Yazarlar, Dr. Beth Chaffee, DVM, PhD, DACVP'nin bu tekniğin geliştirilmesine kritik katkısını kabul etmektedir.

Açıklanan tüm hayvan deneyleri, Cambridge Üniversitesi, Cambridge, İngiltere'nin kurumsal hayvan bakımı ve kullanım komitesi tarafından onaylanmıştır.
1. Hücre hatlarının hazırlanması
<ol><li>Geleneksel hücre kültürü veya farelere enjeksiyon için laboratuvarın standart hücre kültürü protokollerine uygun olarak hücre hatlarını büyütün. Burada kullanılan standart protokoller, Dulbecco'nun %10 fetal sığır serumu (FBS), L-glutamin ve penisilin / streptomisin (bundan böyle tam büyüme ortamı olarak anılacaktır) içeren modifiye Eagle's besiyerinde büyümedir. NOT: Bu deneyde, Abrams osteosarkom hücreleri Balb / c Foxn1 nu / nu farelerde kullanılmıştır. Meme kanseri çalışmaları için, Balb / c farelerde 4T1 hücreleri ve C57BL / 6 farelerde EO771 hücreleri kullanılır.</li>
	<li>Havalandırmalı doku kültürü şişelerinde veya 6 kuyucuklu doku kültürü plakalarında 37 ° C'de% 5 CO2'de hücreleri büyütün.</li>
	<li>İlgilenilen hücre hattını geçin ve hücreler bu hücrelerin farelere enjeksiyonu ile yaygın olarak kullanılan bir akıcılığa ulaştığında hücreleri enjeksiyon için hazırlayın.</li>
</ol>2. Hayvanlar
<ol><li>Hayvanların hızlı büyüme fazının ötesinde olduklarından ve yetişkinlik ve iskelet olgunluğuna ulaştıklarından emin olmak için deri altı tümör oluşumu için en az 6-8 haftalık olan Balb / c Foxn1 nu / nu farelerini kullanın.</li>
	<li>Erkek veya dişi fareler kullanın. Hormona duyarlı hücre hatlarını seçerken istisnalar yapın (örneğin, dişi farelerde meme kanseri hücreleri ve erkek farelerde prostat kanseri hücreleri).</li>
	<li>Ksenogreft deneyleri için, normal koşullar altında sağlam bir fare bağışıklık sistemi ile uyumsuz olan hücre hattına dayanan immün yetmezlikli atletik çıplak fareler kullanın.</li>
	<li>Murin hücre hatlarını kullanan allogreft deneyleri için, bu aynı zamanda farklı fare genetik ve bağışıklık geçmişlerine dayanarak da önerilir. Bununla birlikte, sinjenik deneyler için, ilgilenilen hücre çizgisiyle aynı suştaki hayvanları kullanın.</li>
	<li>Kurumun hayvancılık politikalarına bağlı olarak standart yoğunluklarda ev hayvanları.</li>
</ol>3. Subkutan tümörler
<ol><li>Tripsinizasyon yoluyla kültürden hücre hatlarını toplayın ve steril fosfat tamponlu salin (PBS) içinde yeniden askıya alın.</li>
	<li>Hücre canlılığını değerlendirin ve tripan mavisi dışlama yöntemiyle hücre yoğunluğunu belirleyin. Hücreleri saymak için bir hemositometre veya otomatik bir hücre sayacı kullanın. Deri altı tümörleri oluşturmak için farelere enjeksiyon için minimum% 90'lık bir hücre canlılığı kullanılmalıdır.</li>
	<li>Hücre yoğunluğunu, 0,1 ila 0,15 mL (100 ila 150 μL) steril PBS'nin son hacminde 1-2 x 105 hücre enjekte edecek şekilde ayarlayın. Enjeksiyona kadar hücreleri buz üzerinde tutun.</li>
	<li>Alternatif olarak, pelet hücreleri 5 dakika boyunca 800 x g'de santrifüj edilerek. Süpernatantı atın ve peletlenmiş hücreleri seyreltilmemiş steril bazal membran matris ortamında yeniden askıya alarak 0,1 ila 0,15 mL'lik (100 ila 150 μL) son hacimde 1-2 x 105 hücre elde edin. Daha sonraki kullanıma kadar hücreleri buz üzerinde tutun.</li>
	<li>Oksijen anestezisinde izofluran ile deri altı tümör büyümesi için kullanılacak fareleri anestezi altına alın. 2 L/dak oksijende %5 izofluran indüksiyon dozu ve 2 L/dak oksijende %2-3 izofluran idame dozu kullanın. Daha fazla ilerlemeden önce yanıp sönme veya pedal reflekslerinin eksikliğini kontrol edin. NOT: İzofluran inhalasyonel bir anesteziktir. İzofluranı, uygun süpürme ve serbest gaz toplama sistemleri ile iyi havalandırılan bir alanda kullanın. Anestezi indüksiyonu, bakımı ve izlenmesi için bir plan geliştirmek ve laboratuvar personelinin anestezi izleme ve inhalan anestezik ajanların kullanımı konusunda uygun eğitime sahip olduğundan emin olmak için lütfen kurumsal veteriner hekim personeline danışın.</li>
	<li>Anestezi uygulanan farelerin toraksının dorsal bölgesinden veya karnından saçları epilasyon çözeltisi veya elektrikli bir kesme makinesi ile çıkarın. Cilde gelebilecek olası travmayı en aza indirmek için epilasyon solüsyonu tercih edilir. Atimik çıplak fareler kullanıyorsanız bu adımı atlayın.</li>
	<li>Hücre süspansiyonunun enjeksiyonundan önce hazırlanan alanı% 70 etanol çubukla temizleyin.</li>
	<li>Omuz bıçaklarının hareketinden etkilenmemek için hücreleri göğüs kafesinin veya karnın dorsal bölgesine deri altından enjekte etmek için 27 G iğneli 1 mL'lik bir tüberkülin şırıngası kullanın. Alternatif olarak, hücreleri ticari olarak temin edilebilen hücre dışı matriste bir süspansiyon olarak deri altından enjekte edin. NOT: Ticari olarak temin edilebilen hücre dışı matrise enjeksiyon, hücre süspansiyonunun deri altı boşluğundaki göçünü sınırlayacaktır, çünkü bu matrisler oda sıcaklığında katılaşır.</li>
	<li>Fareleri ambulatuvara kadar bireysel kafeslerde bir ısıtma yastığı üzerinde kurtarın. Fareler daha sonra temiz, kuru yataklarla normal kafeslerine yerleştirilebilir.</li>
	<li>Dorsal toraks veya karın bölgesini kaplayan subkutan tümörün boyutunu bir kumpas ile izleyin ve deri altı tümörlerin ülsere olmadığından veya farelerin kurumların hayvan bakım ve kullanım komitesi tarafından belirlenen erken çıkarma kriterlerini karşılamadığından emin olmak için haftalık olarak vücut ağırlıklarını ölçün. Cilt ülserasyonu veya santral tümör nekrozu riskini azaltmak için herhangi bir boyutta maksimum 15 mm'lik bir tümör boyutu önerilir. NOT: İzin verilen maksimum tümör boyutunu/hacmini belirlemek için yerel kılavuzlara başvurun.</li>
	<li>Üç ila dört hafta sonra deri altı tümörleri taşıyan fareleri CO2 inhalasyonu ve ardından servikal çıkık ile ötenazi yapın. Kurumun fare ötenazisi için kabul edilebilir politikalarına uyun.</li>
	<li>Aseptik cerrahi teknik kullanarak deri altı tümörleri toplayın. Tüyü çıkardıktan sonra% 70 etanol ile tümörün üstündeki cildi daha önce olduğu gibi sterilize edin (varsa). Tümörün üzerini örten deriden #15 neşter bıçağı ile (neşter bıçağı saplı veya neştersiz) kesin. Tümörü çevreleyen bağlı yumuşak dokulardan bir çift steril cerrahi makasla keskin bir şekilde diseke edin.</li>
	<li>Tümörü, tam büyüme ortamı içeren 6 delikli doku kültürü plakalarına yerleştirin ve #15 neşter bıçağı ile (neşter bıçağı saplı veya sapsız) önceden belirlenmiş boyutta (~ 0,6 mm x 0,6 mm x 0,6 mm - 0,25 mm 3'e kadar3 ila 1 mm x 1 mm x 1 mm - 1 mm3) birden fazla küçük parçaya bölün.</li>
	<li>Tümör fragmanlarını intratibial implantasyon zamanına kadar oda sıcaklığında steril tam büyüme ortamında tutun. Lusiferaz veya floresan muhabir genleri taşıyan hücre hatları için, farelere intratibial implantasyondan önce tümör canlılığını doğrulamak için ex-vivo biyolüminesan veya floresan görüntüleme kullanın.</li>
	<li>Kriyoprezervasyon için,% 20 FBS ve% 10 dimetil sülfoksit (DMSO) ile desteklenmiş tam büyüme ortamına aynı kriyoviyal içine birden fazla parça yerleştirin. Ticari bir kriyoprezervasyon sistemi kullanarak –80 °C'de kademeli olarak dondurun ve sıvı azotta uzun süre saklayın. Tümör fragmanlarını sonraki analizler için koruyun, ancak gelecekteki implantasyon için değil, sıvı azot daldırma kullanarak anında dondurma ile koruyun. Bu donmuş tümör parçalarını -80 ° C'de uzun süre saklayın. NOT: Daha önce snap frozen tümörlerin in vivo8 infüzyon yapmayacağı ve büyümeyeceği bildirilmiştir.</li>
</ol>4. Subkutan tümör fragmanlarının cerrahi implantasyonu
<ol><li>Cerrahi implantasyondan önce deri altı tümörün taze veya kriyokorunmuş parçalarını tam büyüme ortamında oda sıcaklığına getirin.</li>
	<li>Bölüm 3'te açıklandığı gibi oksijen anestezisinde izofluran kullanarak ilgili suşun farelerini uyuşturun. Devam etmeden önce pedal reflekslerinin eksikliğini kontrol edin. Perioperatif analjezi sağlamak için subkutan buprenorfin'i 0.02-0.05 mg / kg'lık bir dozda uygulayın. Bu, gerekirse ameliyat sonrası dönemde her 6-8 saatte bir tekrarlanabilir.</li>
	<li>Cilde potansiyel travmayı en aza indirmek için sağ diz eklemindeki ve arka bacağın proksimal tibiasındaki kılları epilasyon solüsyonu ile çıkarın.</li>
	<li>Hazırlanan bölgeyi cerrahi antiseptik ile ovalayın. Önce %70 etanol çubukla ovalayın ve ardından alternatif klorheksidin ve tuzlu su ovma ile ovalayın.</li>
	<li>Proksimal tibiayı, eklemi esnetirken ve uzatırken diz eklemine sadece distal bölge olarak görselleştirin.</li>
	<li>Ekstremitenin medial kısmında proksimal tibia seviyesinde #15 neşter bıçağı ile (neşter bıçağı saplı veya neştersiz) 3-4 mm'lik bir kesi oluşturun. Proksimal tibianın medial korteksini açığa çıkarmak için deri ve deri altı dokusundan kesin.</li>
	<li>Proksimal tibianın medial korteksinde küçük bir delik oluşturmak için ucu döndürürken 25 G'lik bir iğnenin ucuyla hafif bir basınç uygulayın. Bu deliği diz eklemine yaklaşık 2 mm distal olarak, kraniyal ve kaudal tibial korteksler arasında eşit uzaklıkta bir noktada yapın. Tümör fragmanlarının boyutuna bağlı olarak iğne boyutunu seçin.</li>
