Este trabajo fue apoyado por el Bone Disease Program of Texas Award, el Caroline Wiess Law Fund Award y el NIAMS de los Institutos Nacionales de Salud bajo los números de premio R01 AR072018, R21 AG064345, R01 CA221946 a D.P.  Agradecemos a M.E. Dickinson y T.J. Vadakkan en el BCM Optical Imaging and Vital Microscopy Core y bcM Advanced Technology Cores con fondos de NIH (AI036211, CA125123 y DK056338).
.

Todos los ratones se mantuvieron en condiciones libres de patógenos, y todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Baylor College of Medicine.
1. Preparación del ratón
<ol><li>Cruce los ratones Mx1-Cre17 y Rosa26-loxP-stop-loxP-tdTomato (Tom)18 (comprados en el Laboratorio Jackson) con ratones αSMA-GFP (proporcionados aquí por los doctores Ivo Kalajzic y Henry Kronenberg) para generar ratones reporteros Mx1-Cre+Rosa26-Tomato+α SMA-GFP+ (Mx1/Tomato/αSMA-GFP) (Figura 2A).</li>
	<li>Para la inducción de Mx1-Cre, inyecte a los ratones 25 mg/kg de pIpC cada dos días durante 10 días.</li>
	<li>Irradiar ratones con 9,5 Gy 1 día antes del trasplante intravenoso de 1 x 106 células mononucleares de médula ósea entera de ratones C57BL/6 de tipo salvaje (WT-BMT)19.</li>
	<li>Después de 6 a 8 semanas de recuperación, someta a los ratones a las imágenes in vivo del protocolo de migración de células periósticas que se describen a continuación. NOTA: La irradiación y el WT-BMT de ratones Mx1-Cre son necesarios para eliminar endógenamente las células hematopoyéticas marcadas con Mx1 que pueden responder a una lesión. De seis a ocho semanas después de la irradiación, el recuento de células hematopoyéticas del huésped está en <5% y, por lo tanto, listo para la obtención de imágenes19.</li>
</ol>2. Sujeción del ratón y montaje de imágenes
<ol><li>Cree una sujeción del ratón con un tubo cónico de 50 ml (Figura 1A).<ol>
<li>Usando tijeras puntiagudas, haga un agujero a través de la parte inferior de la cónica. Corte desde el orificio inferior hasta la parte superior de la cónica (el lado cortado será la parte superior de la sujeción).</li>
		<li>Haga un corte de aproximadamente 4-5 cm de largo paralelo al corte anterior y hasta la mitad (~ 2 cm) de la parte superior de la sujeción. Quitar esta sección de la cónica y lisar los bordes eran necesarios.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Construya un soporte de imagen de tubo cónico utilizando una placa de ángulo ajustable, un poste óptico de 0.5" y una abrazadera de ángulo recto para el poste de 0.5" Hex de 0.1875" (Figura 1B y Tabla de Materiales).<ol>
<li>Ajuste la placa angular a un ángulo de 35°. En el lado izquierdo de la placa angular, atornille el poste óptico en el segundo orificio desde la parte posterior de la placa.</li>
		<li>En el lado derecho de la placa ajustable, inserte un tornillo de pulgar de 0.25" con bloqueo hexagonal de 0.1875" cargado por resorte en el segundo orificio desde el frente y el último orificio de la placa. La abrazadera de ángulo recto se utilizará con el poste óptico para asegurar la sujeción cónica del ratón en su lugar.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Procedimiento quirúrgico preoperatorio
<ol><li>Anestesia de ratón<ol>
<li>Para el manejo del dolor, inyecte subcutáneamente al ratón buprenorfina de liberación sostenida (1 mg/kg de peso corporal) 30-60 minutos antes de la cirugía.</li>
		<li>Anestesiar ratones utilizando anestesia combinada de CCM de roedor III (combo III) que contiene 37,5 mg/ml de ketamina, 1,9 mg/ml de xilazina y 0,37 mg/ml de acepromazina. La dosis adecuada para ratones es de 0,75 a 1,50 ml por 1 kg de peso corporal. La dosis durará de 30 a 45 minutos.</li>
		<li>Una vez que el ratón esté anestesiado, aplique ungüento oftálmico en los ojos con un hisopo de algodón estéril para prevenir la deshidratación ocular.</li>
		<li>Para imágenes a largo plazo (>45 min), administre anestesia nuevamente para mantener la profundidad anestésica adecuada de la siguiente manera.<ol>
<li>Prepare una jeringa de 1 ml con una cantidad suficiente de combo III para mantener la anestesia durante la duración planificada de la imagen (0,75 ml/kg de peso corporal por 30 minutos de sedación adicional). Conecte un juego de infusión de aguja de mariposa de 25 G con tubo de 12"a la jeringa y empuje el anestésico a través del tubo y la aguja.</li>
			<li>Inserte la aguja de mariposa por vía intraperitoneal y, a continuación, coloque la aguja con cinta adhesiva en su lugar. NOTA: Así es como se administrará el combo III adicional durante la toma de imágenes, de modo que no haya necesidad de mover al animal o interrumpir el plano de visión.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Proporcione soporte térmico con una almohadilla térmica mantenida a 37 ° C durante todo el procedimiento. Para imágenes prolongadas (>1 hora) será necesario un soporte adicional de líquido.  Se pueden proporcionar líquidos suplementarios I.P. con Combo III adicional durante la toma de imágenes o 33 ml / kg de solución salina (0.9 NaCl) por vía subcutánea.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sujeción del ratón y preparación del sitio quirúrgico<ol>
<li>Use cortapelos para eliminar la mayor cantidad de vello posible de la parte superior de la cabeza. Aplique crema depilatoria en el área afeitada para eliminar el vello restante en el sitio quirúrgico.</li>
		<li>Asegúrese de que el ratón esté completamente anestesiado por la falta de respuesta a los pellizcos de los dedos de los pies. Después de 15 min, si el ratón no está completamente anestesiado, administre una segunda dosis más pequeña de combo III (<0,75 ml/kg de peso corporal).</li>
		<li>Coloque el ratón en la cola de sujeción primero, deslizándolo lo suficientemente hacia atrás como para que la nariz cuelgue ligeramente sobre el borde de la cónica.</li>
		<li>Pega las patas delanteras con cinta adhesiva a la parte inferior del tubo cónico con cinta médica.</li>
		<li>Coloque el tubo cónico con el ratón en un soporte de imagen que se ajuste en un ángulo de 35 ° y se asegure con la abrazadera de ángulo recto (Figura 1C).</li>
		<li>Una vez que el ratón esté seguro en el soporte de imágenes, limpie el sitio quirúrgico 3 veces con exfoliantes alternos de exfoliante de betadina y alcohol isopropílico al 70%. Nuevamente, verifique que el animal esté completamente sedado.</li>
		<li>Mueva el ratón a una almohadilla absorbente limpia y coloque una cortina sobre el ratón para crear un gran campo estéril.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Procedimiento quirúrgico
<ol><li>Incisión de apertura<ol>
<li>Usando pinzas de punta fina, recoja la piel inmediatamente medial hasta la oreja derecha. Con tijeras de microdisección, corte la piel sujeta por las pinzas. NOTA: Iniciar la incisión utilizando el método descrito anteriormente crea una incisión redondeada que es más adecuada para suturar después del procedimiento.</li>
		<li>Haga una incisión transversal a partir de la incisión inicial hacia el oído izquierdo (<1 cm).  Haga otra incisión, a partir de la incisión inicial, hacia la nariz del animal (~ 2-3 mm más allá del ojo derecho).</li>
		<li>Separe la piel del periostio usando las pinzas y las tijeras para cortar suavemente el tejido conectivo que separa la piel del calvario periostio.</li>
		<li>Usando un hisopo de algodón estéril, aplique un poco de ungüento oftálmico en la parte superior del colgajo de la piel.  Tome suavemente el colgajo de la piel y dóblelo sobre el ojo izquierdo. La intersección de las suturas sagital y coronal debe estar claramente expuesta (Figura 1E). NOTA: El ungüento oftálmico se usa para mantener el colgajo de la piel en su lugar.</li>
