yıkamadan sonra, hücreleri 100 μL%2 paraformaldehit içinde FACS tamponunda seyreltilir. Hücrelerin topaklanmasını önlemek için iyice karıştırın. Bir akış sitometresinde okumaya hazır olana kadar ışıktan korunan 4 °C'de saklayın. Örnekleri 1 hafta içinde en kısa sürede okuyun.</li>
</ol>5. Verilerin ölçülmesi ve değerlendirilmesi
<ol><li>Her floresan boya için kompanzasyon kontrollerini ölçün ve spektral çakışmaları düzeltin. İdeal kompanzasyon kontrolleri, el altından, sadece ANTI-MHCI ile lekelenmiş ve sadece Anti-NeuN ile lekelenmiş kültürlü nöronları içerir.</li>
	<li>Mümkünse, her örnek için 100.000 olay kaydedin (en az 10.000) ve FCS dosyaları olarak kaydedin.</li>
	<li>Verileri analiz etmek için, uygun analiz yazılımını kullanarak, NeuN pozitif nöronları seçmek için Şekil 1A-C'de gösterildiği gibi sıralı kapılar kurun.<ol>
<li>SSC-A (günlük) ve FSC-A (doğrusal) çizin. Analizden hücresel kalıntıları ortadan kaldırmak için hücresel popülasyona (P1) bir kapı çizin.</li>
		<li>P1 hücresel popülasyonu içinde FSC-H (doğrusal) ve FSC-A (doğrusal) grafiğini çizin. Tek hücreli nüfusa bir kapı çizin.</li>
		<li>Tek hücre popülasyonu içinde, SSC-A (günlük) vs NeuN (günlük) çizin. Kılavuz olarak ellenmemiş veya yalnızca MHCI lekeli hücreler kullanarak NeuN pozitif popülasyona bir kapı çizin.</li>
		<li>Y ekseninde moda normalleştirilmiş hücresel olaylarla MHCI floresan histogramı çizin. Kılavuz olarak sadece lekelenmemiş veya NeuN lekeli nöronları kullanarak, MHCI için pozitif olan nöronların yüzdesini ölçmek için yatay bir kapı çizin.</li>
		<li>MHCI için pozitif yüzde hücrelerin yanı sıra istatistiksel değerlendirme ve grafik çizim için NeuN pozitif popülasyonda MHCI için ortanca floresan yoğunluğunu (MFI) dışa aktarın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Galea, I., Bechmann, I., Perry, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+immune+privilege+(not).">What is immune privilege (not).</a> Trends in Immunology. 28 (1), 12-18 (2007).</li><li>Morimoto, K., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+Immune+System+in+the+Development+of+the+Central+Nervous+System.">Role of the Immune System in the Development of the Central Nervous System.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 916 (2019).</li><li>Klein, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroinflammation+During+RNA+Viral+Infections.">Neuroinflammation During RNA Viral Infections.</a> Annual Review of Immunology. 37, 73-95 (2019).</li><li>Janeway, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+T+cell+receptor+as+a+multicomponent+signalling+machine:+CD4/CD8+coreceptors+and+CD45+in+T+cell+activation.">The T cell receptor as a multicomponent signalling machine: CD4/CD8 coreceptors and CD45 in T cell activation.</a> Annual Review of Immunology. 10, 645-674 (1992).</li><li>Peaper, D. R., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+MHC+class+I+assembly+and+peptide+binding.">Regulation of MHC class I assembly and peptide binding.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 24, 343-368 (2008).</li><li>Donaldson, J. G., Williams, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+Assembly+and+Trafficking+of+MHC+Class+I+Molecules.">Intracellular Assembly and Trafficking of MHC Class I Molecules.</a> Traffic. 10 (12), 1745-1752 (2009).</li><li>Charles, A., Janeway, J., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell-mediated+cytotoxicity.">T cell-mediated cytotoxicity.</a> Immunobiology: The Immune System in Health and Disease. 5th edition. , (2001).</li><li>Guidotti, L. G., Chisari, F. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncytolytic+control+of+viral+infections+by+the+innate+and+adaptive+immune+response.">Noncytolytic control of viral infections by the innate and adaptive immune response.</a> Annual Review of Immunology. 19, 65-91 (2001).</li><li>Chevalier, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurons+are+MHC+class+I-dependent+targets+for+CD8+T+cells+upon+neurotropic+viral+infection.">Neurons are MHC class I-dependent targets for CD8 T cells upon neurotropic viral infection.</a> PLoS Pathogens. 7 (11), 1002393 (2011).</li><li>Shrestha, B., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+CD8++T+Cells+in+Control+of+West+Nile+Virus+Infection.">Role of CD8+ T Cells in Control of West Nile Virus Infection.</a> Journal of Virology. 78 (15), 8312-8321 (2004).</li><li>Plaisted, W. C., Weinger, J. G., Walsh, C. M., Lane, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+mediated+suppression+of+neurotropic+coronavirus+replication+in+neural+precursor+cells.">T cell mediated suppression of neurotropic coronavirus replication in neural precursor cells.</a> Virology. 449, 235-243 (2014).</li><li>Marten, N. W., Stohlman, S. A., Zhou, J., Bergmann, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+virus-specific+CD8++-T-cell+expansion+and+trafficking+following+central+nervous+system+infection.">Kinetics of virus-specific CD8+ -T-cell expansion and trafficking following central nervous system infection.</a> Journal of Virology. 77 (4), 2775-2778 (2003).</li><li>Shatz, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MHC+class+I:+an+unexpected+role+in+neuronal+plasticity.">MHC class I: an unexpected role in neuronal plasticity.</a> Neuron. 64 (1), 40-45 (2009).</li><li>Corriveau, R. A., Huh, G. S., Shatz, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+class+I+MHC+gene+expression+in+the+developing+and+mature+CNS+by+neural+activity.">Regulation of class I MHC gene expression in the developing and mature CNS by neural activity.</a> Neuron. 21 (3), 505-520 (1998).</li><li>Goddard, C. A., Butts, D. A., Shatz, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+CNS+synapses+by+neuronal+MHC+class+I.">Regulation of CNS synapses by neuronal MHC class I.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (16), 6828-6833 (2007).