	<li>Tümör parçalarını almak ve proksimal tibianın medüller boşluğuna yerleştirmek için steril forseps kullanın. Tümör parçasını medüller kanala manipüle etmek için 27 ila 30 G'lik bir iğne kullanın. Tümör fragmanlarının boyutuna bağlı olarak, her bir tibia içine en az 0.5 mm3 toplam tümör hacmi implante edin. Bu, oluşturulan tümör fragmanlarının boyutuna bağlı olarak 1 veya daha fazla tümör fragmanının implantasyonunu gerektirebilir. NOT: Greftin kemik dışına çıkmasını önlemek veya sınırlamak için yapılan değişiklikler, kemik kusuruna kemik mumu veya kemik çimentosu veya jel köpük veya deri altı yağ greftinin kemikteki deliğin üzerine yerleştirilmesi olacaktır.</li>
	<li>Cilt kenarlarını steril sıvı doku yapıştırıcısı veya tek bir cilt sütürü ile yerleştirin. Bu sitede yara klipsleri kullanmayın. Ameliyat sonrası dönemde floresan görüntüleme kullanıyorsanız dikkatli olun, çünkü hem doku yapıştırıcıları hem de dikiş floresan potansiyeline sahiptir.</li>
	<li>Fareleri ambulatuvara kadar bireysel kafeslerde bir ısıtma yastığı üzerinde kurtarın.</li>
</ol>5. Seri ve bitiş noktası değerlendirmesi
<ol><li>Daha önce tarif edildiği gibi oksijen anestezisinde izofluran kullanarak fareleri uyuşturun.</li>
	<li>Tibial tümör büyümesini haftalık dijital radyografi, biyolüminesans veya floresan görüntüleme ile invaziv olmayan bir şekilde değerlendirin (lusiferaz eksprese eden hücreler veya floresan muhabir geni kullanılıyorsa). İmplantasyon bölgesindeki uzuvun kaliper ölçümleri uyanık farelerde de yapılabilir.</li>
	<li>Tümör taşıyan farelerin geleneksel olarak izlenmesine ek olarak (vücut ağırlığı, aktivite seviyesi, solunum hızı, tımar, duruş, mentasyon ve davranış) fareleri arka ekstremite topallığı, şişlik ve cerrahi alan enfeksiyonu belirtileri açısından haftalık olarak izleyin.</li>
	<li>Cilt cerrahi yarasını ilk 10-14 gün boyunca aşırı kızarıklık, şişlik, drenaj ve yara ayrışması açısından cilt yarası iyileşene kadar izleyin. 4-5 hafta sonra, fareleri canlı veya ötenazi sonrası çalışma sonucu değerlendirmesine göre değerlendirin.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Bryda, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mighty+Mouse:+the+impact+of+rodents+on+advances+in+biomedical+research.">The Mighty Mouse: the impact of rodents on advances in biomedical research.</a> Missouri Medicine. 110 (3), 207-211 (2013).</li><li>Vandamme, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+rodents+as+models+of+human+diseases.">Use of rodents as models of human diseases.</a> Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 6 (1), 2-9 (2014).</li><li>Simmons, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+Models+of+Bone+Metastasis.">Animal Models of Bone Metastasis.</a> Veterinary Pathology. 52 (5), 827-841 (2015).</li><li>Wolfe, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+zoledronic+acid+and+amputation+on+bone+invasion+and+lung+metastasis+of+canine+osteosarcoma+in+nude+mice.">Effect of zoledronic acid and amputation on bone invasion and lung metastasis of canine osteosarcoma in nude mice.</a> Clinical and Experimental Metastasis. 28 (4), 377-389 (2011).</li><li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Clinicopathological+features+and+survival+outcomes+of+patients+with+different+metastatic+sites+in+stage+IV+breast+cancer.">The Clinicopathological features and survival outcomes of patients with different metastatic sites in stage IV breast cancer.</a> BMC Cancer. 19 (1), 1091 (2019).</li><li>James, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=metastases+from+breast+carcinoma:+histopathological+-+radiological+correlations+and+prognostic+features.">metastases from breast carcinoma: histopathological - radiological correlations and prognostic features.</a> British Journal of Cancer. 89 (4), 660-665 (2003).</li><li>Pantel, K., Brakenhoff, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+metastatic+cascade.">Dissecting the metastatic cascade.</a> Nature Reviews Cancer. 4 (6), 448-456 (2004).</li><li>Chaffee, B. K., Allen, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clinically+relevant+mouse+model+of+canine+osteosarcoma+with+spontaneous+metastasis.">A clinically relevant mouse model of canine osteosarcoma with spontaneous metastasis.</a> In Vivo. 27 (5), 599-603 (2013).</li><li>Munajat, I., Zulmi, W., Norazman, M. Z., Wan Faisham, W. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+volume+and+lung+metastasis+in+patients+with+osteosarcoma.">Tumour volume and lung metastasis in patients with osteosarcoma.</a> Journal of Orthopaedic Surgery (Hong Kong). 16 (2), 182-185 (2008).</li><li>Huang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+and+clinicopathological+features+of+osteosarcoma+metastasis+to+the+lung:+A+population-based+study.">Risk and clinicopathological features of osteosarcoma metastasis to the lung: A population-based study.</a> Journal of Bone Oncology. 16, 100230 (2019).</li><li>Li, W., Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+of+patients+with+primary+osteosarcoma+and+lung+metastases.">Survival of patients with primary osteosarcoma and lung metastases.</a> Journal of BUON. 23 (5), 1500-1504 (2018).</li><li>Campbell, J. P., Merkel, A. R., Masood-Campbell, S. K., Elefteriou, F., Sterling, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+bone+metastasis.">Models of bone metastasis.</a> Journal of Visualized Experiments. (67), e4260 (2012).</li><li>Maloney, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratibial+Injection+Causes+Direct+Pulmonary+Seeding+of+Osteosarcoma+Cells+and+Is+Not+a+Spontaneous+Model+of+Metastasis:+A+Mouse+Osteosarcoma+Model.">Intratibial Injection Causes Direct Pulmonary Seeding of Osteosarcoma Cells and Is Not a Spontaneous Model of Metastasis: A Mouse Osteosarcoma Model.</a> Clinical Orthopedics and Related Research. 476 (7), 1514-1522 (2018).</li><li>Dai, J., Hensel, J., Wang, N., Kruithof-de Julio, M., Shiozawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+for+studying+prostate+cancer+bone+metastasis.">Mouse models for studying prostate cancer bone metastasis.</a> BoneKey Reports. 5, 777 (2016).</li><li>Marques da Costa, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+in+vivo+orthotopic+bioluminescent+xenograft+models+from+human+osteosarcoma+cell+lines+in+Swiss+nude+and+NSG+mice.">Establishment and characterization of in vivo orthotopic bioluminescent xenograft models from human osteosarcoma cell lines in Swiss nude and NSG mice.</a> Cancer Medicine. 7 (3), 665-676 (2018).</li><li>Raheem, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+patient-derived+intra-femoral+xenograft+model+of+bone+metastatic+prostate+cancer+that+recapitulates+mixed+osteolytic+and+osteoblastic+lesions.">A novel patient-derived intra-femoral xenograft model of bone metastatic prostate cancer that recapitulates mixed osteolytic and osteoblastic lesions.</a> Journal of Translational Medicine. 9, 185 (2011).</li><li>Sasaki, H., Iyer, S. V., Sasaki, K., Tawfik, O. W., Iwakuma, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+intrafemoral+injection+with+minimized+leakage+as+an+orthotopic+mouse+model+of+osteosarcoma.">An improved intrafemoral injection with minimized leakage as an orthotopic mouse model of osteosarcoma.</a> Analytical Biochemistry. 486, 70-74 (2015).</li><li>Valastyan, S., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+metastasis:+molecular+insights+and+evolving+paradigms.">Tumor metastasis: molecular insights and evolving paradigms.</a> Cell. 147 (2), 275-292 (2011).</li><li>Yu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-iliac+Artery+Injection+for+Efficient+and+Selective+Modeling+of+Microscopic+Bone+Metastasis.">Intra-iliac Artery Injection for Efficient and Selective Modeling of Microscopic Bone Metastasis.</a> Journal of Visualized Experiments. (115), e53982 (2016).</li><li>Kuchimaru, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reliable+murine+model+of+bone+metastasis+by+injecting+cancer+cells+through+caudal+arteries.">A reliable murine model of bone metastasis by injecting cancer cells through caudal arteries.</a> Nature Communications. 9 (1), 2981 (2018).</li><li>Haley, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+Bone+Metastases+in+Skeletally+Immature+Mice.">Enhanced Bone Metastases in Skeletally Immature Mice.</a> Tomography. 4 (2), 84-93 (2018).</li><li>Lei, Z. G., Ren, X. H., Wang, S. S., Liang, X. H., Tang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunocompromised+and+immunocompetent+mouse+models+for+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma.">Immunocompromised and immunocompetent mouse models for head and neck squamous cell carcinoma.</a> Onco Targets and Therapy. 9, 545-555 (2016).</li><li>Lefley, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+clinically+relevant+in+vivo+metastasis+models+using+human+bone+discs+and+breast+cancer+patient-derived+xenografts.">Development of clinically relevant in vivo metastasis models using human bone discs and breast cancer patient-derived xenografts.</a> Breast Cancer Research. 21 (1), 130 (2019).</li><li>Tuveson, D., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+modeling+meets+human+organoid+technology.">Cancer modeling meets human organoid technology.</a> Science. 364 (6444), 952-955 (2019).</li></ol>