		<li>Enjuague la superficie abierta con PBS estéril para limpiar el área de cualquier sangre y cabello residual. NOTA: Si es necesario, use pinzas de punta fina para eliminar los pelos que quedan después del enrojecimiento, pero tenga cuidado de no dañar el periostio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Microfractura<ol>
<li>Para generar microfracturas en la calvaria, retire el émbolo de una jeringa de insulina de 29 G y corte el extremo posterior de la jeringa, alrededor de las marcas de 300-400 uL. NOTA: Este paso hace que sea más fácil maniobrar bajo un endoscopio de disección al producir la lesión.</li>
		<li>Coloque la punta de un bisel (uno o dos anchos de aguja) hacia la nariz desde la sutura coronal y uno o dos anchos de aguja a la derecha de la sutura sagital (Figura 1E).</li>
		<li>Gire suavemente la jeringa en el sentido de las agujas del reloj, luego en sentido contrario a las agujas del reloj varias veces. NOTA: En ratones jóvenes, se necesita una cantidad muy pequeña de presión hacia abajo para crear una microfractura circular. Tenga cuidado de no dejar que la aguja penetre en el cerebro, ya que esto causará sangrado e interferirá con las imágenes.</li>
		<li>Use una aguja de 27 G para ensanchar la microfractura a ~ 0.4 mm. Si quedan fragmentos de hueso en la microfractura, enjuague el área con PBS. Si los fragmentos de hueso aún permanecen en la microfractura, use la aguja de 29 G para sacarlos suavemente.</li>
		<li>Repita los pasos 4.2.1–4.2.4 para crear una lesión en el lado izquierdo de la sutura sagital. NOTA: En este punto, hay dos opciones: 1) proceder inmediatamente al tratamiento con CCL5 (sección 4.3) y a la obtención de imágenes (sección 5); o 2) cerrar el sitio quirúrgico después de los procedimientos postoperatorios de la sección 6. A las 24 h posteriores, anestesiar de nuevo al ratón, reabrir la vista quirúrgica, tratar la lesión con CCL5 (sección 4.3) y realizar imágenes intravitales (sección 5) y cuidados postoperatorios (sección 6).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tratamiento CCL5<ol>
<li>A partir de un stock de RANTES (100 ng/mL), hacer una solución de 10 ng/mL utilizando la matriz de membrana basal (Tabla de Materiales). Mantenga esta solución en hielo para mantener la matriz en forma líquida.</li>
		<li>Trate cada lesión con 2 μL de CCL5 (10 ng/μL) utilizando una pipeta de 2-20 μL (esta punta de pipeta tiene un diámetro mayor, que es más efectivo cuando se usa un líquido viscoso). Permita que la matriz se solidifique.</li>
		<li>Una vez que la matriz se haya solidificado, cubra suavemente la calvaria con el colgajo de la piel para asegurarse de que el tejido no se deshidrate. Incubar durante 1 h antes de la toma de imágenes.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Imágenes intravitales
<ol><li>Ajustes del microscopio<ol>
<li>Encienda el láser multifotón (láser de titanio-zafiro de femtosegundo). Ajuste la longitud de onda a 880 nm y ajuste la potencia para obtener imágenes de segunda generación armónica (SHG) (440 nm) del hueso.</li>
		<li>Encienda los láseres de estado sólido de 488 nm y 561 nm para la excitación de las células que expresan GFP y tdTomato, respectivamente.</li>
		<li>Encienda los detectores PMT (tubo fotomultiplicador) para señales de segunda generación armónica (detección de 405–455 nm) y GFP (detección de 505–550 nm). Encienda el detector HyD 3 para la señal de tomate (detección de 590–620 nm).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Montura<ol>
<li>Antes de mover el ratón al endoscopio, compruebe el plano visual de la calvaria presionando suavemente la parte posterior de la cabeza del ratón. Si el plano no está nivelado, ajuste la posición girando suavemente la sujeción del ratón hacia la izquierda o la derecha. NOTA: Este es un paso crítico para garantizar una calidad de imagen suficiente.</li>
		<li>Aplique metilcelulosa estéril al 2% en agua (p/v) para cubrir toda la calvaria y el colgajo de la piel y evitar el secado del tejido.</li>
		<li>Coloque el ratón en la etapa de microscopio motorizado del eje XYZ (Figura 1G). Usando la luz epifluorescente, alinee el ratón de modo que 1) esté mirando hacia el microscopio y 2) la intersección de las suturas coronal y sagital sea el punto de referencia centrado de la etapa.</li>
		<li>Coloque la cubierta de vidrio en el área de imágenes y verifique la alineación (Figura 1H).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Imágenes de lapso de tiempo<ol>
<li>Use una lente de bajo aumento (objetivo de inmersión en agua 25x con NA = 0.95) para escanear la calvaria. Adquirir una imagen de referencia de la intersección de sutura sagital y coronal.</li>
		<li>Utilizando las señales SHG y fluorescentes de las células, localice cada vista de lesión y registre las coordenadas XYZ, así como las distancias de las suturas sagital y coronal (Figura 2B).</li>
		<li>Elija una ubicación en las suturas coronales o sagitales para obtener imágenes a largo plazo. Tome una imagen detallada de la pila Z de esta área de referencia durante la toma de imágenes. NOTA: Dado que las suturas representan un nicho conocido de P-SSC, aquí es donde las células migrarán en respuesta a la lesión de la calvaria.</li>
		<li>Utilice la configuración del software de lapso de tiempo para grabar una imagen cada 1 minuto durante al menos 1 h. En el tiempo transcurrido entre instantáneas, compare el campo de visión actual con el campo de visión inicial. Si son diferentes, utilice la imagen de la pila Z para determinar en qué dirección debe ajustarse el campo de visión.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Cuidado postoperatorio de animales
<ol><li>Después de la toma de imágenes, enjuague la calvaria expuesta con PBS estéril para eliminar la metilcelulosa.</li>
	<li>Para cerrar la incisión, coloque suavemente el colgajo de piel sobre la calvaria. Use hisopos de algodón estériles para eliminar el ungüento oftálmico residual y secar el sitio de la incisión.</li>
	<li>Usando suturas no absorbibles de nylon monofilamento de tamaño 5-0 con una aguja de corte inversa C-1 adjunta, cierre el sitio quirúrgico. Use un hisopo de algodón estéril para aplicar ungüento antibiótico triple a la incisión cerrada. NOTA: La cicatrización se reduce con técnicas de sutura de alta calidad y sangrado mínimo.</li>
	<li>Coloque el ratón en una jaula limpia sobre una superficie cálida y verifique cada 15 minutos hasta que se logre la reclinación esternal.</li>
	<li>Administrar una segunda dosis de buprenorfina de liberación sostenida 72 h después de la cirugía.</li>
	<li>Controle diariamente el comportamiento de acurrucamiento, el pelaje con volantes y / o la falta de deambulación hasta que se retiren las suturas (~ 1 semana).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fracture+healing:+mechanisms+and+interventions.">Fracture healing: mechanisms and interventions.</a> Nature Reviews Rheumatology. 11 (1), 45-54 (2015).</li><li>Murao, H., Yamamoto, K., Matsuda, S., Akiyama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periosteal+cells+are+a+major+source+of+soft+callus+in+bone+fracture.">Periosteal cells are a major source of soft callus in bone fracture.</a> Journal of Bone and Mineral Metabolism. 31 (4), 390-398 (2013).</li><li>Colnot, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+cell+fate+decisions+within+periosteum+and+bone+marrow+during+bone+regeneration.">Skeletal cell fate decisions within periosteum and bone marrow during bone regeneration.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 24 (2), 274-282 (2009).</li><li>Roberts, S. 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L.C.O. y D.P. divulgan una patente pendiente titulada "Periosteal Skeletal Stem Cells in Bone Repair" (BAYM. P0264US. P1). Los autores restantes no declaran intereses contrapuestos.