</li><li>Needleman, L. A., Liu, X. B., El-Sabeawy, F., Jones, E. G., McAllister, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MHC+class+I+molecules+are+present+both+pre-+and+postsynaptically+in+the+visual+cortex+during+postnatal+development+and+in+adulthood.">MHC class I molecules are present both pre- and postsynaptically in the visual cortex during postnatal development and in adulthood.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (39), 16999-17004 (2010).</li><li>Syken, J., Grandpre, T., Kanold, P. O., Shatz, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PirB+restricts+ocular-dominance+plasticity+in+visual+cortex.">PirB restricts ocular-dominance plasticity in visual cortex.</a> Science. 313 (5794), 1795-1800 (2006).</li><li>Atwal, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PirB+is+a+functional+receptor+for+myelin+inhibitors+of+axonal+regeneration.">PirB is a functional receptor for myelin inhibitors of axonal regeneration.</a> Science. 322 (5903), 967-970 (2008).</li><li>Takai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paired+immunoglobulin-like+receptors+and+their+MHC+class+I+recognition.">Paired immunoglobulin-like receptors and their MHC class I recognition.</a> Immunology. 115 (4), 433-440 (2005).</li><li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapse+elimination+and+learning+rules+co-regulated+by+MHC+class+I+H2-Db.">Synapse elimination and learning rules co-regulated by MHC class I H2-Db.</a> Nature. 509 (7499), 195-200 (2014).</li><li>Ribic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+regulation+of+MHC+class+I+expression+in+the+developing+primary+visual+cortex+of+the+common+marmoset+monkey.">Activity-dependent regulation of MHC class I expression in the developing primary visual cortex of the common marmoset monkey.</a> Behavioral and Brain Functions. 7, 1 (2011).</li><li>Sahu, M. P., Nikkil&#228;, O., L&#229;gas, S., Kolehmainen, S., Castr&#233;n, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+primary+neurons+from+rat+hippocampus+and+cortex.">Culturing primary neurons from rat hippocampus and cortex.</a> Neuronal Signaling. 3 (2), (2019).</li><li>Gordon, J., Amini, S., White, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+overview+of+neuronal+cell+culture.">General overview of neuronal cell culture.</a> Methods in Molecular Biology. 1078, 1-8 (2013).</li><li>Zhang, X., Hu, D., Shang, Y., Qi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+induced+pluripotent+stem+cell+neuronal+models+to+study+neurodegenerative+diseases.">Using induced pluripotent stem cell neuronal models to study neurodegenerative diseases.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease. 1866 (4), 165431 (2020).</li><li>Berry, B. J., Smith, A. S. T., Young, J. E., Mack, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+Current+Challenges+Associated+with+the+Use+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+in+Modeling+Neurodegenerative+Disease.">Advances and Current Challenges Associated with the Use of Human Induced Pluripotent Stem Cells in Modeling Neurodegenerative Disease.</a> Cells, Tissues, Organs. 205 (5-6), 331-349 (2018).</li><li>Ho, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Guide+to+Single-Cell+Transcriptomics+in+Adult+Rodent+Brain:+The+Medium+Spiny+Neuron+Transcriptome+Revisited.">A Guide to Single-Cell Transcriptomics in Adult Rodent Brain: The Medium Spiny Neuron Transcriptome Revisited.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 159 (2018).</li><li>Panchision, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+Flow+Cytometric+Analysis+of+Central+Nervous+System+Tissue+Reveals+Novel+Functional+Relationships+Among+Cells+Expressing+CD133,+CD15,+and+CD24.">Optimized Flow Cytometric Analysis of Central Nervous System Tissue Reveals Novel Functional Relationships Among Cells Expressing CD133, CD15, and CD24.</a> Stem Cells. 25 (6), 1560-1570 (2007).</li><li>Snaidero, N., Simons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelination+at+a+glance.">Myelination at a glance.</a> Journal of Cell Science. 127 (14), 2999-3004 (2014).</li><li>Martin, D., Xu, J., Porretta, C., Nichols, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurocytometry:+Flow+Cytometric+Sorting+of+Specific+Neuronal+Populations+from+Human+and+Rodent+Brain.">Neurocytometry: Flow Cytometric Sorting of Specific Neuronal Populations from Human and Rodent Brain.</a> ACS Chemical Neuroscience. 8 (2), 356-367 (2017).</li><li>Lv, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+MHC+Class+I+Expression+Is+Regulated+by+Activity+Driven+Calcium+Signaling.">Neuronal MHC Class I Expression Is Regulated by Activity Driven Calcium Signaling.</a> PLoS One. 10 (8), 0135223 (2015).</li><li>Barco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiling+of+facilitated+L-LTP+in+VP16-CREB+mice+reveals+that+BDNF+is+critical+for+the+maintenance+of+LTP+and+its+synaptic+capture.">Gene expression profiling of facilitated L-LTP in VP16-CREB mice reveals that BDNF is critical for the maintenance of LTP and its synaptic capture.</a> Neuron. 48 (1), 123-137 (2005).</li><li>Glynn, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MHCI+negatively+regulates+synapse+density+during+the+establishment+of+cortical+connections.">MHCI negatively regulates synapse density during the establishment of cortical connections.</a> Nature Neuroscience. 14 (4), 442-451 (2011).</li><li>Facci, L., Skaper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+Rodent+Cortical,+Hippocampal,+and+Striatal+Neurons.">Culture of Rodent Cortical, Hippocampal, and Striatal Neurons.</a> Methods Molecular Biology. 1727, 39-47 (2018).