Name: production of germ-free fast-growing broilers from a commercial line for microbiota studies
Uploaded: 2020-06-18T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Germ-Free Fast-Growing Broilers from a Commercial Line for Microbiota Studies at JoVE.com

Yazarlar, döllenmiş yumurta temini için yetiştiricilere ve Boyé accouvage topluluğuna (La Boissière en Gâtine, Fransa) minnettardır. Bu çalışma, Fransa'daki Région Centre Val de Loire tarafından finanse edilen APR-IA "INTEGRITY" (2017-2019) araştırma konsorsiyumunun himayesinde gerçekleştirilmiştir.

Hayvan bakım prosedürleri, Avrupa Toplulukları Konseyi Direktifi (86/609/EEC) ve hayvan deneylerine ilişkin Fransız yönetmelikleri tarafından belirlenen kılavuzlara uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. İzolatör preparatı
<ol><li>Gerekli malzemeleri pozitif basınç altında sert bir izolatöre yerleştirin: 50 mL tüpler, 5, 10 ve 25 mL plastik pipetler, ışınlanmış besleme, otoklavlanmış su ve steril sızdırmaz plastik kaplar.</li>
	<li>Transfer mikrop öldürücü tuzağı% 2'lik bir kuaterner amonyum çözeltisi ile doldurun.</li>
	<li>Metreküp(m3) başına 30 g potasyum permanganata ilave edilen 60 mL formalin (% 24 formaldehit) kullanarak izolatörün formaldehit buharı ile üç kez sterilize edilmesi. Tüm temas yüzeylerinin sterilizasyonunu sağlamak için izolatör içindeki malzemeleri her sterilizasyon arasında hareket ettirin.</li>
	<li>Yumurtaları sokmadan önce izolatör sıcaklığını en az 2 gün boyunca 37 ° C'ye ayarlayın. Higrometreyi, giriş gününde bağıl nemin% 65-70'ine (RH) ayarlayın.</li>
</ol>2. Yumurta toplama ve kuluçka
<ol><li>Yumurtaları, yumurtlayan tavukların iyi bir kuluçka oranına (yumurta üretiminin zirvesinde en az% 80) ve iyi sıhhi durumlarına (yani, yaygın kümes hayvanı patojenlerinin yokluğu ve sürü içinde hastalıkların yokluğu) dayanarak seçilen çiftliklerden toplayın. Koşu bandında görsel olarak temiz ve kusursuz yumurtalar seçin.</li>
	<li>Yumurta yüzeyini, oda sıcaklığında% 1.5'lik bir perasetik asit çözeltisine 5 dakika batırarak derhal dekontamine edin.</li>
	<li>Formaldehit buharı ile dekontamine edilmiş bir kutu kullanarak yumurtaları deney tesisine taşıyın.</li>
	<li>Yumurtaları 4 °C'de 24 saat saklayın. Adım 2.2'de açıklanan dekontaminasyon işlemini tekrarlayın ve 19 gün boyunca kuluçkalık bir inkübatöre (Gün 0) yerleştirin.</li>
</ol>3. Kuluçka
<ol><li>19. Günde, doğurganlığı, canlılığı (hareketliliği) ve embriyo gelişimini, steril koşullar altında hafif bir yumurta mum makinesi kullanarak konserve ederek doğrulayın. Steril kuluçkalık izolatörlere sadece canlı embriyonlanmış yumurtaları sürün.</li>
	<li>Seçilen yumurtaları, 30 s boyunca% 1.5 perasetik asit çözeltisi püskürterek veya her yumurtanın tüm yüzeyi kaplanana kadar dekontamine edin. Yumurtalar, izolatörlere transfer sırasında 16 dakika ve 30 s boyunca spreyle temas halinde kalacaktır.</li>
	<li>Yumurtaları steril kuluçka izolatörlerine aktarın ve kuluçka boşluğuna yerleştirmeden önce steril demineralize su ile durulayın. NOT: Hayvanlar yumurtadan çıkar ve steril izolatörlerde yetiştirilir. Gama ışınlaması ile sterilize edilmiş ticari bir diyetle ad libitum ile beslenirler ve su dağıtıcıları tarafından sağlanan otoklavlanmış musluk suyuyla sulanırlar.</li>
</ol>4. Bakteriyolojik durum analizi
<ol><li>Yumurtadan çıktıktan bir gün sonra, doğrudan farklı civcivlerin rektumundan bir dışkı örneği alın ve bu numuneyi belirli bir izolatör içindeki tüm hayvanları temsil etmek için sterilize edilmiş bir cam tüp içinde toplayın.</li>