Durante la cicatrización ósea, las células periósticas son la principal fuente de condrocitos y osteoblastos recién diferenciados dentro de un callo lesionado3. Al igual que en la médula ósea, también se han identificado CSS osteogénicas/condrogénicas en el periostio4,5,6. La evaluación de las características funcionales endógenas de P-SSC es técnicamente un desafío. A menudo, la dinámica migratoria de las CSS se evalúa in vitro, lo que dificulta la interpretación de sus correspondientes sistemas in vivo. Debido a los recientes avances en la microscopía intravital de animales vivos y la generación de ratones reporteros adicionales (Mx1 / Tomate / αSMA-GFP), ahora es posible el seguimiento in vivo de células individuales. Por lo tanto, este método permite el registro in vivo de la migración de P-SSC inducida por CCL5 en tiempo real.
Hay varios desafíos técnicos asociados con este método que pueden influir en la consistencia de las imágenes. Un desafío técnico importante con este método es mantener el plano de visión del eje Z. La deriva del eje Z (Z-drift) es un problema común en las imágenes a largo plazo de muestras fijas y vivas, y se atribuye en gran medida a los cambios de temperatura en el entorno de las imágenes.  Aunque este artefacto no se puede contrarrestar por completo, cubrir el escenario, las lentes del objetivo y las estructuras de soporte ayuda a reducir la deriva Z21.
Además, la obtención de una serie de pila Z de la ubicación de la imagen antes de la imagen de lapso de tiempo establecerá una referencia del eje Z a la que se puede hacer referencia entre las adquisiciones de imágenes (es decir, las imágenes generalmente se toman cada 30-60 s, lo que permite tiempo para ajustes al eje Z, si es necesario). Otro desafío técnico es hacer una microfractura consistente que tenga el mismo tamaño, forma y distancia de las suturas de calvaria. La distancia de las suturas coronal y sagital es crítica, porque las suturas de calvaria son un nicho para las SSC quiescentes10. El mejor método para reducir la variabilidad de la microfractura es practicar esta técnica en ratones que no están incluidos en el análisis final.
A pesar de las limitaciones, este método proporciona un sistema único para evaluar la respuesta celular individual in vivo a una lesión ósea. Dado que la reparación de fracturas es un proceso altamente complejo que involucra múltiples tipos de células, hay varios aspectos que no se entienden completamente. Uno de ellos incluye la respuesta migratoria temprana de los P-SSC hacia una lesión. Si bien CCR5 / CCL5 es un mecanismo único por el cual las P-SSC se reclutan para una lesión, es posible que las citoquinas y los factores de crecimiento adicionales desempeñen un papel importante en la curación de fracturas. Anteriormente, el tratamiento de fracturas con diversas citoquinas y factores de crecimiento ha dado lugar a resultados muy variables en la cicatrización global de fracturas22. Este método de imágenes proporciona una plataforma única para determinar los efectos fisiológicos de las posibles terapias con fármacos/citoquinas/factor de crecimiento en las respuestas celulares individuales. Finalmente, proporciona datos mecanicistas in vivo que pueden apoyar la mejora de la curación de fracturas de una terapia específica.