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Bu protokol embriyonik 18. günde doğum öncesi fare yavrularından primer hipokampal nöronların diseksiyon ve kültürünü açıklar. Kemirgenlerden kültürlenmiş birincil nöronların kullanımı, modern nörobiyolojide geliştirilen en temel metodolojilerden biridir22. Ölümsüzleştirilmiş hücre hatları nöronların belirli yönlerini modelleyebilse de, tümör türevi hücreler olarak doğaları, tanımlanmış aksonların geliştirilememesi ve hücre bölünmesinin devam etmesi, mitotik nöronların özelliklerini in vivo23'tesadık bir şekilde yeniden toplayıp toplamadıkları konusunda şüphe uyandırır. Primer nöronlara bir diğer alternatif de insan indüklenmiş pluripotent kök hücrelerin (HiPSC) kullanılmasıdır. HiPSC'leri kullanma teknolojisi, özellikle hasta kaynaklı olanlar, son yıllarda hızla ilerlemiştir24. Bununla birlikte, hücre hatları arasındaki değişkenlik, fonksiyonel olgunluk eksikliği ve epigenetik profillerdeki farklılıklar da dahil olmak üzere HiPSC'lerle çalışmanın hala sınırlamaları vardır25. Birincil kemirgen nöronlarının indirgemeci modeliyle çalışmanın sınırlamaları da olsa, kültürlü nöronlar in vivo nöronların mitotik sonrası doğasını korur. Ayrıca, fareler için mevcut olan geniş moleküler biyoloji araçları ve genetik değişiklikler, birçok uygulama için HiPSC'lere göre birincil nöronların kullanılmasını tercih eder ve fare çalışmaları deneysel genetik sistemi kaybetmeden daha karmaşık in vivo organizmaya kolayca çevrilebilir. Bu nedenlerden dolayı, birçok araştırmacı, araştırmalarının toplu olmasa da temel yönlerini doğrulamak için birincil kemirgen nöronlarını kullanır.
Bazı tahliller için, nöronlar doğrudan beyin eks vivo izolasyonundan sonra analizedilebilir. Bu, belirli deneysel koşullara maruz kalabilen veya birden fazla hücre tipinin etkileşimlerine bağlı olabilecek yetişkin fareleri içeren deneyler için özellikle arzu edilir; ancak, yapılabilecek analizlerin türünü sınırlayan birkaç konu vardır. Nöronların yetişkin farelerin beyinlerinden tek bir hücre süspansiyonu hazırlamak teknik olarak zordur, çünkü nöronlar benzersiz bir şekilde birbirine bağlıdır ve miyelin26ile kaplanır. Doku tritürasyonunun enzymatik olmayan yöntemleri, dokuyu ayırmada ve hücre ölümüne neden olmakta verimsizdir, oysa enzymatik preparatlar genellikle hücre yüzeyi antijenlerini ayırır27. Ayrıca, miyelin embriyonik farelerde büyük ölçüde bulunmamakla birlikte, yetişkin beyninin yaklaşık% 20'sini oluşturur ve canlı hücre izolasyonuna engel olabilir ve akış sitometrisi analizini28. Geliştirilen tekniklerin çoğu nihayetinde sitozollerinin nöronlarını soyun ve öncelikle çekirdek29'danoluşan küçük, yuvarlatılmış hücre gövdeleri bırakın. Bu bazı analizler için kabul edilebilir olsa da, sitoplazmik veya hücre dışı protein ekspresyonlarını ölçmek için uygun değildir. Ayrıca, indirgemeci hücre kültürü sistemi, belirli mekanistik soruların in vivo sistemle sık karşılaşılandan daha kısa bir zaman ölçeğinde test edilir.
Ayrıca bu protokolde, MHCI ekspresyonunun IFNβ ile farmakolojik olarak uyarılması ve hücre dışı MHCI ekspresyonunun akış sitometrisi ile ölçülmesi yöntemleri açıklanmaktadır. IFNβ tarafından stimülasyon diğer deneysel durumları test etmek için yararlı bir pozitif kontroldür, ancak IFNφ ve kainic asidin nöronlarda MHCI ekspresyonunu da uyarabileceği belirtilebilir9,30, tetrodotoxin ise MHCI ekspresyonunu azaltır14. MHCI ekspresyonunu tespit etmek için önceki yöntemler in situ hibridizasyon ve immünohistokimyasal analiz14,15,20,31 'edayanıyordu. In situ hibridizasyon ve qRT-PCR gibi mRNA tabanlı tahliller mekansal lokalizasyonu, hücre tipi özgüllüğünü ve gen transkripsiyon seviyelerini belirleyebilirken, bu tahliller protein çevirisini veya plazma zarı için taşımayı değerlendiremez. İmmünistokimyasal ve batı leke analizi protein ekspresyasyonu ve potansiyel olarak hücresel lokalizasyondaki farklılıkları belirleyebilir, ancak doğru bir şekilde ölçmek zor olabilir. Ayrıca, birçok MHCI antikoru kompleksin üçüncül yapısını tanır ve konformasyonel değişikliklere karşı oldukça hassastır. Böylece permeabilizasyon veya denatüre etme koşulları MHCI immünoreaktivite kaybına neden32. Burada sunulan yöntem, proteinin doğal uyumundaki antikor tarafından tanınmasını sağlayan MHCI için yerinde immünostaining ve ardından fiksasyon ve permeabilizasyon yöntemlerini kullanır.
Hafif değişikliklerle, burada açıklanan yöntemler diğer nöronal popülasyonları kültüre etmek veya diğer hücre dışı ilgi proteinlerinin ekspresyonlarını değerlendirmek için kullanılabilir. Bu protokolde kortikal nöronları kültüre etmek için yapılabilecek kolay değişiklikler olduğu belirtilmektedir, ancak burada açıklanan yöntemler striatal nöronlar33gibi diğer nöronal popülasyonları kültüre etmek için de kullanılabilir. Ayrıca, bu protokol MHCI ve NeuN'un immün yetisini belirtse de, diğer hücresel belirteçler benzer şekilde tanımlanabilir. Genel olarak, hücre dışı belirteçler MHCI gibi, hücre içi belirteçler ise NeuN gibi tedavi edilebilir. Bununla birlikte, hücresel ayrışma adımı sırasında aksonal projeksiyonların somadan koptuğu belirtilmelidir. Burada tanımlanan gating stratejisi hücresel kalıntıları elediği ve nöronal çekirdek belirteci NeuN'a odaklandığı için, sadece aksonal projeksiyonlarda ifade edilen proteinler tespit edilemeyebilir.
Yakın zamana kadar, nöronların MHCI'yı sadece sitotoksik CD8+ T hücrelerini meşgul etmek için hasara, enfeksiyona veya in vitro sitokin stimülasyonuna yanıt olarak ifade etmesi düşünülüyordu9. Yeni araştırmalar, geliştirme sırasında sinaptik bağlantıların düzenlenmesinde MHCI'nın başka bir işlevini ortaya çıkarmıştır13. Burada açıklanan protokol, wildtype kültürlü nöronlarda MHCI ekspresyonını uyarmak için IFNβ kullanır, ancak benzer yöntemler belirli hipotezleri test etmek için çeşitli hücresel uyaranlar veya genetik değişikliklerle kullanılabilir. Bu yöntem, araştırmacıların MHCI ekspresyonunu düzenleyen moleküler mekanizmaları araştırmalarını sağlayacak ve bu da MHCI'nın bu iki farklı hücresel işlev üzerindeki iki yönlü rolünün anlaşılmasını artıracaktır.