	<li>Dışkı örnekleri az ya da çok sıvı olduğundan, resazurin ile 9 mL tiyoglikolat et suyuna 1 mL dışkı eşdeğeri ekleyin. Kalan dışkı örneğini 9 mL beyin kalp infüzyonu suyuna (BHI) ekleyin ve tüpleri 18 ila 48 saat boyunca sallamadan 37 ° C'de inkübe edin. Bu, çok çeşitli aerobik, fakültatif aerobik ve titiz olmayan anaerobik türlerin büyümesine izin verecektir. NOT: Resizmarinli tioglikolat et suyu, titiz olmayan anaerobik bakterilerin tespiti için tasarlanmıştır, ancak aynı zamanda aerobik bakterilerin tespitini de sağlar. Bu ortam, sterilite testi için Avrupa, Amerika ve Japon farmakopelerine uygundur18,19,20.</li>
	<li>Büyüme ortamındaki herhangi bir değişikliğin 18 saatlik inkübasyondan sonra meydana gelip gelmediğini görsel olarak gözlemleyin. 48 saat sonra, BHI dışkı-et suyu ortamından bir damla alın, bir cam slayta yerleştirin ve bakterilerin yokluğu veya varlığı için mikroskop altında (40X büyütme) gözlemleyin.</li>
	<li>Bakterilerin varlığına dair bir şüphe varsa, BHI kültüründen bir örnek alın ve BHI agar plakalarına tohumlayın. 18 ila 48 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.</li>
	<li>Koloniler varsa, hassas mikrobiyal tanımlama için MALDI-TOF kütle spektrometresi gibi yüksek verimli teknikler uygulayın. NOT: 72 saat sonra, bakteriyolojik analizler negatifse, hayvanlar mikropsuz ilan edilir.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Shang, Y., Kumar, S., Oakley, B., Kim, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chicken+microbiota:+importance+and+detection+echnology.">Chicken microbiota: importance and detection echnology.</a> Frontiers in Veterinary Science. 23, 5 (2018).</li><li>Grover, M., Kashyap, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ-free+mice+as+a+model+to+study+effect+of+gut+microbiota+on+host+physiology.">Germ-free mice as a model to study effect of gut microbiota on host physiology.</a> Neurogastroenterology &amp; Motility. 26 (6), 745-748 (2014).</li><li>Umesaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+gnotobiotic+mice+to+identify+and+characterize+key+microbes+responsible+for+the+development+of+the+intestinal+immune+system.">Use of gnotobiotic mice to identify and characterize key microbes responsible for the development of the intestinal immune system.</a> Proceedings of the Japan Academy, Ser. B, Physical and Biological Sciences. 90 (9), 313-332 (2014).</li><li>Carrasco, J. M., Casanova, N. A., Fern&#225;ndez, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiota,+gut+health+and+chicken+productivity:+what+is+the+connection?.">Microbiota, gut health and chicken productivity: what is the connection?.</a> Miyakawa. Microorganisms. 7 (10), 374 (2019).</li><li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+microbial+communities+in+the+chicken+oviduct+and+the+origin+of+chicken+embryo+gut+microbiota.">Characterization of microbial communities in the chicken oviduct and the origin of chicken embryo gut microbiota.</a> International Journal of Scientific Reports. 9 (1), 6838 (2019).</li><li>Hincke, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+structural+barriers+and+innate+immune+components+during+incubation+of+the+avian+egg:+critical+interplay+between+autonomous+embryonic+development+and+maternal+anticipation.">Dynamics of structural barriers and innate immune components during incubation of the avian egg: critical interplay between autonomous embryonic development and maternal anticipation.</a> Journal of Innate Immunity. 11 (2), 111-124 (2019).</li><li>Le Bars, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+of+a+protocol+for+obtaining+germ-free+chickens.">Demonstration of a protocol for obtaining germ-free chickens.</a> Annals of Veterinary Research. 7, 383-396 (1976).