La reparación de fracturas es un proceso dinámico y multicelular que es distinto del desarrollo y la remodelación del esqueleto embrionario. Durante este proceso, la inducción de señales de lesión del tejido dañado es seguida por el rápido reclutamiento, proliferación y posterior diferenciación de las células madre/progenitoras esqueléticas, que son críticas para la estabilidad general y la fijación de las fracturas1. En particular, las primeras etapas de la cicatrización de la fractura requieren la formación de callos blandos, que se atribuye principalmente a las células residentes del periostio2. Cuando los huesos se lesionan, un subconjunto de células periósticas responden rápidamente y contribuyen a los intermedios de cartílago y osteoblastos recién diferenciados dentro del callo3, lo que implica la presencia de una población distinta de células madre/progenitoras esqueléticas dentro del periostio. Por lo tanto, la identificación y caracterización funcional de las células madre esqueléticas residentes en el periostio (CSS) constituyen un enfoque terapéutico prometedor para las enfermedades óseas degenerativas y los defectos óseos4.
Se cree que las SSC residen en múltiples ubicaciones de tejidos, incluida la médula ósea. Al igual que en la médula ósea, también se han identificado CSS osteogénicas/condrogénicas en el periostio4,5,6.  Estas SSCs periósticas (P-SSCs) se pueden etiquetar con marcadores de linaje mesenquimal temprano (es decir, Prx1-Cre5, Ctsk-Cre7 y Axin2-CreER8) durante el desarrollo óseo fetal4,7,8,9,10. Una limitación significativa de estos modelos de rastreo de linaje genético único es que existe una heterogeneidad sustancial dentro de las poblaciones celulares marcadas. Además, no pueden distinguir las CSS etiquetadas de su progenie in vivo. Para abordar esta limitación, recientemente desarrollamos un ratón reportero dual (Mx1-Cre+Rosa26-Tomato+α SMA-GFP+) para visualizar claramente las P-SSCs de las SSCs de médula ósea (BM-SSCs)11. Con este modelo, se ha determinado que las P-SSC están marcadas por el etiquetado dual Mx1+αSMA+, mientras que las células Mx1+ más diferenciadas residen en la médula ósea, las superficies endodesteal y perióstica, y los huesos corticales y trabeculares11,12.
Se sabe que múltiples citoquinas y factores de crecimiento regulan la remodelación y reparación ósea y han sido probados para la mejora de la reparación esquelética en defectos críticos del segmento1,13. Sin embargo, debido a la complejidad celular de los modelos de lesión generados a través de la interrupción de la barrera física del compartimento óseo, los efectos directos de estas moléculas sobre la migración endógena de P-SSC y la activación durante la curación no están claros. Las características funcionales y la dinámica migratoria de las CSS a menudo se evalúan in vitro mediante la realización de un ensayo de transpozo o rasguño, en combinación con citoquinas o factores de crecimiento que se sabe que inducen la migración en otras poblaciones celulares. Por lo tanto, la interpretación de los resultados de estos experimentos in vitro para su aplicación en sus correspondientes sistemas in vivo es un desafío. Actualmente, la evaluación in vivo de la migración de células madre/progenitoras esqueléticas no se observa típicamente en tiempo real; más bien, se mide en puntos de tiempo fijos después de la fractura5,7,14,15,16.
Una limitación de este método es que la migración no se evalúa a nivel de una sola célula; más bien, se mide a través de cambios en las poblaciones celulares. Debido a los recientes avances en la microscopía intravital de animales vivos y la generación de ratones reporteros adicionales, ahora es posible el seguimiento in vivo de células individuales. Utilizando microscopía intravital de animales vivos, observamos la migración distinta de P-SSCs desde el nicho de sutura de calvaria a una lesión ósea dentro de las 24-48 h posteriores a la lesión en ratones Mx1 / Tomate / αSMA-GFP.
CCL5/CCR5 se identificó recientemente como un mecanismo regulador que influye en el reclutamiento y la activación de P-SSCs durante la respuesta temprana a la lesión. Curiosamente, no hubo detección de una migración sustancial de P-SSC en respuesta a una lesión en tiempo real. Sin embargo, el tratamiento de una lesión con CCL5 produce una migración robusta y direccionalmente distinta de P-SSC, que se puede capturar en tiempo real. Por lo tanto, el objetivo de este protocolo es proporcionar una metodología detallada para registrar la migración in vivo de P-SSC en tiempo real después del tratamiento con CCL5.