Merkezi sinir sisteminin (CNS) bir zamanlar "bağışıklık ayrıcalıklı1"olarak adlandırılan bağışıklık gözetiminden yoksun olduğu düşünülüyordu. Bu ayrıcalığın bağışıklık bileşenlerinin mutlak yokluğuna eşit olmadığı, aksine, immünopatoloji ile ilişkili hasarı sınırlamak için işlev gören özel bir düzenleme olduğu açıktır1. Aslında, CNS ve bağışıklık sistemi arasındaki iletişim, sağlıklı beyin gelişimi ve enfeksiyonlara yanıt için gerekli olan devam eden bir konuşmadır2,3.
Majör histocompatibility complex sınıf I (MHCI) molekülleri, enfeksiyon sırasında CD8+ T hücrelerine antijenik peptitlerin sunulmasındaki işlevleriyle bilinen polijenik ve polimorfik transmembran proteinleridir4. Klasik MHCI kompleksleri transmembran α zinciri ve β2-mikroglobulin adı verilen hücre dışı bir ışık zincirinden oluşur. α zinciri, sunum için antijenik bir peptit bağlayan polimorfik bir oluk içerir5. MHCI'nın hücre dışı membran üzerinde doğru ifadesi, yüksek benzeşimli peptit ligand5'inyüklenmesiyle birlikte α zinciri ve β2 mikroglobulinin düzgün bir şekilde katlanmasını sağlamak için endoplazmik retikülumdaki moleküler refakatçilerin koordineli bir şekilde hareket etmesini gerektirir. Mhci kompleksleri bir araya getirildikten sonra, endoplazmik retikülükten plazma membran6'yaihraç edilir. Kognate T hücre reseptörünün peptit yüklü MHCI kompleksi ile angajmanı üzerine, CD8+ T hücreleri, perforin ve granzim içeren litik granülleri serbest bırakarak veya hedef hücre zarı üzerindeki Fas reseptörü bağlama yoluyla kesme ilamsını indükleyerek hücre öldürmeye aracılık eder7. Ek olarak, CD8+ T hücreleri, sitopatik etkileri olmadan enfekte hücrelerde antiviral mekanizmaları aktive ürkütebilen gama interferonu (IFNφ) ve tümör nekroz faktörü alfa (TNFα) gibi sitokinler üretir8,9. Birçok nörotropik virüs için, CD8+ T hücreleri enfeksiyonu CNS10 , 11,12'den temizlemek için gereklidir.
Daha önce nöronların MHCI'yı sadece hasar, viral enfeksiyon veya in vitro sitokin stimülasyonu ile ifade ettiği düşünülüyordu. Son zamanlarda, araştırmalar mhci nöronal ekspresyotiği için sinaptik remodeling ve plastisitede bir rol belirlemiştir13,14. Sinaps düzenlemesinin altında kalan kesin mekanizmalar iyi anlaşılmasa da, veriler MHCI ifade düzeyinin sinaptik aktivite15,16ile düzenlendiğini göstermektedir. Bir hipotez, nöronların, MHCI'yi transiplaptik olarakbağlayanimmünoglobulin benzeri reseptör B 'yi (PirB) presynaptik olarak ifade ettiğini önesürmektedir. Bu etkileşim, PirB tarafından sinaptik yeniden şekillendirmede yer alan yollara karşı çıkan bir sinyal basamaklama başlatır, böylece sinaptik bağlantıyı güçlendirir ve stabilize eder17,18,19. Nöronal aktivitenin yokluğunda, MHCI ekspresyasyonu14azalır ve MHCI kaybı kusurlu sinaps eliminasyonu ve yanlış düzenlenmiş sinaptik devreler20,21ile sonuçlanır.
Burada açıklanan ve Chevalier ve ark.9'danuyarlanan test, MHCI'nın murine hipokampal nöronların birincil kültürleri üzerindeki hücre dışı protein ekspresyonını nicel olarak değerlendirmek için akış sitometrik analizini kullanır. Bu protokol, embriyonik fare yavrularından hipokampal dokuyu mikrosekse etmek için ilk teknikleri göstermektedir. Daha sonra dokunun tek bir hücre süspansiyonuna enzipmatik ve mekanik ayrışması için süreçleri ve kültürleri in vitro olarak koruma yöntemlerinidetaylandırıyor. Bölünmedikleri için, kültüre girdikten sonra, nöronlar deneysel uç noktalarına uygun bir tabakta ve yoğunlukta kaplanmalıdır. Daha sonra, beta interferon (IFNβ) ile MHCI ekspresyonını indükleme, MHCI ve nöronal çekirdek belirteci NeuN için immünoplabeling ve akış sitometrisi ile hücreleri analiz etme adımlarını özetler. Son olarak, MHCI pozitif nöronları tanımlamak ve MHCI ekspresyonunun seviyesini ölçmek için akış sitometri verilerini değerlendirme prosedürlerini açıklar. Ayrıca bu protokolde, hipokampal nöronlara ek olarak veya bunun yerine kortikal nöronları kültüre etmek için yapılabilecek küçük ayarlamalar da belirtilmektedir. Bu protokol, genetik varyasyonlar veya farmakolojik tedaviler kullanılarak belirli hipotezleri test etmek için kolayca değiştirilebilir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 ml Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td>Laboratory Supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm sterile culture dish</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB012924</td>
			<td>Tissue Culture Supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Centrifuge Tubes</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>21-103</td>
			<td>Laboratory Supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml centrifuge tube</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>21-108</td>
			<td>Laboratory Supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mM EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td>FACS Buffer Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP82031Gal</td>
			<td>Tissue Culture Supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well U-bottom plate</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>25-221</td>
			<td>Flow Cytometry Supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td>Neuron Culture Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borate Buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>28341</td>
			<td>Tissue Culture Supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Pasteur Pipette</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13 678 20C</td>
			<td>Laboratory Supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Dissociation Buffer</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>13 151 014</td>
			<td>Flow Cytometry Supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>90083</td>
			<td>Dissociation Solution Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-235</td>
			<td>Tissue Culture Supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91150-20</td>
			<td>Dissection Tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #7 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91197-00</td>
			<td>Dissection Tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140079</td>
			<td>Tissue Culture Supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91113-10</td>
			<td>Dissection Tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91460-11</td>
			<td>Dissection Tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fix and Perm Cell Permeabilization Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>GAS003</td>
			<td>Flow Cytometry Supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Neuron Culture Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hibernate-E Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1247601</td>
			<td>Neuron Culture Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant Sealing Sterilization Pouches</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>181254</td>
			<td>Tissue Culture Supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interferon Beta</td>
			<td>PBL Assay Science</td>
			<td>12405-1</td>
			<td>Flow Cytometry Supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Mark Anti-NeuN-PE Antibody, clone A60</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>FCMAB317PE</td>
			<td>Flow Cytometry Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td>Neuron Culture Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue anti-mouse H-2Kb Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>116513</td>
			<td>Flow Cytometry Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain Solution</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS003126</td>
			<td>Dissociation Solution Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714</td>
			<td>Fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Neuron Culture Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7280</td>
			<td>Neuron Culture Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Pattern Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91100-12</td>
			<td>Dissection Tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo dissection microscope</td>
			<td>Swift</td>
			<td>M29TZ-SM99CL-BTW1</td>
			<td>Dissection Tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91401-10</td>
			<td>Dissection Tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Pipets</td>
			<td>Corning</td>
			<td>357575</td>
			<td>Laboratory Supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruStain FcX (anti-mouse CD16/32) Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>101319</td>
			<td>Flow Cytometry Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154-100ML</td>
			<td>Tissue Culture Supplies</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing the expression of major histocompatibility complex class i on primary murine hippocampal neurons by flow cytometry