</li><li>Lafont, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+study+of+some+factors+limiting+'competitive+exclusion'+of+Salmonella+in+chickens.">Experimental study of some factors limiting 'competitive exclusion' of Salmonella in chickens.</a> Research in Veterinary Science. 34 (1), 16-20 (1983).</li><li>Br&#233;e, A., Dho, M., Lafont, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+infectivity+for+axenic+and+specific-pathogen-free+chickens+of+O2+Escherichia+coli+strains+with+or+without+virulence+factors.">Comparative infectivity for axenic and specific-pathogen-free chickens of O2 Escherichia coli strains with or without virulence factors.</a> Avian Diseases. 33 (1), 134-139 (1989).</li><li>Dozois, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+colonization+and+in+vivo+expression+of+F1+(type+1)+fimbrial+antigens+in+chickens+experimentally+infected+with+pathogenic+Escherichia+coli.">Bacterial colonization and in vivo expression of F1 (type 1) fimbrial antigens in chickens experimentally infected with pathogenic Escherichia coli.</a> Avian Diseases. 38 (2), 231-239 (1994).</li><li>Schouler, C., Taki, A., Chouikha, I., Moulin-Schouleur, M., Gilot, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genomic+island+of+an+extraintestinal+pathogenic+Escherichia+coli+strain+enables+the+metabolism+of+fructooligosaccharides,+which+improves+intestinal+colonization.">A genomic island of an extraintestinal pathogenic Escherichia coli strain enables the metabolism of fructooligosaccharides, which improves intestinal colonization.</a> Journal of Bacteriology. 191 (1), 388-393 (2009).</li><li>Porcheron, G., Chanteloup, N., Trotereau, A., Br&#233;e, A., Schouler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+fructooligosaccharide+metabolism+on+chicken+colonization+by+an+extra-intestinal+pathogenic+Escherichia+coli+strain.">Effect of fructooligosaccharide metabolism on chicken colonization by an extra-intestinal pathogenic Escherichia coli strain.</a> PLoS One. 7 (4), 35475 (2012).</li><li>Kraimi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+a+gut+microbiota+transfer+on+emotional+reactivity+in+Japanese+quails+(Coturnix+japonica).">Effects of a gut microbiota transfer on emotional reactivity in Japanese quails (Coturnix japonica).</a> of Experimental Biology. 222, (2019).</li><li>Stanley, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+microbiota+associated+with+differential+feed+conversion+efficiency+in+chickens.">Intestinal microbiota associated with differential feed conversion efficiency in chickens.</a> Applied microbiology and biotechnology. 96, 1361-1369 (2012).</li><li>Han, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+the+gut+microbiota+composition+on+Campylobacter+jejuni+colonization+in+chickens.">Influence of the gut microbiota composition on Campylobacter jejuni colonization in chickens.</a> Infection and Immunity. 85 (11), 0038017 (2017).</li><li>Thomas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+microbial+dynamics+during+conventionalization+of+germ-free+chicken.">Gut microbial dynamics during conventionalization of germ-free chicken.</a> mSphere. 4 (2), 00035-00119 (2019).</li><li>Langhout, D. J., Schutte, J. B., de Jong, J., Sloetjes, H., Verstegen, M. W., Tamminga, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+viscosity+on+digestion+of+nutrients+in+conventional+and+germ-free+chicks.">Effect of viscosity on digestion of nutrients in conventional and germ-free chicks.</a> British Journal of Nutrition. 83 (5), 533-540 (2000).</li><li>European Pharmacopoeia. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> European Pharmacopoeia (Ph. Eur.): Supplement 6.3, Sterility. , (2009).