Dr. Hildreth, NIH tarafından K01OD026527 Ödül Numarası altında finanse edildi.  İçerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve NIH'nin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir.

Bu yazı, bir tümör allogreftinin intratibial implantasyonunu takiben primer kemik tümörleri veya kemik metastazı oluşturma modelimizi belgelemektedir. Bu süreçte birkaç kritik adım olduğuna inanıyoruz. Hem tümör hücresi süspansiyonunun deri altına enjeksiyonu hem de ortaya çıkan tümör fragmanlarının intratibial yerleşimi için güvenli bir anestezi düzlemi oluşturulmalıdır. Hem subkutan allogreftin çıkarılması hem de allogreftin intratibial yerleştirilmesi için cerrahi bölgenin steril hazırlığı yapılmalıdır. Tümör allogreft fragmanları, sonraki intratibial implantasyon için üniform olarak oluşturulmalıdır. Tümör fragmanlarının implantasyonu için proksimal tibiada uygun büyüklükte bir defekt oluşturulmalıdır. Ameliyat sonrası yara komplikasyonu riskini azaltmak için cerrahi deri yarası tamamen kapatılmalıdır. Son kritik adım, deri altı enjeksiyonu için tümör hücresi süspansiyonunun bir parçası olarak hücre dışı matriks kullanılıyorsa, enjeksiyondan önce süspansiyonun katılaşmasını önlemek için üreticinin önerdiği kullanım talimatlarının kullanılmasının yapılması gerektiğidir. Ekstremitenin uygun steril hazırlanması, steril intraoperatif teknik ve tam yara kapatılması, ameliyat sonrası cerrahi yara komplikasyonu olasılığını en aza indirecektir.
İmplante edilen tümörün özellikleri ve cerrahi teknik, çalışma popülasyonunuza dahil edilmek üzere başarılı ve tekrarlanabilir sonuçlar için kritik öneme sahiptir. Başlangıçta, tümör ksenogreft / allogreftin doğrudan tibia'nın medüller boşluğuna implante edildiği doğrulanmalı ve tümör dokusunun tamamen kemiğin içinde olduğundan emin olunmalıdır. Greftin kemik dışına çıkmasını önlemek veya sınırlamak için yapılan değişiklikler başlangıçta kemik defektine kemik mumu veya kemik çimentosu veya jel köpük veya deri altı yağ greftinin kemikteki deliğin üzerine yerleştirilmesi olacaktır. Bir alternatif, tümör allogreftini, kraniyal tibial kas altında oluşturulan proksimal tibianın lateral tarafındaki bir delikten sokmak olacaktır. Kraniyal tibial kasın varlığı daha sonra kemik defekti üzerinde biyolojik bir örtü görevi görecek ve tümör allogreftinin potansiyel yer değiştirmesini sınırlayacaktır. Bununla birlikte, bu, proksimal tibianın lateral tarafında nöromüsküler travma potansiyeli olan daha agresif bir cerrahi yaklaşımdır. Tümör allogreftlerinin implantasyondan önce tek tip boyutta olduğundan emin olmak için özen gösterilmelidir. Bununla birlikte, tümör allogreftleri herhangi bir boyutta 1 mm'yi geçmemelidir, çünkü herhangi bir biyolojik sistemdeki daha büyük tümör boyutlarının, implantasyon sırasında greftlere doğrudan, acil bir vasküler tedarik sağlanmadığında, daha küçük greftlerden daha az engraft olasılığı daha düşüktür. Son implante tümör hacmi 0,5 mm3 olan başarılı sonuçlar bildirdik, ancak 1mm3'e kadar kombine tümör fragmanı hacimlerinin başarılı sonuçlar elde edeceğini tahmin ediyoruz. Bununla birlikte, implante edilebilir maksimum tümör fragmanı hacmi belirlenmemiştir. Kriyokorunmuş doku ile karşılaştırıldığında, taze tümör ksenogreftlerinin ve allogreftlerin hayatta kalma olasılığı daha yüksektir, ancak dikkatli bir şekilde kriyokorunmuş tümör allogreftlerinin kullanılması uygulamasında bir sorun gözlemlemedik. Snap-frozen allogreftler implante edilmemelidir. Ek olarak, kapsülün diseksiyonu ve subkutan tümörün dış kısmı, büyük ölçüde fibröz ve vasküler olan ve büyük ölçüde tümör hücrelerinden oluşan önemli bir immün infiltrasyon ile tümörün bu tabakasından herhangi bir katkıyı önleyecektir. Doğrudan bir neşter bıçağı ile daha büyük tümör kütlesinden tümör allogreftleri oluşturmanın alternatif bir yöntemi, daha sonra implantasyondan önce önceden tanımlanmış bir uzunluğa kesilebilen silindirik bir tümör "çekirdeği" oluşturan küçük bir biyopsi iğnesi kullanmaktır. Bir biyopsi iğnesinin veya çekirdek biyopsi punchının kullanılması, implantasyon için tek tip tümör fragmanları oluşturmada faydalı olabilir, çünkü biyopsi işlemi ile iki üniform boyut (genişlik ve derinlik) oluşturulduktan sonra, implantasyondan önce uygun bir uzunluğa kadar kesilebilirler. İmplante edilen tümör hücrelerinde lusiferaz veya floresan proteinler gibi muhabir genler kullanılıyorsa, implantasyon sırasında veya implantasyondan 1 hafta sonra tümör fragmanlarının değerlendirilmesi, implante edilen tümör fragmanlarındaki tümör hücrelerinin göreceli katkısını ve canlılığını gösterecektir.
Herhangi bir prosedürde olduğu gibi, bu tekniğin bildirilen faydalarına ek olarak sınırlamalar vardır. Metastaz, birincil lokalizasyonundan bir hücrenin hücre dışı matrikse invazyon ve göçü başarılı bir şekilde gerçekleştirmesini, tümörün kan dolaşımını vaze etmesini, son metastatik hedefine ulaşana kadar dolaşımda kalmasını, organa uygun şekilde ekstravaze olmasını ve daha sonra ya uykuda kalmasını ya da metastatik bir lezyon oluşturmak için çoğalmasını gerektiren çok aşamalı bir süreçtir. ve normal doku mimarisinin klinik olarak saptanabilir bir metastaz haline gelmesi için modifikasyonu18. Şu anda kullanılan kemik metastazı fare modelleri, büyük ölçüde, tümör hücrelerinin primer tümörün normal bölgesine doğrudan ortotopik enjeksiyonuna, kalbin sol ventrikülüne veya periferik olarak kuyruk damarlarına (lateral veya dorsal kaudal damarlar) intravasküler enjeksiyona veya tümör hücresi süspansiyonunun doğrudan intra-osseöz enjeksiyonuna dayanmaktadır3. Bununla birlikte, kemik metastazı modellerini iyileştirmeye çalışan son raporlar, illiak, kaudal veya femoral arterlere enjeksiyonu savunmuştur 19,20,21. Bu yöntemlerin tümü, doğrudan intra-osseöz enjeksiyon veya bizim durumumuzda sadece son doku modifikasyonunu modelleyen bir tümör allogreftinin implantasyonu hariç, kemik metastatik kaskad içinde bir veya daha fazla adım içerir. Bu nedenle, bu, tekniğimizin doğal bir sınırlamasıdır. Ek bir sınırlama, şu anda tarif edildiği gibi, allogreftlerin bir ara fare konağında çoğaltılmasını gerektirmesidir, bu da ek farelerin kullanılmasını gerektirir ve% 100 saf tümör hücreleri olmayan bir tümörün implantasyonuyla sonuçlanır. Allogreft, subkutan bir bölgede büyüyen tümörler tarafından sağlanan bazı stromal katkılara sahip olacaktır. Bu subkutan stromal katkıyı en aza indirmek için potansiyel bir alternatif, hücrelerin hücre dışı matris veya iskele gibi biyolojik bir substrata deri altından enjekte edilmesi olacaktır. Alternatif olarak, tümörün primer bölgesine ortotopik enjeksiyon, ardından tümör çıkarılması ve greft hazırlığı yapılabilir.