Artan kanıtlar, nöro-immün etkileşimlerin hem homeostatik hem de patolojik koşullarda sinir sistemi işlevini etkilediği hipotezini desteklemektedir. Majör histocompatibility complex class I'in (MHCI) iyi çalışılmış bir işlevi, hücre türevi peptitlerin adaptif bağışıklık sistemine, özellikle enfeksiyona yanıt olarak sunulmasıdır. Daha yakın zamanda, MHCI moleküllerinin nöronlar üzerindeki ekspresyonunun, normal gelişim ve nörolojik bozukluklar sırasında sinaptik bağlantıdaki aktiviteye bağlı değişiklikleri modüle edebileceği gösterilmiştir. Bu fonksiyonların beyin sağlığı için önemi, nöronlar üzerinde MHCI ekspresyonunu kolayca tespit eden hassas bir test ihtiyacını desteklemektedir. Burada murine hipokampal nöronların birincil kültürü için bir yöntem ve daha sonra akış sitometrik analizi ile MHCI ekspresyonunun değerlendirilmesi için bir yöntem açıklıyoruz. Murine hipokampus embriyonik gün 18 prenatal fare yavru mikrodissected. Doku, enzymatic ve mekanik teknikler kullanılarak tek bir hücre süspansiyonuna ayrışır, daha sonra nöronal olmayan hücrelerin büyümesini sınırlayan serumsuz bir ortamda kültüre edilir. 7 gün in vitrodan sonra kültürlü hücreler farmakolojik olarak beta interferon ile tedavi ederek MHCI ekspresyonu uyarılır. MHCI molekülleri floresan etiketli bir antikor ile yerinde etiketlenir, daha sonra hücreler enzmatik olmayan bir şekilde tek bir hücre süspansiyonuna ayrışır. Nöronal kimliği doğrulamak için hücreler paraformaldehit ile sabitlenir, permeabilize edilir ve nöronal nükleer antijen NeuN'u tanıyan floresan etiketli bir antikorla etiketlenir. MHCI ekspresyotiği daha sonra akış sitometrik analizi ile nöronlar üzerinde ölçülür. Nöronal kültürler, belirli hipotezleri test etmek için genetik değişiklikler veya farmakolojik müdahalelerle kolayca manipüle edilebilir. Hafif değişikliklerle, bu yöntemler diğer nöronal popülasyonları kültüre etmek veya diğer ilgi çekici proteinlerin ekspresyonlarını değerlendirmek için kullanılabilir.