<table><tbody><tr><td>&amp;frac12;&amp;rdquo; optical post</td><td>ThorLabs</td><td>TR2</td><td>For imaging mount</td></tr><tr><td>1 mL syringe</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>27G needle</td><td>BD PercisionGlide</td><td>305111</td><td></td></tr><tr><td>29G insulin syringe</td><td>McKesson</td><td>102-SN05C905P</td><td></td></tr><tr><td>50 mL conicol tube</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td>For mouse restraint</td></tr><tr><td>Adjustable angle plate</td><td>Renishaw</td><td>R-PCA-5023-50-20</td><td>For imaging mount</td></tr><tr><td>Alcohol wipes</td><td>Coviden</td><td>6818</td><td></td></tr><tr><td>betadine surgical scrub</td><td>Henry Schen</td><td>67618-151-16</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphine SR-LAB</td><td>ZooPharm</td><td></td><td>1mg/mL Sustained Release</td></tr><tr><td>Combo III</td><td>Obtained from staff veterinarian</td><td>N/A</td><td>37.6 mg/mL Ketamine; 1.9 mg/mL Xylazine; 0.37 mg/mL Acepronazine</td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Fisher</td><td>12-545-87</td><td>24 x 40 premium superslip</td></tr><tr><td>Fine tip forcepts</td><td>FST</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>KetaVed</td><td>50989-161-06</td><td>100 mg/mL</td></tr><tr><td>Leica TCS SP8MP with DM6000CFS</td><td>Leica Microsystems</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>R &amp;amp; D Systems</td><td>344500101</td><td></td></tr><tr><td>Medical tape</td><td>McKesson</td><td>100199</td><td>3&quot; x 10 yds (7.6 cm x 9.1 m)</td></tr><tr><td>Methocellulose</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>19560</td><td></td></tr><tr><td>Microdissection scissors</td><td>FST</td><td>1456-12</td><td></td></tr><tr><td>Motorized stage</td><td>Anaheim automation</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Needle holder</td><td>FST</td><td>12500-12</td><td></td></tr><tr><td>Nonabsorbable sutures</td><td>McKesson</td><td>S913BX</td><td>monofilament nylon 5-0 nonabsorbable sutures with attached C-1 reverse cutting needle</td></tr><tr><td>Opthalmic ointment</td><td>Rugby</td><td>0536-1086-91</td><td></td></tr><tr><td>RANTES</td><td>Biolegend</td><td>594202</td><td>10 &amp;micro;g/50 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>Right-angle clamp for &amp;frac12;&amp;rdquo; post, 3/16&amp;rdquo; Hex</td><td>ThorLabs</td><td>RA90</td><td>For imaging mount</td></tr><tr><td>Spring-loaded 3/16&amp;rdquo; Hex-locking &amp;frac14;&amp;rdquo; thumbscrew</td><td>ThorLabs</td><td>TS25H</td><td>For imaging mount</td></tr><tr><td>Sterile cotton swabs</td><td>Henry Schen</td><td>100-9249</td><td></td></tr><tr><td>Sterile DPBS (1x)</td><td>Corning</td><td>21-030-CV</td><td></td></tr><tr><td>Sterile drapes</td><td>McKessen</td><td>25-517</td><td></td></tr><tr><td>Surgical gloves</td><td>McKessen</td><td>3158VA</td><td></td></tr><tr><td>Triple antibiotic ointment</td><td>Taro Pharmaceuticals U.s.a., Inc.</td><td>51672-2120-2</td><td></td></tr><tr><td>Vacutainer blood collection set</td><td>BD</td><td>REF 367298</td><td>25G butterfly needle infusion set with 12&quot; tubing</td></tr></tbody></table>

real-time imaging of ccl5-induced migration of periosteal skeletal stem cells in mice

Las células madre esqueléticas periósticas (P-SSC) son esenciales para el mantenimiento y la reparación ósea de por vida, lo que las convierte en un foco ideal para el desarrollo de terapias para mejorar la curación de fracturas.  Las células periósticas migran rápidamente a una lesión para suministrar nuevos condrocitos y osteoblastos para la curación de fracturas. Tradicionalmente, la eficacia de una citoquina para inducir la migración celular solo se ha llevado a cabo in vitro mediante la realización de un ensayo de transpozo o rasguño. Con los avances en la microscopía intravital utilizando excitación multifotónica, recientemente se descubrió que 1) las P-SSC expresan el gen migratorio CCR5 y 2) el tratamiento con el ligando CCR5 conocido como CCL5 mejora la cicatrización de fracturas y la migración de P-SSCs en respuesta a CCL5. Estos resultados han sido capturados en tiempo real. Aquí se describe un protocolo para visualizar la migración de P-SSC desde el nicho de células madre esqueléticas (SSC) de sutura calvarial hacia una lesión después del tratamiento con CCL5. El protocolo detalla la construcción de una sujeción del ratón y un soporte de imágenes, la preparación quirúrgica de la calvaria del ratón, la inducción de un defecto de la calvaria y la adquisición de imágenes de lapso de tiempo.