Bu raporda özetlenen yöntem, tümör hücrelerinin doğrudan intra-osseöz enjeksiyonunu takiben primer kemik tümörlerini veya kemik metastazını modellemek için mevcut yöntemlerle karşılaştırıldığında önemli avantajlara sahiptir. Tartışıldığı gibi, biz ve diğerleri akciğerlerin doğrudan embolizasyonunu ve bir hücre süspansiyonunun intratibial enjeksiyonunu takiben ara sıra ani ölümü gözlemledik 8,13. Bu, tümör hücrelerinin kemik iliği boşluğuna basınçlı bir şekilde enjekte edilmesinden kaynaklanır, bundan sonra tümör hücreleri kemik iliği vasküler sinüzoidleri yoluyla periferik kan dolaşımına girer ve venöz dönüş ile akciğere taşınır. Bu olaylar, insanlarda ve hayvanlarda total eklem artroplastisi ile ilişkili kemik iliği boşluğuna implantların basınçlı yerleştirilmesiyle ilişkili pulmoner veya venöz tromboembolizm ile gözlenenlerle mekanik olarak karşılaştırılabilir. Biz ve diğerleri, akciğerlere yönelik bu embolik fenomenin hücre hattına özgü olabileceğini varsayıyoruz (yayınlanmamış gözlemler). Bununla birlikte, bu embolik yapay metastazların oluşumunu sınırlamak için çok ayrıntılı adımlar bildirilmiştir12. Başlangıçta, yeterli tripsinizasyon ve enjeksiyon için tek tip bir tek hücreli süspansiyonun oluşturulması gerekir, bu da hücre kümelenmesini önlemek için buz üzerinde saklanmalıdır. İğne, proksimal tibial büyüme plakasından düzgün bir şekilde yerleştirilmeli, daha sonra küçük enjeksiyon hacimleri (~ 10 μL) ve kemik iliği boşluğuna dirençsiz enjeksiyonlar yapılmalıdır. Buna rağmen, akciğerlere ve ayrıca diğer organlara tümör hücresi iletimi, intra-osseöz ve intravasküler enjeksiyon tekniklerini takiben biyolüminesans görüntüleme ile kolayca gözlemlenebilir, bu da akciğerlerde ve diğer organlarda bu biyolüminesan sinyali üreten hücrelerin uzak metastaza yol açabileceğini düşündürmektedir (yayınlanmamış gözlemler)3. Bu tekniğin bir başka yararının, tek bir tümörün çalışma popülasyonu içinde tek tip bir kemik bölgesinde büyümesi ve hayvandan hayvana değişkenliği azaltması olduğunu bulduk. Bu, tek tip bir çalışma popülasyonunun oluşturulmasını ve tedavi grupları arasında hazır karşılaştırmanın yapılmasını sağlar. Bu, ortotopik veya intravasküler enjeksiyonu takiben gelişen kemik metastazının aksine, hücrelerin farklı iskelet bölgelerine metastaz yapmasının ve farklı kinetik ile büyümesinin mümkün olduğu, çalışma grupları arasında karşılaştırmaları zorlaştırdığı bir durumdur. Tümör allogreftlerimizin implantasyonunu takiben bir anatomik bölgede tümör büyümesi, intravasküler ve ortotopik enjeksiyon tekniklerinde görülebileceği gibi, diğer organ sistemlerine metastaz veya primer tümör yükü nedeniyle farelerin çıkarılma olasılığını da önler. Ek olarak, tümör allogreft implantasyonunu takiben% 100 engraftman gözlemledik, bu da tek tip bir çalışma popülasyonunu destekliyor ve uygun örneklem büyüklüğü sayılarına ulaşmak için gereksiz ek farelerin kullanılmasını önlüyor. Bu aynı zamanda tümör hücresi süspansiyonlarının kemiğe perkütan enjeksiyonunu takiben eksik ve yanlış enjeksiyon sınırlamasının üstesinden gelir.
Bu teknik, şu anda araştırmamızda kullanılmakta olan modifikasyonlarla sonuçlanan ve gelecekteki uygulamalar için büyük fayda potansiyeline sahip olan büyük bir çok yönlülüğe sahiptir. Başlangıçta, proksimal tibiayı intraosseöz implantasyon bölgemiz olarak kullanırken, distal femur ve proksimal humerus dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere, primer kemik tümörlerinin veya kemik metastazının diğer yaygın bölgeleri kolayca kullanılabilir. Bununla birlikte, bu bölgelerin yanı sıra pelvis ve omurga gibi bölgelere cerrahi yaklaşım, proksimal tibia ile karşılaştırıldığında giderek daha kapsamlı bir cerrahi yaklaşım gerektirir. Ek olarak, pelvis, omurga, kafatası, yarıçap ve ulna gibi bölgeler, tümör implantasyonu için yeterli kemik stoğundan faydalanmaz. Oral tümörler gibi kemik invaziv malignitelerde, tümör allogreftlerinin kemiğe bitişik veya orofarenks içine yerleştirilmesi de invaziv tümörlerin ilerlemesini özetleyebilir 3,22. İn vitro ve in vivo deneyler genellikle farklı hücre tiplerinin ilgilenilen bir hücre tipi üzerindeki etkilerini belirlemek için ko-kültür veya ko-enjeksiyon tekniklerini kullanır. Bu nedenle, deri altı tümörleri oluşturmak için aynı anda iki veya daha fazla hücre tipinin enjeksiyonu için potansiyel vardır, bu da daha sonra bu teknik kullanılarak kemiğe implante edilebilir. Genetiği değiştirilmiş hücreler, tümör allogreftlerini oluşturmak için tek başına veya diğer normal veya genetiği değiştirilmiş hücrelerle kombinasyon halinde kullanılabilir. Hassas tıbba olan ilginin artması ve insan kanserinin in vitro ve in vivo modellerinin oluşturulmasıyla, farelere hasta kaynaklı ksenogreft transplantasyonu popülerlik kazanmaktadır. Son zamanlarda, çıplak farelerde deri altından implante edilen insan kemik disklerine ortotopik olarak metastaz yapan hasta kaynaklı ksenogreftlerin implante edildiği bir meme kanseri kemik metastazı modeli tanımlanmıştır23. Bundan, hasta kaynaklı ksenogreftler, subkutan yayılım için bir ara konakçıya ihtiyaç duymadan, modelimizi kullanarak doğrudan kemiğe implante edilebilir. Bu, tümör kinetiğinin hızlı bir şekilde değerlendirilmesine ve allogreft hazırlığı için büyük bir tümör kitlesi gerektirmeden, sadece tek bir hasta biyopsisinden potansiyel olarak çoklu tedavi kombinasyonlarının değerlendirilebilmesine olanak sağlayacaktır. Kanser araştırmalarında organoidlerin artan kullanımı, model 24'ümüzde de kullanılabilir. Bu, bu hücre agregalarının tibial korteksteki delikten iğne veya pipet enjeksiyonunu gerektirir. Bu nedenle, kemik ve kemik iliği boşluğunun dışına organoid göç olasılığını sınırlamak için kortikal defektin (yukarıda tartışıldığı gibi) kapatılmasını öneriyoruz. Yaptığımız gibi, hücreler zaman içinde tümör büyümesinin değerlendirilmesine izin veren optik (biyolüminesans veya floresan) veya gelişmiş (dijital radyografi, μBT veya μMRI) görüntüleme ile etiketlenebilir ve izlenebilir. Bu aynı zamanda hayvan sayılarını en aza indirme avantajına da sahiptir, çünkü aynı hayvanlar zaman içinde görüntülenmektedir.
Özetle, bu yazıda primer kemik tümörleri ve kemik metastazlarını kemiğe solid tümör grefti implantasyonu kullanılarak modelleme tekniğimiz gösterilmiştir.