Burada sunulan prosedür kullanılarak embriyonik 18. Doku, enzymatic ve mekanik yöntemler kullanılarak tek bir hücre süspansiyonuna ayrıştırıldı, daha sonra poli-D-lizin ile önceden tedavi edilen 12 kuyu plakasında kültürlendi. 7 günlük in vitrodan sonra, hücreler sadece 72 saat boyunca 100 U/mL IFNβ veya media ile tedavi edildi ve bu da MHCI ekspresyonunun uyarılmasıydı. Nöronlar, enzmatik olmayan bir şekilde tek bir hücre süspansiyonuna dönüşmeden önce MHCI için yerinde boyandı. Nöronlar sabitlendi ve permeabilize edildi, daha sonra nöronal çekirdek belirteci NeuN için hücre içi lekelendi. Örnekler akış sitometrisi ile değerlendirildi ve veriler ilişkili yazılım kullanılarak analiz edildi. Nöronlar, hücresel döküntüleri ve çiftleri dışlamak için toplam olayların sıralı gating yoluyla tanımlanmıştır (Şekil 1A,B). Nöronlar kesin olarak NeuN-pozitiflik ile tanımlanmıştır (Şekil 1C). NeuN+ hücreleri, y eksenindeki moda normalleştirilmiş hücre sayısı ve x eksenindeki MHCI floresan ile bir histogramdaki hücreler çizilerek MHCI pozitifliği açısından daha fazla analiz edildi. Pozitif ve negatif zirvelerin ayrıştığı noktada bir MHCI+ kapısı çizildi (Şekil 1D). Bundan, MHCI boyama için pozitif nöronların yüzdesi (Şekil 1E) ve ortanca floresan yoğunluğu (MFI; Şekil 1F) hesaplandı. Sonuçlar, IFNβ tedavisinin MHCI'nın hücre dışı lekelenme için pozitif nöron yüzdesini ve MFI tarafından belirtildiği gibi ifade seviyesini önemli ölçüde yükselttiğını göstermektedir. İstatistiksel analiz ve grafiksel gösterim, piyasada bulunan istatistiksel yazılım kullanılarak yapıldı.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61436/61436fig1v2.jpg"> Şekil 1: Temsili gating stratejisi ve MHCI nicelemesi. Primer hipokampal nöronlar sadece IFNβ veya media 100 U/mL ile tedavi edildi. 72 saat sonra, nöronlar Pasifik Mavi konjuge MHCI (1 μg/mL H2-Kb),daha sonra PE-konjuge NeuN (1:100 seyreltme) ile hücre içi olarak etiketlendi. Hücresel floresan akış sitometrisi ile değerlendirildi ve veriler analiz edildi. (A) Toplam olaylar SSC-A (günlük) vs FSC-A (doğrusal) olarak çizildi ve hücreler (P1) enkaz dışlamak için kapılıydı. (B) P1 popülasyonu içinde, hücreler tek hücre popülasyonu geçidi için FSC-H (doğrusal) vs FSC-A (doğrusal) olarak çizildi. (C) Tek hücre popülasyonu içinde hücreler SSC-A (log) vs NeuN-PE (log) olarak çizildi. NeuN+ hücreleri nöronları tanımlamak için kapılıydı. (D) Nöron popülasyonu içinde hücreler x ekseninde MHCI-PacBlu ile bir histogram üzerinde çizildi ve hücre sayıları y ekseninde moda normalleştirildi. MHCI lekeleme için pozitif nöronların yüzdesini ölçmek için yatay bir kapı çizildi. (E) Sadece medyada ve IFNβ ile tedavi edilen nöronlarda NeuN+ hücrelerinin yüzde MHCI+ miktarının ölçülmesi. (F) Medya (siyah) ve IFNβ ile tedavi edilen (kırmızı) nöronlardaki NeuN+ hücrelerinde MHCI'nın ortanca floresan yoğunluğunun (MFI) ölçülmesi. İstatistiksel önem, eşleşmeyen t testi ile hesaplandı. **, P < 0.01. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61436/61436fig1v2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="4">Nöron Büyüme Ortamı (50 ml)</td>
		</tr>
<tr>
<td>reaktif</td>
			<td>Son Konsantrasyon</td>
			<td>Stok Konsantrasyonu</td>
			<td>50 ml için</td>
		</tr>
<tr>
<td>B27 eki</td>
			<td>2%</td>
			<td>100%</td>
			<td>1,0 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-glutamin</td>
			<td>2 mM</td>
			<td>200 mM</td>
			<td>0,5 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>Penisilin-Streptomisiin</td>
			<td>100 U/ml</td>
			<td>10.000 U/ml</td>
			<td>0,5 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nörobakal medya</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>48,0 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">FACS arabelleği (500 ml)</td>
		</tr>
<tr>
<td>reaktif</td>
			<td>Son Konsantrasyon</td>
			<td>Stok Konsantrasyonu</td>
			<td>500 ml için</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fetal Sığır Serumu</td>
			<td>2%</td>
			<td>100%</td>
			<td>10 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>Edta</td>
			<td>1 mM</td>
			<td>500 mM</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>dPBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>489 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4"></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Papain Ayrışma Çözümü</td>
		</tr>
<tr>
<td>reaktif</td>
			<td>Son Konsantrasyon</td>
			<td>Stok Konsantrasyonu</td>
			<td>1 ml için</td>
		</tr>
<tr>
<td>Papain Süspansiyon</td>
			<td>20 U/ml</td>
			<td>1000 U/ml</td>
			<td>0.020 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>DNase I</td>
			<td>2,5 U/ml</td>
			<td>2500 U/ml</td>
			<td>0.001 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hazırda Beklet-E</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1,0 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Not: İhtiyaç duyulan Papain Ayrıştırma Çözeltisi'nin hacmi, parçalanan embriyonik beyin sayısına bağlı olarak değişecektir. Hipokampal nöronlar için beyin başına 0,5 ml veya kortikal nöronlar için beyin başına 1,0 ml hazırlayın.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Not: Hibernate-E'de papain süspansiyonunu yaklaşık 3 dakika boyunca girdaplayarak ayrışma çözeltisi hazırlayın. Papain iyice çözüldükten sonra, DNase I ekleyin. Girdap DNase I.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: Medya ve çözümler.