</li><li>Japanese Pharmacopoeia, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Japanese Pharmacopoeia (JP): The 4.06 Sterility Test as it appeared in the partial revision of the JP 15th edition. , (2009).</li><li>United States Pharmacopeia (USP). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> United States Pharmacopeia (USP): Sterility Tests as presented in Pharmacopeial Forum, Interim Revision Announcement No. 6. 34 (6), (2008).</li><li>Harrison, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+germ-free+chicks:+a+comparison+of+the+hatchability+of+eggs+sterilized+externally+by+different+methods.">Production of germ-free chicks: a comparison of the hatchability of eggs sterilized externally by different methods.</a> Laboratory Animals. 3 (1), 51-59 (1969).</li><li>Yokota, H., Furuse, M., Okumura, J., Iwao Task, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+production+and+rearing+of+the+germ-free+chick.">A simple method for production and rearing of the germ-free chick.</a> J-STAGE home Nihon Chikusan Gakkaiho. 55 (8), (1984).</li><li>Ding, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inheritance+and+establishment+of+gut+microbiota+in+chickens.">Inheritance and establishment of gut microbiota in chickens.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1967 (2017).</li></ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Mikropsuz tavuklar üretmek için çeşitli yöntemler daha önce tanımlanmıştır 7,21,22. Burada sunulanlar gibi basit yöntemler, yumurta yüzeyindeki ve izolatörlerdeki bakteri yükünü azaltmak için farklı dezenfektanlar kullanır. En sık kullanılan dezenfektanlar merkürik klorür, kuaterner amonyum, iyodoform, sodyum hipoklorit ve klor dioksit çözeltileridir. Sonuçlar genellikle tatmin edicidir. Bununla birlikte, bu yöntemlerin erişilebilirliğine rağmen, az sayıda yapı yöntemi uygulayabilir ve hayvanları büyük ölçekte yetiştirebilir, böylece mikropsuz tavukların kullanımını, yalnızca çok özel bilimsel soruları ele almak için kullanılan, nispeten nadir bir yaklaşım haline getirir. Burada açıklanan yöntemler, malzemeler ve ekipmanlar, en az 3 hafta boyunca sağlıklı ve steril kalan mikropsuz piliçlerin yüksek verimli bir kuluçka oranına izin verir (üretildikleri bilimsel deneylerin süresi).
Sonuçlar, protokolün ticari kanatlı hayvan çiftliklerinde toplanan yumurtalardan mikropsuz civcivlerin üretimine uyarlanmasının başarılı olduğunu göstermektedir. SPF yumurta üretimi ile ilgili deneyimler, kuluçka verimliliğinin öncelikle yumurtlayan tavukların yaşına ve toplanan yumurtaların kalitesine bağlı olduğunu ortaya koymaktadır. Çiftlikler seçildiğinde ve yumurtalar toplanırken her iki parametre de dikkate alınmıştır. Aynı yöntemi kullanarak, mikropsuz piliçlerin ortalama kuluçka oranı, tesisimizdeki SPF yumurtlayan tavukların son üretiminde elde edilenden (% 79'a karşı% 35), hayvan sterilitesini etkilemeden (% 87'ye karşı% 83) elde edilenden çok daha iyidir. Bu farklılıklar, kuşların genetik arka planıyla (piliçlere karşı katmanlar) ve SPF hayvanlarının yumurtalarında daha kırılgan olması muhtemel olan yumurta kabuğunun kalitesiyle ilişkili olabilir. Ayrıca, 2 saatten fazla (çiftliklerden deney tesisine) taşımanın kuluçka verimliliğini ve kalitesini etkilemediğini de gösteriyoruz.
Kuluçkalık izolatörler için kullanılan sterilizasyon işlemi ve yumurta dekontaminasyonu protokolü optimize edilmiş olmasına rağmen, izolatörlerin yaklaşık% 10'u mikropsuz değildi. Kontaminasyonun kökenini anlamak için, yumurtadan çıkan izolatörlerin yumurta girişinden önce rutin sterilite kontrolünün yapılması çok önemlidir.