İnsan ve hayvan hastalıklarının fare modelleri, biyomedikal araştırmalarda giderek daha popüler hale geliyor. Bu bağlamda fareleri kullanmanın yararı, anatomi ve fizyolojilerinin insanlara çok benzemesidir. Olgunluğa ulaşmak için doğum sonrası yaşamda nispeten kısa bir gebelik süresine ve süresine sahiptirler ve büyük ölçüde nispeten düşük bir maliyet ve barınma kolaylığı ile ilişkilidirler, ancak artan geliştirme veya satın alma maliyetleri daha yüksek derecelerde genetik modifikasyon, immün yetmezlik ve / veya insancıllaştırma ile ilişkilidir1. Akraba suşların kullanımı, çalışmanın dahil edilmesinden önce büyük ölçüde tekdüze bir hayvan popülasyonu ile sonuçlanır. Genomlarının tam bir bilgisi, insanlara yüksek derecede benzerlik göstermektedir. Fare genomunda birçok hastalık süreci için ortolog moleküler hedefler tanımlanmıştır ve şimdi kolayca elde edilebilen fareye özgü reaktiflerin kapsamlı bir kütüphanesi bulunmaktadır. Bu nedenle, daha büyük hayvan modellerine kıyasla daha hızlı ve daha ucuz bir şekilde nispeten yüksek verimli analiz için fırsat sağlarlar1. Ek olarak, belirli genlerin küresel olarak veya hücre tipine özgü bir şekilde ve / veya yapısal veya indüklenebilir bir şekilde aşırı ekspresyonuna veya silinmesine izin veren genetik düzenleme stratejilerinin ortaya çıkmasıyla, insan ve hayvan hastalıklarının araştırılması için biyolojik olarak çok yararlı bir model sistemi temsil etmektedirler2.
Kanser, fare modellerinin büyük faydaya sahip olduğu bir alandır. Kanserin genetik fare modelleri, hücrelerin onkojenik transformasyona uğraması için onkogenlerin veya tümör baskılayıcı genlerin ekspresyonunun tek başına veya kombinasyon halinde modülasyonuna dayanır. Primer veya yerleşik tümör hücre hatlarının farelere enjeksiyonu da gerçekleştirilir. İnsanlardan veya fareler de dahil olmak üzere diğer hayvan türlerinden hücre hatlarının veya dokuların tanıtılması, in vivo olarak en yaygın kullanılan kanser modeli olmaya devam etmektedir. İmmün sistemi baskılanmış farelerde farklı türlerden (ksenogreftler) hücrelerin ve dokuların kullanımı en yaygın olarak gerçekleştirilir2. Bununla birlikte, hem konakçının hem de alıcının aynı türden olduğu allogreft tümör hücrelerinin veya dokularının kullanılması, sinjenik sistemlerde aynı konakçı fare suşu ile birleştirildiğinde sağlam bir bağışıklık sistemi ile etkileşime izin verir3.
Primer kemik tümörleri veya solid tümörlerden kemik metastazı ağrılı osteolitik, osteoblastik veya mikst osteolitik / osteoblastik lezyonlara neden olur 3,4. Bu tümörler kemik yapısını bozar, patolojik kırık riskini arttırır ve hastaları sınırlı tedavi seçenekleriyle baş başa bırakır. Primer kemik tümörleri uzak organlara metastaz yapar ve bazı tipleri diğer iskelet bölgelerine yayılabilir. Meme kanserli hastalarda kemik, metastatik hastalığın ilk metastazının en sık görüldüğü ve ilk ortaya çıktığı yerdir 5,6. Ek olarak, yayılmış tümör hücreleri (DTC'ler) diğer organlarda metastaz tanısı konmadan önce kemik iliğinde bulunur ve gelişimini öngörür7. Bu nedenle, kemikte bulunan kanser hücrelerinin, nihayetinde diğer organ sistemlerine metastaz yapan hücrelerin kaynağı olduğuna inanılmaktadır. Ağırlıklı olarak akciğer ve lenf nodlarında metastaz geliştiren ve tümör tipine ve enjeksiyon tekniğine bağlı olarak, potansiyel olarak diğer organ sistemlerinde metastaz geliştiren birçok fare katı tümör metastazı modeli mevcuttur3. Bununla birlikte, kemik metastazının fare modelleri, güvenilir bir şekilde, bölgeye özgü iskelet metastazı üreten ve fareler primer tümör yükünden veya metastazdan diğer organlara erken çıkarma kriterlerine ulaşmadan önce kemik metastazı geliştiren eksiktir. Primer kemik tümörü osteosarkomunun, solid tümör allogreftinin farelerin proksimal tibiasına cerrahi implantasyonuna dayanan bir modelini sunduk8. Kemik tümörleri farelerin %100'ünde oluşmuş ve %88'inde pulmoner metastaz gelişmiştir. Bu metastaz insidansı, insanlarda klinik olarak yaygın olarak bildirilenleri aşmaktadır (~% 20-50), ancak akciğer osteosarkom için en sık metastaz yeri olduğu için büyük ilgi çekmektedir 9,10,11. Bu model primer kemik tümörlerinin modellenmesinde avantajlı olmakla birlikte, meme, akciğer, prostat, tiroid, hepatik, renal ve gastrointestinal tümörler gibi diğer osteotropik solid tümörlerden kemik metastazının modellenmesinde de büyük faydası vardır.
Bu modelin geliştirilmesinin mantığı, primer kemik tümörlerini veya kemik metastazını modellemek için tipik olarak proksimal tibia veya distal femura geleneksel intra-osseöz enjeksiyona bir alternatif geliştirmekti12. Öncelikli amacımız bu tekniğin bilinen bir kısıtlılığını, yani akciğerin tümör embolizasyonunu hafifletmekti. Bu, bu embolik tümör hücrelerinin engraftmanı ve akciğerlere metastaz yapan yerleşik bir primer kemik tümöründen tam metastatik kaskatı özetlemeyen "yapay metastaz" ile sonuçlanır 8,13. Bu aynı zamanda yerleşik bir kemik metastazının uzak bir bölgeye yayıldığı durum olacaktır. Ek olarak, bu teknik, ortotopik veya intravasküler enjeksiyon teknikleriyle karşılaştırıldığında, kemikte ve tekdüze bir bölgede daha fazla engraftman ve tümör büyümesi insidansı sağlayacak bir kemik metastazı modeli üretmek için geliştirilmiştir. Bu modelin, açıklanan bu tekniklere göre belirgin avantajları vardır. Bu model, tümör hücrelerinin kemiğe kontrollü ve tutarlı bir şekilde verilmesini içerir. Ayrıca, pulmoner embolizasyonu takiben yapay akciğer metastazını önler ve temel bir tekdüze çalışma popülasyonu oluşturur. Primer tümörlerden veya diğer organlara metastaz sonucu oluşan erken çıkarma kriterleri riski olmadan bu model ile bölgeye özgü tümörlerin yararı vardır. Son olarak, bu model, hasta kaynaklı ksenogreftlerin kullanımı da dahil olmak üzere modifikasyon için büyük bir faydaya sahiptir.
Sunulan model, cerrahi bir yaklaşımı takiben kemiğe doğrudan hücre süspansiyonu enjeksiyonu ile benzerlikler göstermektedir, ardından korteksten enjeksiyon veya kortekste küçük bir kusur yaptıktan sonra kemik iliği boşluğuna verilmesi (medüller boşluğu raybalama ile veya olmadan)8,14,15,16,17. Bununla birlikte, bir tümör allogreftinin implantasyonu bu tekniği belirgin şekilde farklı kılar. Bu nedenle, bu raporun amacı, daha önce tarif edilen modellerin birçok sınırlamasının üstesinden gelen primer kemik tümörleri ve solid tümörlerden kemik metastazı modelini göstermektir. Hücre kültürü, fare modelleri, fare anestezisi ve cerrahisi ve fare anatomisi konusunda deneyime sahip araştırma grupları, farelerde birincil kemik tümörlerini veya kemik metastazını modelleme tekniğimizi yeniden üretmek için iyi donanımlıdır.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>#15 scalpel blade</td>
			<td>Henry Schein Ltd.</td>
			<td>75614</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well tissue culture plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10578911</td>
			<td>Used for mincing tumor pieces. Can also be used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Abrams osteosarcoma cell line</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia machine with isoflurane vaporiser and oxygen tank(s)</td>
			<td>VetEquip</td>
			<td>901805</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal weighing scale</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>SCL- 1015</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BALB/c nude mouse (nu/nu)</td>
			<td>Charles River Ltd.</td>
			<td>NA</td>
			<td>6-8 weeks of age. Male or female mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone cement</td>
			<td>Depuy Synthes</td>
			<td>160504</td>
			<td>Optional use instead of bone wax</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone wax</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>W31G</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>Animalcare Ltd.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Buprecare 0.3 mg/ml Solution for Injection for Dogs and Cats</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon dioxide euthanasia station</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Should be provided within animal facility</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator set at 37 &#176;C and 5% carbon dioxide</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>Various</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorhexidine surgical scrub</td>
			<td>Vetoquinol</td>
			<td>411412</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryovials (2 ml)</td>
			<td>Thermo Scientific Nalgene</td>
			<td>5000-0020</td>
			<td>Optional if cryopreserving tumor fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-luciferin (Firefly), potassium salt</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>122799</td>
			<td>Optional if cell line of interest has a bioluminescent reporter gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital caliper</td>
			<td>Mitutoyo</td>
			<td>500-181-30</td>
			<td>Can be manual</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital microradiography cabinet</td>
			<td>Faxitron Bioptics, LLC</td>
			<td>MX-20</td>
			<td>Optional to evaluate bone response to tumor growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1371171000</td>
			<td>Optional if cryopreserving tumor fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11965092</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (70%)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>2483</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26140079</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, Dumont</td>
			<td>Fine Science Tools, Inc.</td>
			<td>11200-33</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer (&#8211; 80 &#176;C)</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td>MDF-794C</td>
			<td>Optional if cryopreserving or snap freezing tumor fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11704939</td>
			<td>Can also use automated cell counter, if available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypodermic needles (27 gauge)</td>
			<td>Henry Schein Ltd.</td>
			<td>DIS55510</td>
			<td>May also use 25G (DIS55509) and 30G (Catalog DIS599) needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Ideally small pieces in a container for syringe and cell suspension storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissors</td>
			<td>Fine Science Tools, Inc.</td>
			<td>14084-08</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Henry Schein Ltd.</td>
			<td>1182098</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Lumina III bioluminescence/fluorescence imaging system</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>CLS136334</td>
			<td>Optional if cell line of interest has bioluminescent or fluorescent reporter genes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Thermofisher scientifc</td>
			<td>25030081</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td>British Oxygen Corporation</td>
			<td>NA</td>
			<td>Optional if cryopreserving or snap freezing tumor fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen dewar, 5 litres</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>TY509X1</td>
			<td>Optional if cryopreserving tumor fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel&#174; Matrix GFR, LDEV-Free, 5 ml</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>356230</td>
			<td>Optional. Also available in 10 ml size (354230)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75002549</td>
			<td>Pellet cells at 1200 rpm for 5-6 minutes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty freezing containiner</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10110051</td>
			<td>Optional if cryopreserving tumor fragments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAIR Hair remover lotion/oil</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NC0132811</td>
			<td>Can alternatively use an electric clipper with fine blade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle, #7 Short</td>
			<td>Fine Science Tools, Inc.</td>
			<td>10007-12</td>
			<td>User preference as long as it accepts #15 scalpel blade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small animal heated pad</td>
			<td>VetTech</td>
			<td>HE006</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>GT Vision Ltd.</td>
			<td>H600BV1</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Use for injections and also as part of the surgical scrub, alternating with chlorhexidine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue adhesive (sterile)</td>
			<td>3M Corporation</td>
			<td>84-1469SB</td>
			<td>Can alternatively use non-absorbable skin suture (6-0 size)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>5250061</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25300054</td>
			<td>Use 0.05%-0.25%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tuberculin syringe (1 ml with 0.1 ml gradations)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309659</td>
			<td>Slip tip preferred over Luer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vented tissue culture flasks, T-75</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>CLS3290</td>
			<td>Can also use smaller or larger flasks, as needed</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modeling primary bone tumors and bone metastasis with solid tumor graft implantation into bone