Watch this Scientific Journal Video about Assessing the Expression of Major Histocompatibility Complex Class I on Primary Murine Hippocampal Neurons by Flow Cytometry at JoVE.com

Assessing the Expression of Major Histocompatibility Complex Class I on Primary Murine Hippocampal Neurons by Flow Cytometry

Bu protokol, embriyonik fare beyninden birincil hipokampal nöronları kültleme için bir yöntem açıklanmaktadır. Kültürlü nöronların hücre dışı yüzeyinde majör histocompatibility complex class I'in ekspresyolü daha sonra akış sitometrik analizi ile değerlendirilir.

Birincil Murine Hipokampal Nöronlarda Majör Histocompatibility Complex Class I'in Akış Sitometrisi ile İfadesinin Değerlendirilmesi

Increasing evidence supports the hypothesis that neuro-immune interactions impact nervous system function in both homeostatic and pathologic conditions. A ...

assessing-expression-major-histocompatibility-complex-class-i-on

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

3.3K Görüntüleme.  University of North Carolina at Charlotte. Bu protokol, embriyonik fare beyninden birincil hipokampal nöronları kültleme için bir yöntem açıklanmaktadır. Kültürlü nöronların hücre dışı yüzeyinde majör histocompatibility complex class I'in ekspresyolü daha sonra akış sitometrik analizi ile değerlendirilir.

Video: Assessing the Expression of Major Histocompatibility Complex Class I on Primary Murine Hippocampal Neurons by Flow Cytometry

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam cells, immune cells, vascular endothelial and smooth muscle cells, platelets, extracellular matrix, and a lipid-rich core with extensive necrosis and fibrosis of surrounding tissues.1 The innate and adaptive arms of the immune response are involved in the initiation, development and persistence of atherosclerosis.2, 3 There is a significant body of evidence that different subsets of the immune cells, such as macrophages, dendritic cells, T and B lymphocytes, are present within the aortas of healthy and atherosclerosis-prone mice4. Additionally, immune cells are found in the surrounding aortic adventitia which suggests an important role of this tissue in atherogenesis.2
For some time, the quantitative detection of different types of immune cells, their activation status, and the cellular composition within the aortic wall was limited by RT-PCR and immunohistochemical methods for the study of atherosclerosis. Few attempts were made to perform flow cytometry using human aortas, and a number of problems, such as a high autofluorescence, have been reported5,6. Human atherosclerotic plaques were digested with collagenase 1, and free cells were collected and stained for CD14+/CD11c+ to highlight macrophage-derived foam cells. In this study, a "mock" channel was used to avoid false-positive staining.6 Necrotic materials accumulating during the digestion process give rise in a large amount of debris that generates a high autofluorescence in aortic samples. To resolve this problem, a panel of negative and positive controls has been proposed, but only double staining could be applied in these samples. We have developed a new flow cytometry-based method7 to analyze the immune cell composition and characterize the activation, proliferation, differentiation of immune cells in healthy and atherosclerosis-prone aorta. This method allows the investigation of the immune cell composition of the aortic wall and opens possibilities to use a broad spectrum of immunological methods for investigations of immune aspects of this disease.

This paper presents a flow cytometry-based method to investigate the immune composition of aortas. The paper also illustrates an additional technique that allows examining surrounding adventitia and vessel wall separately. This method opens possibilities to perform phenotypical analyses of aortic leukocytes and apply several immunological assays for atherosclerosis studies.

Bağışıklık Hücreleri murin aorta içinde Sitometrisi Analizi

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response following an infection. Despite efforts to identify unique surface marker on Tregs, the only unique feature is their ability to suppress the proliferation and function of effector T cells. While it is clear that only in vitro assays can be used in assessing human Treg function, this becomes problematic when assessing the results from cross-sectional studies where healthy cells and cells isolated from subjects with autoimmune diseases (like Type 1 Diabetes-T1D) need to be compared. There is a great variability among laboratories in the number and type of responder T cells, nature and strength of stimulation, Treg:responder ratios and the number and type of antigen-presenting cells (APC) used in human in vitro suppression assays. This variability makes comparison between studies measuring Treg function difficult. The Treg field needs a standardized suppression assay that will work well with both healthy subjects and those with autoimmune diseases. We have developed an in vitro suppression assay that shows very little intra-assay variability in the stimulation of T cells isolated from healthy volunteers compared to subjects with underlying autoimmune destruction of pancreatic &beta;-cells. The main goal of this piece is to describe an in vitro human suppression assay that allows comparison between different subject groups. Additionally, this assay has the potential to delineate a small loss in nTreg function and anticipate further loss in the future, thus identifying subjects who could benefit from preventive immunomodulatory therapy1. Below, we provide thorough description of the steps involved in this procedure. We hope to contribute to the standardization of the in vitro suppression assay used to measure Treg function. In addition, we offer this assay as a tool to recognize an early state of immune imbalance and a potential functional biomarker for T1D.

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Tregs are potent suppressors of the immune system. There is a lack of unique surface markers to define them, hence, definitions of Tregs are primarily functional. Here we describe an optimized in vitro assay capable of identifying immune imbalance in subjects at risk to develop T1D.

Insan In Vitro Bağışıklık Dengesizlik Erken Devlet Tanıma Tarama Aracı Olarak Bastırılması

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable method of analysis by flow cytometry to study nanoparticle interaction with immune cells. Primary immune cells can be easily purified from human or mouse tissues by antibody-mediated magnetic isolation. In the first instance, the different cell populations running in a flow cytometer can be distinguished by the forward-scattered light (FSC), which is proportional to cell size, and the side-scattered light (SSC), related to cell internal complexity. Furthermore, fluorescently labeled antibodies against specific cell surface receptors permit the identification of several subpopulations within the same sample. Often, all these features vary when cells are boosted by external stimuli that change their physiological and morphological state. Here, 50 nm FITC-SiO2 nanoparticles are used as a model to identify the internalization of nanostructured materials in human blood immune cells. The cell fluorescence and side-scattered light increase after incubation with nanoparticles allowed us to define time and concentration dependence of nanoparticle-cell interaction. Moreover, such protocol can be extended to investigate Rhodamine-SiO2 nanoparticle interaction with primary microglia, the central nervous system resident immune cells, isolated from mutant mice that specifically express the Green Fluorescent Protein (GFP) in the monocyte/macrophage lineage. Finally, flow cytometry data related to nanoparticle internalization into the cells have been confirmed by confocal microscopy.

Analysis of nanoparticle interaction with defined subpopulations of immune cells by flow cytometry.