Kuşların sterilite durumu ile ilgili olarak, dışkı örneklerinden aerobik ve titiz olmayan anaerobik bakterilerin büyümesine izin veren yöntemleri uygulamaya çalıştık, böylece canlı, canlı bakterileri tespit ettiğimizi sağladık. Bu yöntemler, sterilite testi için uluslararası farmakopelerle uyumludur ve rutin olarak kullanılacak hızlı, kolay ve maliyeti düşük teknikleri temsil eder. Bununla birlikte, 16S rRNA gen dizilimi gibi moleküler biyoloji teknikleri, bakteri canlılığı hakkında bilgi vermemekle birlikte, yetiştirilemeyen bakterilerin varlığının doğrulanması için uygulanabilir. Nitekim, yakın zamanda yapılan bir çalışma, maternal yumurta kanalı mikrobiyotasının bazı bakterilerinin yumurta akı yoluyla embriyoya aktarıldığını ve daha sonra embriyo bağırsak bakteri popülasyonunun çoğunu oluşturduğunu ileri sürmüştür5. Dahası, başka bir çalışma, erken embriyolarda barındırılan mikrobiyal kolonizatörlerin bir kısmının maternal tavuklardan miras alındığını ve bağırsak mikrobiyal bolluğunun ve çeşitliliğinin daha sonra gelişim sırasında çevresel faktörlerden ve konakçı genetiğinden etkilendiğini ileri sürdü23. Bununla birlikte, bu çalışmaların sonuçları, bu bakterilerin büyük bir kısmının yumurta akında (büyük ölçüde antimikrobiyal moleküllerle yüklü) ölü olabileceği veya çoğalamayacağı DNA dizi analizine dayanmaktadır. Thomas ve işbirlikçileri16 , BHI plakalarına dışkı damlatma yoluyla yetiştirilebilir aerobik ve fakültatif aerobik bakterilerin değerlendirilmesi yoluyla sterilite testi gerçekleştirdi ve böylece mikropsuz sterilite kontrolü için standart bakteriyolojik yöntemlerin verimliliğini vurguladı. Ayrıca, önerilen protokolde, titiz olmayan anaerobik bakterilerin büyümesini tespit edebilmek için resazurin ile tiyoglikolat et suyunda büyüme izlemeyi kullandık.
Mikropsuz bıldırcınların ve tavukların üretimi için zaten kullanılan protokol, çoğu yuva yapan kuştan mikropsuz hayvanların üretimine uyarlanabilir ve bu hayvanların fizyolojisine mikrobiyota katkısının incelenmesi için perspektifler sunar. Bu modelin kümes hayvanı bağırsağındaki konakçı-mikrobiyota karşılıklı etkileşimlerini araştırmak için kullanılmasının yanı sıra, uygulamalı araştırmalar için de yararlı olabilir. Örneğin, hayvan sağlığını ve sağlamlığını iyileştirmek için tavuk bağırsağı komensal mikroorganizmalarından türetilen probiyotiklerin güvenliğini ve etkinliğini değerlendirmek için kullanılabilir.

Bağırsak mikrobiyotasının hayvan sağlığına katkısı ile ilgili bilimsel ve popüler ilgide çarpıcı bir artış olmuştur. Hayvanın bağırsağında farklı nişlerde yaşayan bakteri, virüs, mantar ve arkelerden oluşan mikrobiyota, sadece memeli türlerini değil, aynı zamanda kümes hayvanları gibi hayvancılığı da etkileyen enflamatuar, bulaşıcı ve metabolik hastalıkların düzenlenmesinde doğrudan veya dolaylı olarak rol oynar1. Bağırsak mikrobiyotasının sağlık ve hastalığa katkısını daha iyi incelemek için çeşitli hayvan modelleri geliştirilmiştir. Örneğin, mikropsuz ve gnotobiyotik hayvanlar, sırasıyla mikropların veya bilinen bir mikrobiyotanın tamamen yokluğunun, enfeksiyonların fizyopatolojisi üzerinde incelenmesine izin verir 2,3. Bununla birlikte, bu hayvanları üretmek ve sürdürmek, özel teknikler ve tesisler gerektirir ve onları korumak için gereken maliyetler, emek ve beceriler birçok araştırmacıya erişimlerini sınırlar. Gerçekten de, mikropsuz hayvanlar, bakteri yetiştirme yöntemleri, mikroskopi, seroloji, brüt morfoloji ve dizileme tabanlı tespit tekniklerinin bir kombinasyonu kullanılarak olası kontaminasyon için düzenli olarak izlenmelidir. Benzer prosedürler, hayvanların genellikle daha büyük olduğu ve üreme ve bakımları için daha büyük tesisler gerektirdiği hayvancılık gibi diğer türler için de geçerlidir, bu da mikrobiyota üzerine araştırmaları bir dereceye kadar engelleyebilir.