Primer kemik tümörleri veya solid tümörlerden kemik metastazı ağrılı osteolitik, osteoblastik veya mikst osteolitik / osteoblastik lezyonlara neden olur. Bu lezyonlar kemik yapısını bozar, patolojik kırık riskini artırır ve hastaları sınırlı tedavi seçenekleriyle baş başa bırakır. Primer kemik tümörleri uzak organlara metastaz yapar ve bazı tipleri diğer iskelet bölgelerine yayılabilir. Bununla birlikte, son kanıtlar, birçok katı tümörle, kemiğe yayılmış kanser hücrelerinin, nihayetinde diğer organ sistemlerine metastaz yapan hücrelerin birincil kaynağı olabileceğini düşündürmektedir. Primer kemik tümörlerinin çoğu sinjenik veya ksenogreft fare modeli, tümör hücresi süspansiyonlarının intra-osseöz (ortotopik) enjeksiyonunu içerir. Katı tümörlerden iskelet metastazının bazı hayvan modelleri de doğrudan kemik enjeksiyonuna bağlıdır, diğerleri ise hücreleri intravasküler olarak veya primer tümörün organına enjekte ederek kemik metastatik kaskadının ek adımlarını özetlemeye çalışır. Bununla birlikte, bu modellerin hiçbiri güvenilir bir şekilde veya% 100 insidansı ile kemik metastazı geliştirmez. Ek olarak, tümör hücrelerinin doğrudan intra-osseöz enjeksiyonunun, akciğerin potansiyel tümör embolizasyonu ile ilişkili olduğu gösterilmiştir. Bu embolik tümör hücreleri aşılanır, ancak metastatik kaskatı özetlemez. Taze veya kriyokorunmuş tümör fragmanlarının (tümör hücreleri artı stromadan oluşan) minimal invaziv bir cerrahi teknik kullanılarak doğrudan proksimal tibiaya implante edildiği bir fare osteosarkom modeli sunduk. Bu hayvanlar tekrarlanabilir engraftman, büyüme ve zamanla osteoliz ve akciğer metastazı geliştirdi. Bu teknik, solid tümör kemik metastazını modellemek için kullanılacak çok yönlülüğe sahiptir ve optik veya ileri görüntüleme ile izlenebilen bir veya daha fazla hücre tipi, genetiği değiştirilmiş hücreler, hasta kaynaklı ksenogreftler ve / veya etiketli hücrelerden oluşan greftleri kolayca kullanabilir. Burada, primer kemik tümörlerini ve kemik metastazlarını kemiğe solid tümör greft implantasyonu kullanarak modelleyen bu tekniği gösterdik.

Pozitif bir sonuç, tümör engraftmanı ve zamanla ilerleyici tümör büyümesi ile ilişkili olacaktır. Tümör tipine bağlı olarak, intraosseöz tümör büyümesi ilerleyici arka ekstremite topallığı ile ilişkili olabilir, ancak birçok tümör eşlik eden kemik hastalığı belirtilerine rağmen topallığa neden olmaz. Başarılı engraftman, ileri görüntüleme ile belgelenmiştir, bu sayede ilgilenilen hücre hattının kemik fenotipiyle ilişkili proksimal tibiada progresif radyografik, μBT veya μMRG değişiklikleri olacaktır (osteolitik, osteoblastik veya karışık osteolitik / osteoblastik metastaz) (Şekil 1) 8. Önceki raporumuzda, tümör greft implantasyonu için oluşan kortikal defekt, implantasyondan 1 hafta sonra proksimal tibiada görülebiliyordu (Şekil 1A). 2. haftaya gelindiğinde, kortikal defekte bitişik gözle görülür osteoliz ve kemik yeniden şekillenmesi vardı. 2-5. haftalardan itibaren ilerleyici kemik yıkımı ve tümör engraftmanı ve büyümesi ile ilişkili yeni kemik oluşumu vardı (Şekil 1B-E). Muhabir genlere sahip hücre hatları için, kemik değişikliklerine zamanla floresan veya biyolüminesans görüntüleme çıktılarındaki artışlar eşlik edecektir. Akut topallık, yaklaşmakta olan veya gerçek patolojik kemik kırığının bir göstergesi olabilir, bu da farenin derhal ve dikkatli bir şekilde radyografik değerlendirmesini ve muhtemelen çalışmadan erken çıkarılmasını gerektirir. İncelenen tümör hücre hattına bağlı olarak, kemik yıkımı metastazdan çok önce hızla gerçekleşebilir. Bu, primer kemik tümörlerini içeren çalışmalarda özel bir öneme sahiptir, çünkü farelerin klinik olarak ilgili metastazların, yani akciğerin gelişmesinden önce çalışmadan çıkarılması gerekebilir. Bu durumlarda, daha önce bildirdiğimiz gibi, primer kemik tümörleri kullanıldığında minimal rezidüel hastalık ve müteakip metastaz çalışmasına izin vermek için tümör taşıyan ekstremitenin cerrahi amputasyonu önerilir 4,8. İnsanlarda tam arka ekstremite amputasyonu tipik olarak yapılmamakla birlikte, bu, insan ve köpek osteosarkomunun klinik ve moleküler özelliklerindeki benzerliklerin iyi belgelendiği veteriner hekimlikte bakım standardıdır. Bu nedenle, farelerde arka bacak amputasyonu, birçok hayvan hücresi hattı için geçerlidir. Ek olarak, amputasyon farelerde uygulanabilir bir tedavi yöntemidir, çünkü insanlarda kullanılan uzuv koruyucu prosedürler fareler gibi küçük kemirgenlerde elde edilemez. Primer kemik tümörleri taşıyan farelerde, iştahsızlık, ilerleyici kilo kaybı, genel zayıf vücut durumu ve solunum zorluğu (artan oran veya efor), akciğere ve diğer organlara tümör metastazı gelişimini işaret edebilir. Metastazı doğrulamak için biyolüminesan görüntüleme, μBT veya μMRI görüntüleme ile doğrulama önerilir ve etkilenen hayvanlar ötenazi yapılmalıdır.
Büyük olasılıkla tümör engraftmanının eksikliğinden kaynaklanan negatif bir sonuçtan, implante edilen tibianın radyografisinde veya μBT incelemesinde ilerleyici değişikliklerin (çalışılan hücre hattına bağlı olarak osteolitik / osteolitik / osteoblastik lezyonlar) kanıtı yoksa şüphelenilmelidir. Muhabir genleri taşıyan hücre hatları için, optik görüntüleme ile zaman içinde floresan veya biyolüminesans sinyallemesinde bir artış olmaması, tümörün aşılamadığı sonucunu da destekleyecektir. Engraftman eksikliği veya zayıf olması cerrahi alan enfeksiyonu ile ilişkili olabilir. Bununla birlikte, bu, en sık ameliyat sonrası erken dönemde (ameliyattan sonraki ilk 1-2 hafta) kızarıklık, şişlik veya akıntı gibi spesifik klinik belirtiler gösterecektir. Hayvanlar potansiyel olarak ateşli olabilir ve cerrahi alan enfeksiyonu nedeniyle ameliyat sonrası erken dönemde aktivite eksikliği veya kambur duruş gösterebilir. Ekstremitenin hazırlanması ve uygun steril hazırlanması, steril intraoperatif teknik ve tam yaranın kapatılması sırasında allogreftlerin steril koşullar altında toplanması ve muhafaza edilmesi, enfeksiyon ve tümör engraftmanının başarısızlığı ile sonuçlanan postoperatif cerrahi yara komplikasyonu olasılığını en aza indirecektir.
Önceki raporumuz8'de, hem bildirilen pilot hem de kesin çalışmaları dahil ettiğimizde, osteosarkom fragmanları ile implante edilen 16 fareden 16'sında (%100) osteolitik kemik lezyonlarına ilerlemiş ve bu 16 fareden 14'ünde (%88) metastaz gelişmiştir. Tüm metastazlar akciğerde gözlendi ve implantasyondan 3 hafta sonra histoloji ile teşhis edildi8. İmplantasyondan 1 (n = 2) ve 2 (n = 2) hafta sonra nekropsi yapılan ek hayvanlar, akciğer metastazı kanıtı ortaya koymadı.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61313/61313fig01.jpg"> Resim 1: Seri radyografi. Seri radyografi (sırayla) haftalık olarak (A) 1, (B) 2, (C) 3, (D) 4 ve (E) 'de primer kemik tümörü hücre hattı (osteosarkom) kullanılarak deri altı tümör allogreftinin intratibial implantasyonundan 5 hafta sonra yapılır. Zamanla, ilerleyici kemik yıkımı ve tümör engraftmanı ve büyümesi ile ilişkili yeni kemik oluşumu vardı. Bu şekil ref8'in izniyle değiştirilmiştir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61313/61313fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Modeling Primary Bone Tumors and Bone Metastasis with Solid Tumor Graft Implantation into Bone at JoVE.com