Sitometrisi ile Primer İmmün hücre alt Floresan Nanoparçacık Etkileşimleri Algılama

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin proteolipid protein (PLP) 139-151-induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in SJL mice and cardiac myosin heavy chain-&#945; (Myhc) 334-352-induced experimental autoimmune myocarditis (EAM) in A/J mice. Two sets of cocktails of dextramer reagents were used, where dextramers+ cells were analyzed by laser scanning confocal microscope (LSCM): EAE, IAs/PLP 139-151 dextramers (specific)/anti-CD4 and IAs/Theiler&#8217;s murine encephalomyelitis virus (TMEV) 70-86 dextramers (control)/anti-CD4; and EAM, IAk/Myhc 334-352 dextramers/anti-CD4 and IAk/bovine ribonuclease (RNase) 43-56 dextramers (control)/anti-CD4. LSCM analysis of brain sections obtained from EAE mice showed the presence of cells positive for CD4 and PLP 139-151 dextramers, but not TMEV 70-86 dextramers suggesting that the staining obtained with PLP 139-151 dextramers was specific. Likewise, heart sections prepared from EAM mice also revealed the presence of Myhc 334-352, but not RNase 43-56-dextramer+ cells as expected. Further, a comprehensive method has also been devised to quantitatively analyze the frequencies of antigen-specific CD4 T cells in the &#8216;Z&#8217; serial images.

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

The protocol to detect self-reactive CD4 T cells in brain and heart by direct staining with major histocompatibility complex class II dextramers has been described in this report. For comprehensive analysis, a reliable method to enumerate the frequencies of antigen-specific CD4+ T cells in situ is also devised.

Majör Histo-uyum Kompleks sınıf II Dextramers kullanarak Beyin ve Heart reaktif CD4 T hücrelerinin in situ tespiti

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

We report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate plasmacytoid dendritic cells (pDC) with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for functional studies of pDC.

Fare kemik iliğinden plazmasitoid dendritik hücreleri Saflaştırılması floresans ile aktive edilen hücre sınıflandırma

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, including phagocytosis of damaged synapses or cells, debris, and/or invading pathogens. Impaired phagocytic function has been implicated in the pathogenesis of diseases such as Alzheimer's and age-related macular degeneration, where amyloid-&#946; plaque and drusen accumulate, respectively. Despite its importance, microglial phagocytosis has been challenging to assess in vivo. Here, we describe a simple, yet robust, technique for precisely monitoring and quantifying the in vivo phagocytic potential of retinal microglia. Previous methods have relied on immunohistochemical staining and imaging techniques. Our method uses flow cytometry to measure microglial uptake of fluorescently labeled particles after intravitreal delivery to the eye in live rodents. This method replaces conventional practices that involve laborious tissue sectioning, immunostaining, and imaging, allowing for more precise quantification of microglia phagocytic function in just under six hours. This procedure can also be adapted to test how various compounds alter microglial phagocytosis in physiological settings. While this technique was developed in the eye, its use is not limited to vision research.

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglial phagocytosis is critical for the maintenance of tissue homeostasis and inadequate phagocytic function has been implicated in pathology. However, assessing microglia function in vivo is technically challenging. We have developed a simple but robust technique for precisely monitoring and quantifying the phagocytic potential of microglia in a physiological setting.

Retina Mikroglial Fagositik Fonksiyonu değerlendirilmesi<em&gt; İn Vivo</em&gt; A Akış Sitometri bazlı analiz kullamlarak

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

Floresans tabanlı Nöraminidaz İnhibisyonu Tahlili antivirallerin nöraminidaz inhibitörü Class Nezle Virüslerinden eğilimi değerlendirilebilir

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

Yalıtım ve fare ve insan alveoler makrofajlar Vitro kültürü

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can have pathological significance. An ideal method for examining alterations to monocytes is whole blood flow cytometry as the minimal handling of samples by this method limits artifactual cell activation. However, many different approaches are taken to gate the monocyte subsets leading to inconsistent identification of the subsets between studies. Here we demonstrate a method using whole blood flow cytometry to identify and characterize human monocyte subsets (classical, intermediate, and non-classical). We outline how to prepare the blood samples for flow cytometry, gate the subsets (ensure contaminating cells have been removed), and determine monocyte subset expression of surface markers &#8212; in this example M1 and M2 markers. This protocol can be extended to other studies that require a standard gating method for assessing monocyte subset proportions and monocyte subset expression of other functional markers.

Here we present a protocol for characterizing monocyte subsets by whole blood flow cytometry. This includes outlining how to gate the subsets and assess their expression of surface markers and giving an example of the assessment of the expression of M1 (inflammatory) and M2 markers (anti-inflammatory).

İnsan monosit alt kümeleri tam kan tarafından karakterizasyonu Akış Sitometresi Analizi

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

Stability and Structure of Bat Major Histocompatibility Complex Class I with Heterologous &beta;2-Microglobulin

The major histocompatibility complex (MHC) plays a pivotal role in antigen peptide presentation and T cell immune responses against infectious disease and tumor development. The hybrid MHC I complexed with heterologous &#946;2-microglobulin (&#946;2m) substitution from different species can be stabilized in vitro. This is a feasible means to study MHC I of mammals, when the homologous &#946;2m is not available. Meanwhile, it is indicated that mammalian &#946;2m substitution does not significantly affect peptide presentation. However, there is limited summarization regarding the methodology and the technology for the hybrid MHC I complexed with heterologous &#946;2-microglobulin (&#946;2m). Herein, methods to evaluate the feasibility of heterologous &#946;2m substitution in MHC I study are presented. These methods include preparation of expression constructs; purification of inclusion bodies and refolding of the MHC complex; determination of protein thermostability; crystal screening and structure determination. This study provides a recommendation for understanding function and structure of MHC I, and is also significant for T cell response evaluation during infectious disease and tumor immunotherapy.

Stability and Structure of Bat Major Histocompatibility Complex Class I with Heterologous &#946;2-Microglobulin

The protocol describes experimental methods to obtain stable major histocompatibility complex (MHC) class I through potential &#946;2-microglobulin (&#946;2m) substitutions from different species. The structural comparison of MHC I stabilized by homologous and heterologous &#946;2m were investigated.

Heterologöz β2-Microglobulin ile Yarasa Major Histocompatibility Complex Class I'in Stabilitesi ve Yapısı

The major histocompatibility complex (MHC) plays a pivotal role in antigen peptide presentation and T cell immune responses against infectious disease and ...