Se ha propuesto que los progenitores esqueléticos tienen potencial migratorio o circulatorio20. Recientemente, se generaron ratones reporteros Mx1-Cre+Rosa26-Tomato+α SMA-GFP+ (Mx1/Tomato/αSMA-GFP), en los que los P-SSC están marcados por el etiquetado dual Mx1+α SMA+ (Figura 2A,B). La migración sustancial de Mx1+α SMA+ P-SSCs ocurrió fuera del mesénquima de sutura dentro de las 24-48 h posteriores a la lesión11.  También se probó la posibilidad de detectar la migración P-SSC in vivo en tiempo real 24 h después de un defecto de calvaria. Se observó poca o ninguna migración de Mx1+αSMA+ P-SSCs dentro de 1 h de la imagen (Figura 2C).
Mx1+α SMA+ P-SSCs expresan de forma única el receptor CCL5 conocido como CCR511. Por lo tanto, el tratamiento de un defecto de la calvaria 24 h después de la lesión con CCL5 indujo una migración direccionalmente distinta lejos de la sutura coronal y hacia la vista de la lesión (Figura 2D, E). Dentro de 1 h de la imagen, uno de los Mx1+ αSMA+ P-SSCs migró aproximadamente 50 μm hacia la lesión (Figura 2E). También se observaron otros Mx1+αSMA+ P-SSCs migrando en respuesta al tratamiento con CCL5, pero en menor medida.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61162/61162fig1.jpg"> Figura 1: Configuración para imágenes in vivo de calvarias de ratón. Imágenes representativas de la sujeción del ratón (A) y la montura de imagen (B) utilizadas durante la obtención de imágenes en vivo. (C) Ratón en la sujeción y asegurado al soporte de imágenes. (D) Representación esquemática de la estructura de la calvaria del ratón, identificando las suturas frontal (FS), coronal (CS), sagital (SS) y lambdoide (LS). (E) Colocación representativa de lesiones por microfractura de calvaria. (F) Colocación de sutura quirúrgica postoperatoria para una curación óptima y futuras imágenes. Imágenes representativas de la colocación del montaje en la etapa del microscopio (G) y la colocación del labio de la cubierta (H). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61162/61162fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61162/61162fig2.jpg"> Figura 2: Imágenes in vivo en tiempo real de la migración Mx1+αSMA+ P-SSC. (A) Esquema de preparación de ratones reporteros duales Mx1/Tomate/αSMA-GFP.  Los ratones fueron inyectados por vía intraperitoneal con 25 mg/kg de pIpC cada dos días durante 10 días (1). Los ratones Mx1/Tomate/αSMA-GFP fueron irradiados letalmente con 9,5 Gy (2) 1 día antes del trasplante intravenoso de 1 x 106 células mononucleares de médula ósea entera de ratones WT C57BL/6 (3).  Después de 6-8 semanas de recuperación (cuando las células hematopoyéticas del huésped se volvieron menos del 5%), los ratones fueron sometidos a experimentos de lesión ósea. Mx1+ (Tomate+), αSMA+ (GFP+), Mx1+α SMA+ (Tomate+GFP+) y hueso (azul). (B) Máxima proyección Z de una lesión calvaria representativa (círculo blanco) e imágenes (cuadrado blanco) en relación con las suturas sagitales (SS) y coronales (CS) del ratón Mx1/Tomate/αSMA-GFP.  Las líneas punteadas representan las suturas de calvaria. (C) Imágenes in vivo de la respuesta de Mx1 + α SMA + P-SSCs 24 horas después de la lesión. Barra de escala = 25 μm. (D) 24 h después de la lesión, CCL5 se administró a la vista de la lesión, y las imágenes in vivo se realizaron 1 h más tarde en relación con la sutura coronal (CS). El cuadrado blanco representa la ubicación de las imágenes de migración celular que se muestran en (E). Barra de escala = 75 μm.  (E) Migración de Mx1+α SMA+ P-SSCs en la superficie ósea (azul) hacia la vista de la lesión (arriba a la derecha). Barra de escala = 25 μm. En (C,D,E), los números indican el tiempo de obtención de imágenes. La flecha amarilla indica la dirección de la ubicación de la lesión. El asterisco indica la ruta migratoria de Mx1+α SMA+ P-SSC. La imagen es representativa de los resultados de tres a cinco ratones. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61162/61162fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Real-Time Imaging of CCL5-Induced Migration of Periosteal Skeletal Stem Cells in Mice

Este protocolo describe la detección de la migración de células madre esqueléticas periósticas mediada por CCL5 en tiempo real utilizando microscopía intravital de animales vivos.

Imágenes en tiempo real de la migración inducida por CCL5 de células madre esqueléticas periósticas en ratones

Periosteal skeletal stem cells (P-SSCs) are essential for lifelong bone maintenance and repair, making them an ideal focus for the development of ...

real-time-imaging-ccl5-induced-migration-periosteal-skeletal-stem

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

2.2K vistas.  Baylor College of Medicine. Este protocolo describe la detección de la migración de células madre esqueléticas periósticas mediada por CCL5 en tiempo real utilizando microscopía intravital de animales vivos.

Video: Real-Time Imaging of CCL5-Induced Migration of Periosteal Skeletal Stem Cells in Mice

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth factors, and extracellular matrix. The ability of HSCs to remain quiescent, self-renew or differentiate, and acquire mutations and become malignant depends upon the complex interactions they establish with different stromal components. To observe the crosstalk between human HSCs and the human BM niche in physiological and pathological conditions, we designed a protocol to ectopically model and image a humanized BM niche in immunodeficient mice. We show that the use of different cellular components allows for the formation of humanized structures and the opportunity to sustain long-term human hematopoietic engraftment. Using two-photon microscopy, we can live-image these structures in situ at the single-cell resolution, providing a powerful new tool for the functional characterization of the human BM microenvironment and its role in regulating normal and malignant hematopoiesis.

A method to create and live-image different humanized bone-marrow niches in mice is presented. Based on the supportive niche created by human mesenchymal cells, the addition of human endothelial cells induces the formation of human vessels, while the addition of rhBMP-2 induces the formation of human-mouse chimeric mature bone tissue.