Modeling Primary Bone Tumors and Bone Metastasis with Solid Tumor Graft Implantation into Bone

Kemik metastazı modellerinde metastaz düzgün bir şekilde veya %100 insidansla gelişmez. Doğrudan intraosseöz tümör hücresi enjeksiyonu akciğerin embolizasyonu ile sonuçlanabilir. Primer kemik tümörlerini ve kemik metastazlarını, kemik içine solid tümör grefti implantasyonu kullanılarak modelleyen, tekrarlanabilir engraftman ve büyümeye yol açan tekniğimizi sunuyoruz.

Primer Kemik Tümörleri ve Kemik Metastazlarının Solid Tümör Grefti İmplantasyonu ile Modellenmesi

Primary bone tumors or bone metastasis from solid tumors result in painful osteolytic, osteoblastic, or mixed osteolytic/osteoblastic lesions. These ...

modeling-primary-bone-tumors-bone-metastasis-with-solid-tumor-graft

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Cancer Research

2.6K Görüntüleme.  University of Alabama at Birmingham. Kemik metastazı modellerinde metastaz düzgün bir şekilde veya %100 insidansla gelişmez. Doğrudan intraosseöz tümör hücresi enjeksiyonu akciğerin embolizasyonu ile sonuçlanabilir. Primer kemik tümörlerini ve kemik metastazlarını, kemik içine solid tümör grefti implantasyonu kullanılarak modelleyen, tekrarlanabilir engraftman ve büyümeye yol açan tekniğimizi sunuyoruz.

Video: Modeling Primary Bone Tumors and Bone Metastasis with Solid Tumor Graft Implantation into Bone

Next Generation Sequencing for the Detection of Actionable Mutations in Solid and Liquid Tumors

As our understanding of the driver mutations necessary for initiation and progression of cancers improves, we gain critical information on how specific molecular profiles of a tumor may predict responsiveness to therapeutic agents or provide knowledge about prognosis. At our institution a tumor genotyping program was established as part of routine clinical care, screening both hematologic and solid tumors for a wide spectrum of mutations using two next-generation sequencing (NGS) panels: a custom, 33 gene hematological malignancies panel for use with peripheral blood and bone marrow, and a commercially produced solid tumor panel for use with formalin-fixed paraffin-embedded tissue that targets 47 genes commonly mutated in cancer. Our workflow includes a pathologist review of the biopsy to ensure there is adequate amount of tumor for the assay followed by customized DNA extraction is performed on the specimen. Quality control of the specimen includes steps for quantity, quality and integrity and only after the extracted DNA passes these metrics an amplicon library is generated and sequenced. The resulting data is analyzed through an in-house bioinformatics pipeline and the variants are reviewed and interpreted for pathogenicity. Here we provide a snapshot of the utility of each panel using two clinical cases to provide insight into how a well-designed NGS workflow can contribute to optimizing clinical outcomes.

This manuscript describes clinical protocols for two next-generation sequencing panels. One panel interrogates hematologic malignancies while the other panel targets genes commonly mutated in solid tumors. Molecular classification of driver mutations in human malignancies offers valuable prognostic and predictive information.

Katı ve Sıvı Tümörlerinde harekete geçirici Mutasyonlar Tespiti için Yeni Nesil Dizi

As our understanding of the driver mutations necessary for initiation and progression of cancers improves, we gain critical information on how specific ...

Kanser Araştırmaları

Intra-iliac Artery Injection for Efficient and Selective Modeling of Microscopic Bone Metastasis

Intra-iliac artery (IIA) injection is an efficient approach to introduce metastatic lesions of various cancer cells in animals. Compared to the widely used intra-cardiac and intra-tibial injections, IIA injection brings several advantages. First, it can deliver a large quantity of cancer cells specifically to hind limb bones, thereby providing spatiotemporally synchronized early-stage colonization events and allowing robust quantification and swift detection of disseminated tumor cells. Second, it injects cancer cells into the circulation without damaging the local tissues, thereby avoiding inflammatory and wound-healing processes that confound the bone colonization process. Third, IIA injection causes very little metastatic growth in non-bone organs, thereby preventing animals from succumbing to other vital metastases, and allowing continuous monitoring of indolent bone lesions. These advantages are especially useful for the inspection of progression from single cancer cells to multi-cell micrometastases, which has largely been elusive in the past. When combined with cutting-edge approaches of biological imaging and bone histology, IIA injection can be applied to various research purposes related to bone metastases.

This manuscript provides the detailed procedure of intra-iliac artery (IIA) injection, a technique to deliver cancer cells specifically to hind limb tissues including bones to establish experimental bone metastases. Although initially established with breast tumor models, this protocol can be easily extended to other cancer types.

Mikroskopik Kemik Metastazı Verimli ve Seçici Modelleme için intra-iliak arter Enjeksiyon

Intra-iliac artery (IIA) injection is an efficient approach to introduce metastatic lesions of various cancer cells in animals. Compared to the widely ...

Murine Experimental Model of Original Tumor Development and Peritoneal Metastasis via Orthotopic Inoculation with Ovarian Carcinoma Cells

Epithelial ovarian carcinoma (EOC) is associated with a poor prognosis because it shows peritoneal dissemination. To improve the prognosis, it is important to control peritoneal dissemination. However, it is still unclear how tumor cells detach from primary lesions and attach to the mesothelium. The establishment of an appropriate animal model is needed to gain an understanding of the mechanism of peritoneal dissemination in vivo. In the current study, we introduce the process from the local injection of EOC cells into the murine ovarian surface to the development of metastasis, including the peritoneum and distant organs. Female nude mice (BALB/c nu/nu) at 8 weeks of age were used. Under a microscopic field of view, EOC cells (1 x 105 cells/&#181;l of medium-extracellular matrix (ECM)-based hydrogel/unilateral ovary/mouse) were injected into murine ovaries through a retroperitoneal approach from the dorsal flank. This proposed method is a less invasive procedure for the mouse and minimizes damage to the ovary. Here, we describe the methodological steps in the development of the original and metastatic tumor formation of EOC.

Murine Experimental Model of Original Tumor Development and Peritoneal Metastasis via Orthotopic Inoculation with Ovarian Carcinoma Cells

To clarify the multistep process of peritoneal dissemination of ovarian carcinoma, the current study presents a murine experimental model of original tumor development and peritoneal metastasis via orthotopic inoculation with these tumor cells.

Orijinal Tümör Geliştirme Murin Deneysel Modeli ve Periton Metastaz<em&gt; yoluyla</emYumurtalık Kanseri Hücreleri ile&gt; Ortotopik aşılama

Epithelial ovarian carcinoma (EOC) is associated with a poor prognosis because it shows peritoneal dissemination. To improve the prognosis, it is ...

Labeling of Breast Cancer Patient-derived Xenografts with Traceable Reporters for Tumor Growth and Metastasis Studies

The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many transgenic mouse models, often fail to recapitulate the key aspects of human malignancies. Thus, alternative models that better represent the heterogeneity of patients' tumors and their metastases are being developed. Patient-derived xenograft (PDX) models in which surgically resected tumor samples are engrafted into immunocompromised mice have become an attractive alternative as they can be transplanted through multiple generations,and more efficiently reflect tumor heterogeneity than xenografts derived from human cancer cell lines. A limitation to the use of PDXs is that they are difficult to transfect or transduce to introduce traceable reporters or to manipulate gene expression. The current protocol describes methods to transduce dissociated tumor cells from PDXs with high transduction efficiency, and the use of labeled PDXs for experimental models of breast cancer metastases. The protocol also demonstrates the use of labeled PDXs in experimental metastasis models to study the organ-colonization process of the metastatic cascade. Metastases to different organs can be easily visualized and quantified using bioluminescent imaging in live animals, or GFP expression during dissection and in excised organs. These methods provide a powerful tool to extend the use of multiple types of PDXs to metastasis research.

We describe a method for stable labeling of patient-derived xenografts (PDXs) with lentiviral particles expressing green-fluorescent protein and luciferase reporters. This method allows for tracking the growth of PDXs at the primary site, as well as detecting spontaneous and experimental metastases using in vivo imaging systems.

Tümör Büyüme ve metastaz Çalışmaları İzlenebilir Muhabirleri ile Meme Kanseri Hasta kaynaklı ksenogratflarının Etiketleme

The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many ...

Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients have achieved complete remission (CR). Approximately half of the adult patients who entered CR will relapse within 12 months due to the outgrowth of residual AML cells in the bone marrow. The quantitation of these remaining leukemia cells, known as minimal or measurable residual disease (MRD), can be a robust biomarker for the prediction of these relapses. Moreover, retrospective analysis of several studies has shown that the presence of MRD in the bone marrow of AML patients correlates with poor survival. Not only is the total leukemic population, reflected by cells harboring a leukemia associated immune-phenotype (LAIP), associated with clinical outcome, but so is the immature low frequency subpopulation of leukemia stem cells (LSC), both of which can be monitored through flow cytometry MRD or MRD-like approaches. The availability of sensitive assays that enable detection of residual leukemia (stem) cells on the basis of disease-specific or disease-associated features (abnormal molecular markers or aberrant immunophenotypes) have drastically improved MRD assessment in AML. However, given the inherent heterogeneity and complexity of AML as a disease, methods for sampling bone marrow and performing MRD and LSC analysis should be harmonized when possible. In this manuscript we describe a detailed methodology for adequate bone marrow aspirate sampling, transport, sample processing for optimal multi-color flow cytometry assessment, and gating strategies to assess MRD and LSC to aid in therapeutic decision making for AML patients.

Detection of minimal or measurable residual disease (MRD) is an important prognostic biomarker for refining risk assessment and predicting relapse in acute myeloid leukemia (AML). These comprehensive guidelines and recommendations with best practices for consistent and accurate identification and detection of MRD, may aid in making effective AML treatment decisions.

Örnek ve işlem kemik iliği ölçülebilir artık hastalık ve akut Myeloid lösemi lösemik kök hücre ölçmek için kapsamlı iletişim kuralı

Response criteria in acute myeloid leukemia (AML) has recently been re-established, with morphologic examination utilized to determine whether patients ...

Dual Effects of Melanoma Cell-derived Factors on Bone Marrow Adipocytes Differentiation

The crosstalk between bone marrow adipocytes and tumor cells may play a critical role in the process of bone metastasis. A variety of methods are available for studying the significant crosstalk; however, a two-dimensional transwell system for coculture remains a classic, reliable, and easy way for this crosstalk study. Here, we present a detailed protocol that shows the coculture of bone marrow adipocytes and melanoma cells. Nevertheless, such a coculture system could not only contribute to the study of cell signal transductions of cancer cells induced by bone marrow adipocytes, but also to the future mechanistic study of bone metastasis which may reveal new therapeutic targets for bone metastasis.

Here, we present a reliable and straightforward two-dimensional (2D) coculture system for studying the interaction between tumor cells and bone marrow adipocytes, which reveals a dual effect of melanoma cell-derived factors on the bone marrow adipocytes differentiation and also poses a classic method for the mechanistic study of bone metastasis.

Melanoma hücre kaynaklı faktörler çift etkileri kemik iliği adiposit farklılaşması üzerine

The crosstalk between bone marrow adipocytes and tumor cells may play a critical role in the process of bone metastasis. A variety of methods are ...

Multimodal Bioluminescent and Positronic-emission Tomography/Computational Tomography Imaging of Multiple Myeloma Bone Marrow Xenografts in NOG Mice

Multiple myeloma (MM) tumors engraft in the bone marrow (BM) and their survival and progression are dependent upon complex molecular and cellular interactions that exist within this microenvironment. Yet the BM microenvironment cannot be easily replicated in vitro, which potentially limits the physiologic relevance of many in vitro and ex vivo experimental models. These issues can be overcome by utilizing a xenograft model in which luciferase (LUC)-transfected 8226 MM cells will specifically engraft in the mouse skeleton. When these mice are given the appropriate substrate, D-luciferin, the effects of therapy on tumor growth and survival can be analyzed by measuring changes in the bioluminescent images (BLI) produced by the tumors in vivo. This BLI data combined with positronic-emission tomography/computational tomography (PET/CT) analysis using the metabolic marker 2-deoxy-2-(18F)fluoro-D-glucose (18F-FDG) is used to monitor changes in tumor metabolism over time. These imaging platforms allow for multiple noninvasive measurements within the tumor/BM microenvironment.

Here we use bioluminescent, X-ray, and positron-emission tomography/computed tomography imaging to study how inhibiting mTOR activity impacts bone marrow-engrafted myeloma tumors in a xenograft model. This allows for physiologically relevant, non-invasive, and multimodal analyses of the anti-myeloma effect of therapies targeting bone marrow-engrafted myeloma tumors in vivo.

Multipl Miyelom kemik iliği Xenografts NOG farelerde Multimodal kollarındaki ve pozitronik emisyon tomografi/Hesaplamalı tomografi görüntüleme

Multiple myeloma (MM) tumors engraft in the bone marrow (BM) and their survival and progression are dependent upon complex molecular and cellular ...

Measuring Bone Remodeling and Recreating the Tumor-Bone Microenvironment Using Calvaria Co-culture and Histomorphometry

Bone is a connective tissue constituted of osteoblasts, osteocytes, and osteoclasts and a mineralized extracellular matrix, which gives it its strength and flexibility and allows it to fulfill its functions. Bone is continuously exposed to a variety of stimuli, which in pathological conditions can deregulate bone remodeling. To study bone biology and diseases and evaluate potential therapeutic agents, it has been necessary to develop in vitro and in vivo models.
This manuscript describes the dissection process and culture conditions of calvarias isolated from neonatal mice to study bone formation and the bone tumor microenvironment. In contrast to in vitro and in vivo models, this ex vivo model allows preservation of the three-dimensional environment of the tissue as well as the cellular diversity of the bone while culturing under defined conditions to simulate the desired microenvironment. Therefore, it is possible to investigate bone remodeling and its mechanisms, as well as the interactions with other cell types, such as the interactions between cancer cells and bone.
The assays reported here use calvarias from 5-7 day old BALB/C mice. The hemi-calvarias obtained are cultured in the presence of insulin, breast cancer cells (MDA-MB-231), or conditioned medium from breast cancer cell cultures. After analysis, it was established that insulin induced new bone formation, while cancer cells and their conditioned medium induced bone resorption. The calvarial model has been successfully used in basic and applied research to study bone development and cancer-induced bone diseases. Overall, it is an excellent option for an easy, informative, and low-cost assay.

The ex vivo culture of bone explants can be a valuable tool for the study of bone physiology and the potential evaluation of drugs in bone remodeling and bone diseases. The presented protocol describes the preparation and culture of calvarias isolated from newborn mice skulls, as well as its applications.

Calvaria Co-culture ve Histomorfometri Kullanarak Kemik Remodeling ve Tümör-Kemik Mikroortamı yeniden oluşturma

Bone is a connective tissue constituted of osteoblasts, osteocytes, and osteoclasts and a mineralized extracellular matrix, which gives it its strength ...

Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with diagnostic or prognostic difficulties. OS comprises genotypically and phenotypically heterogeneous cancer cells. Bone microenvironment elements are proved to account for tumor heterogeneity and disease progression. Bone extracellular matrix (BEM) retains the microstructural matrices and biochemical components of native extracellular matrix. This tissue-specific niche provides a favorable and long-term scaffold for OS cell seeding and proliferation. This article provides a protocol for the preparation of BEM model and its further experimental application. OS cells can grow and differentiate into multiple phenotypes consistent with the histopathological complexity of OS clinical specimens. The model also allows visualization of diverse morphologies and their association with genetic alterations and underlying regulatory mechanisms. As homologous to human OS, this BEM-OS model can be developed and applied to the pathology and clinical research of OS.

The bone extracellular matrix (BEM) model for osteosarcoma (OS) is well established and shown here. It can be used as a suitable scaffold for mimicking primary tumor growth in vitro and providing an ideal model for studying the histologic and cytogenic heterogeneity of OS.

Üç boyutlu kemik hücre dışı matriks modeli osteosarkom için

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new tumors at distant sites. CTCs are found in the bloodstream of patients as single cells (single CTCs) or as multicellular aggregates (CTC clusters and CTC-white blood cell clusters), with the latter displaying a higher metastatic ability. Beyond enumeration, phenotypic and molecular analysis is extraordinarily important to dissect CTC biology and to identify actionable vulnerabilities. Here, we provide a detailed description of a workflow that includes CTC immunostaining and micromanipulation, ex vivo culture to assess&#160;proliferative and survival capabilities of individual cells, and in vivo metastasis-formation assays. Additionally, we provide a protocol to achieve the dissociation of CTC clusters into individual cells and the investigation of intra-cluster heterogeneity. With these approaches, for instance, we precisely quantify survival and proliferative potential of single CTCs and individual cells within CTC clusters, leading us to the observation that cells within clusters display better survival and proliferation in ex vivo cultures compared to single CTCs. Overall, our workflow offers a platform to dissect the characteristics of CTCs at the single cell level, aiming towards the identification of metastasis-relevant pathways and a better understanding of CTC biology.

Here, we present an integrated workflow to identify phenotypic and molecular features that characterize circulating tumor cells (CTCs). We combine live immunostaining and robotic micromanipulation of single and clustered CTCs with single cell-based techniques for downstream analysis and assessment of metastasis-seeding ability.

Akım moleküler Analizi ve metastatik potansiyel değerlendirme için sirkülasyon tümör hücrelerinin mikromanipülasyon

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new ...