Bioingeniería de los microambientes humanizados de la médula ósea en el ratón y su visualización por imágenes en directo

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, both in preclinical and clinical studies. However, to date results regarding functional outcome and/or tissue regeneration following stem cell transplantation are quite diverse. Generally, a clinical benefit is observed without profound understanding of the underlying mechanism(s)1. Therefore, multiple efforts have led to the development of different molecular imaging modalities to monitor stem cell grafting with the ultimate aim to accurately evaluate survival, fate and physiology of grafted stem cells and/or their micro-environment. Changes observed in one or more parameters determined by molecular imaging might be related to the observed clinical effect. In this context, our studies focus on the combined use of bioluminescence imaging (BLI), magnetic resonance imaging (MRI) and histological analysis to evaluate stem cell grafting.
BLI is commonly used to non-invasively perform cell tracking and monitor cell survival in time following transplantation2-7, based on a biochemical reaction where cells expressing the Luciferase-reporter gene are able to emit light following interaction with its substrate (e.g. D-luciferin)8, 9. MRI on the other hand is a non-invasive technique which is clinically applicable10 and can be used to precisely locate cellular grafts with very high resolution11-15, although its sensitivity highly depends on the contrast generated after cell labeling with an MRI contrast agent. Finally, post-mortem histological analysis is the method of choice to validate research results obtained with non-invasive techniques with highest resolution and sensitivity. Moreover end-point histological analysis allows us to perform detailed phenotypic analysis of grafted cells and/or the surrounding tissue, based on the use of fluorescent reporter proteins and/or direct cell labeling with specific antibodies.
In summary, we here visually demonstrate the complementarities of BLI, MRI and histology to unravel different stem cell- and/or environment-associated characteristics following stem cell grafting in the CNS of mice. As an example, bone marrow-derived stromal cells, genetically engineered to express the enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) and firefly Luciferase (fLuc), and labeled with blue fluorescent micron-sized iron oxide particles (MPIOs), will be grafted in the CNS of immune-competent mice and outcome will be monitored by BLI, MRI and histology (Figure 1).

This article describes an optimized sequence of events for multimodal imaging of cellular grafts in rodent brain using: (i) in vivo bioluminescence and magnetic resonance imaging, and (ii) post mortem histological analysis. Combining these imaging modalities on a single animal allows cellular graft evaluation with high resolution, sensitivity and specificity.

Imagen multimodal de implante de células madre en el sistema nervioso central de ratones

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Neurociencias

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

In order to support the clinical application of human adipose-derived mesenchymal stem cell (haMSC) therapy for knee osteoarthritis (KOA), we examined the efficacy of cell persistence and biodistribution of haMSCs in animal models. We demonstrated a method to label the cell membrane of haMSCs with lipophilic fluorescent dye. Subsequently, intra-articular injection of the labeled cells in rats with surgically induced KOA was monitored dynamically by an in vivo imaging system. We employed the lipophilic carbocyanines DiD (DilC18 (5)), a far-red fluorescent Dil (dialkylcarbocyanines) analog, which utilized a red laser to avoid excitation of the natural green autofluorescence from surrounding tissues. Furthermore, the red-shifted emission spectra of DiD allowed deep-tissue imaging in live animals and the labeling procedure caused no cytotoxic effects or functional damage to haMSCs. This approach has been shown to be an efficient tracking method for haMSCs in a rat KOA model. The application of this method could also be used to determine the optimal administration route and dosage of MSCs from other sources in pre-clinical studies.

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

This protocol describes an efficient way to monitor the cell persistence and biodistribution of human adipose-derived mesenchymal stem cells (haMSCs) by far-red fluorescence labeling in a rat knee osteoarthritis (KOA) model via intra-articular (IA) injection.

En Vivo Seguimiento de humanos derivados del adiposo células madre mesenquimales en un modelo de artrosis de rodilla de ratas con tinte fluorescente membrana lipofílica

In order to support the clinical application of human adipose-derived mesenchymal stem cell (haMSC) therapy for knee osteoarthritis (KOA), we examined the ...

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in vivo demonstration of such cells has only recently been attained. Here, in vivo imaging techniques to investigate the role of endogenous osteogenic stem/progenitor cells (OSPCs) and their progeny in bone repair are provided. Using osteo-lineage cell tracing models and intravital imaging of induced microfractures in calvarial bone, OSPCs can be directly observed during the first few days after injury, in which critical events in the early repair process occur. Injury sites can be sequentially imaged revealing that OSPCs relocate to the injury, increase in number and differentiate into bone forming osteoblasts. These methods offer a means of investigating the role of stem cell-intrinsic and extrinsic molecular regulators for bone regeneration and repair.

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Quantitative measurement of bone progenitor function in fracture healing requires high resolution serial imaging technology. Here, protocols are provided for using intravital microscopy and osteo-lineage tracking to sequentially image and quantify the migration, proliferation and differentiation of endogenous osteogenic stem/progenitor cells in the process of repairing bone fracture.

Secuencial<em&gt; En vivo</em&gt; Imagen de células madre / progenitoras osteogénicas durante la reparación de la fractura

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

Medicina

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal environment. Biological activities of immune cells mainly rely on their motility capacities. Blood monocytes have short half-life in the bloodstream; they originate in the bone marrow and are constitutively released from it. In inflammatory condition, this process is enhanced, leading to blood monocytosis and subsequent infiltration of the peripheral inflammatory tissues. Identifying the biomechanical events controlling monocyte trafficking from the bone marrow towards the vascular network is an important step to understand monocyte physiopathological relevance. We performed in vivo time-lapse imaging by two-photon microscopy of the skull bone marrow of the Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP (MacBlue) mouse. The MacBlue mouse expresses the fluorescent reporters enhanced cyan fluorescent protein (ECFP) under the control of a myeloid specific promoter 1, in combination with vascular network labelling. We describe how this approach enables the tracking of individual medullar monocytes in real time to further quantify the migratory behaviour within the bone marrow parenchyma and the vasculature, as well as cell-to-cell interactions. This approach provides novel insights into the biology of the bone marrow monocyte subsets and allows to further address how these cells can be influenced in specific pathological conditions.

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Monocytes are key regulators of innate immunity and play a critical role in the renewal of the peripheral mononuclear phagocytic system and in case of inflammation. This manuscript describes the procedure of real time imaging of the mouse calvaria bone marrow to study the monocyte mobilisation mechanism.

Seguimiento de médula ósea de ratón monocitos<em&gt; En Vivo</em

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal ...

Inmunología e Infección

Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, including hematopoiesis, immune regulation and tumor regulation. Commonly used methods for understanding cellular actions in the bone marrow, such as histology and blood counts, provide static information rather than capturing the dynamic action of multiple cellular components in vivo. To complement the standard methods, a window chamber (WC)-based model was developed to enable serial in vivo imaging of cells and structures in the murine bone marrow. This protocol describes a surgical procedure for installing the WC in the femur, in order to facilitate long-term optical access to the femoral bone marrow. In particular, to demonstrate its experimental utility, this WC approach was used to image and track neutrophils within the vascular network of the femur, thereby providing a novel method to visualize and quantify immune cell trafficking and regulation in the bone marrow. This method can be applied to study various biological processes in the murine bone marrow, such as hematopoiesis, stem cell transplantation, and immune responses in pathological conditions, including cancer.

Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

The protocol describes a novel murine femur window chamber model that can be used to track movement of cells in the femoral bone marrow in vivo. Intravital multiphoton fluorescence microscopy is used to image three components of the femoral bone marrow (vasculature, collagen matrix, and neutrophils) over time.

Fémur Window Cámara Modelo de<em&gt; En Vivo</em&gt; Seguimiento de la célula de la médula ósea murina

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, ...

Intravital Microscopy of the Microcirculation in the Mouse Cremaster Muscle for the Analysis of Peripheral Stem Cell Migration

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to nonmarrow tissue have not been completely clarified. We describe here the technique of intravital microscopy applied to the mouse cremaster microcirculation for analysis of peripheral bone marrow stem cell migration in vivo. Intravital microscopy of the M. cremaster has been previously introduced in the field of inflammatory research for direct observation of leucocyte interaction with the vascular endothelium. Since sufficient peripheral stem and progenitor cell migration includes similar initial steps of rolling along and firm adhesion at the endothelial lining it is conceivable to apply the M. cremaster model for the observation and quantification of the interaction of intravasculary administered stem cells with the endothelium. As various chemical components can be selectively applied to the target tissue by simple superfusion techniques, it is possible to establish essential microenvironmental preconditions, for initial stem cell recruitment to take place in a living organism outside the bone marrow.

Intravital microscopy of the mouse M. cremaster microcirculation offers a unique and well-standardized in vivo model for the analysis of peripheral bone marrow stem cell migration.

Microscopia intravital de la microcirculación en el músculo de ratón Cremaster para el análisis de la migración de la célula madre periféricas

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to ...

Biología

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and temporal resolution to study in vivo hematopoiesis using the murine bone marrow transplant experimental model. Genetic combinatorial marking using lentiviral vectors encoding fluorescent proteins (FPs) enabled cell fate mapping through advanced microscopy imaging. Vectors encoding five different FPs: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, and mCherry were used to concurrently transduce HSPCs, creating a diverse palette of color marked cells. Imaging using confocal/two-photon hybrid microscopy enables simultaneous high resolution assessment of uniquely marked cells and their progeny in conjunction with structural components of the tissues. Volumetric analyses over large areas reveal that spectrally coded HSPC-derived cells can be detected non-invasively in various intact tissues, including the bone marrow (BM), for extensive periods of time following transplantation. Live studies combining video-rate multiphoton and confocal time-lapse imaging in 4D demonstrate the possibility of dynamic cellular and clonal tracking in a quantitative manner.

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Combinatorial 5 fluorescent proteins marking of hematopoietic stem and progenitor cells allows in vivo clonal tracking via confocal and two-photon microscopy, providing insights into bone marrow hematopoietic architecture during regeneration. This method allows non-invasive fate mapping of spectrally-coded HSPCs-derived cells in intact tissues for extensive periods of time following transplantation.

En Tracking Clonal vivo de madre hematopoyéticas y células progenitoras Marcado por cinco proteínas fluorescentes utilizando confocal y Microscopía Multifotónica

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

En Vivo Tracking 4-Dimensional de madre hematopoyéticas y células progenitoras en ratones adultos de calota de Médula Ósea

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

In vitro Time-lapse Live-Cell Imaging to Explore Cell Migration toward the Organ of Corti

To study the effects of mesenchymal stem cells (MSCs) on cell regeneration and treatment, this method tracks MSC migration and morphological changes after co-culture with cochlear epithelium. The organ of Corti was immobilized on a plastic coverslip by pressing a portion of the Reissner's membrane generated during the dissection. MSCs confined by a glass cylinder migrated toward cochlear epithelium when the cylinder was removed. Their predominant localization was observed in the modiolus of the organ of Corti, aligned in a direction similarly to that of the nerve fibers. However, some MSCs were localized in the limbus area and showed a horizontally elongated shape. In addition, migration into the hair cell area was increased, and the morphology of the MSCs changed to various forms after kanamycin treatment. In conclusion, the results of this study indicate that the coculture of MSCs with cochlear epithelium will be useful for the development of therapeutics via cell transplantation and for studies of cell regeneration that can examine various conditions and factors.

In this study, we present a real-time imaging method using confocal microscopy to observe cells moving toward damaged tissue by ex vivo incubation with the cochlear epithelium containing the organ of Corti.

In vitro Time-lapse live-cell imaging para explorar la migración celular hacia el órgano de Corti

To study the effects of mesenchymal stem cells (MSCs) on cell regeneration and treatment, this method tracks MSC migration and morphological changes after ...

Imágenes en tiempo real de la migración inducida por CCL5 de células madre esqueléticas periósticas en ratones

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