Kümes hayvanları, daha spesifik olarak tavuklar, yılda 40 milyar kuşu aşabilen bir sürü nüfusu ile dünya çapında hayvancılık üretiminin temel taşıdır. Dünyadaki en önemli hayvansal protein kaynağıdır (http://www.fao.org/poultry-production-products/en/). Dahası, tavukların yetiştirilmesi veya tüketilmesiyle ilgili kültürel veya dini tabular yoktur. Kanatlı hayvan bağırsak mikrobiyotası, diğer birçok besinsel, fizyolojik veya patolojik sürecin yanı sıra hayvanın büyümesinde, yem dönüşüm oranında, bağışıklığında, patojen direncinde önemli rol oynar4. Bu nedenle, mikrobiyota ve ev sahibi4 arasındaki diyaloğun altını çizmek için mikropsuz tavukların nesli vazgeçilmezdir. Mikrobiyal topluluklar tavuk yumurta kanalı5'te yaşıyor olsa bile, sağlıklı bir tavuk tarafından taze olarak serilmiş bir yumurtanın içeriği çoğunlukla mikroorganizmalardan arındırılmıştır, yumurta kabuğu ve mikroorganizma istilasını önlemek için mekanik bariyerlere sahip zarlar4. Ek olarak, civcivler, memelilerin aksine, steril koşullar altında ebeveyn yetiştiriciliği olmadan mikropsuz hayvanların üretilmesine izin veren akrabalarının yokluğunda kolayca yetiştirilir.
"Çiftlik, Model ve Vahşi Hayvanların Enfeksiyonu" deneysel tesisi (PFIE, UE-1277, Centre INRAE Val de Loire, Nouzilly, Fransa, https://doi-org.remotexs.ntu.edu.sg/10.15454/1.5572352821559333e12), Fransız Ulusal Altyapı Ağı EMERG'IN'in (https://www.emergin.fr/) bir parçasıdır. PFIE, 40 yıldan fazla bir süredir çeşitli deneysel çalışmalar yapmak için mikropsuz tavukların üretiminde ustalaşmıştır 7,8,9,10,11. Bu hayvanlar, 1970'lerden beri kapalı ıslahta yetiştirilen beyaz bir bacak boynuzu döşeme hattından spesifik patojensiz (SPF) yumurtalardan üretilmiştir. Esas olarak mikrobiyolojik çalışmalar için kullanılan 7,8,9 mikropsuz kuşlar, bağırsak mikrobiyotasının davranışa katkısı 13, besin kullanımı 14, bağışıklık gelişimi15 ve endokrin aktivite gibi sorularla ilginin yeniden canlandığını yaşamaktadır. Mikropsuz piliç hatları16 kullanılarak bazı çalışmalar yayınlanmış olsa bile, bu çalışmalar deneysel katman çizgileri kullanan çalışmalara kıyasla yeterince temsil edilmemektedir. Mikrobiyota ile kümes hayvanı sağlığı ve refahındaki ev sahibi arasındaki çapraz konuşmaya yönelik bilimsel soruların evrimi, tarihsel protokolümüzü, dünyanın en çok kullanılan piliç tavuğu hattı olan Ross PM3 hattının mikropsuz piliçlerini üretmek için uyarlamamıza yol açtı.

<table><tbody><tr><td>2 mL sterile plastic pipettes</td><td>Starsted</td><td>86.1252.001</td><td></td></tr><tr><td>50 mL tubes</td><td>Falcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BHI agar plates</td><td>Thermo fisher diagnostic</td><td>PO1198A</td><td></td></tr><tr><td>Brain Heart Infusion broth</td><td>Thermo fisher diagnostic</td><td>CM1135</td><td></td></tr><tr><td>Glass tubes with 9 mL BHI broth</td><td></td><td></td><td>home made and sterilized by autoclaving</td></tr><tr><td>Glass tubes with 9 mL thioglycolate broth with resazurin</td><td></td><td></td><td>home made and sterilized by autoclaving</td></tr><tr><td>Hatching incubator</td><td>Fieme</td><td>MG 576</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Memmert</td><td></td><td>for bacteriological culture, 37 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Irradiated feed</td><td>Safe</td><td>U8983G10R</td><td>40 kG irradiated</td></tr><tr><td>Isolators</td><td></td><td></td><td>home made. 1 m&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt; rigid isolator under positive pressure</td></tr><tr><td>Microbiological safety cabinet</td><td>thermon electron corporation</td><td></td><td>model: Hera Safe</td></tr><tr><td>Microscope Visiscope series 300</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette aid</td><td>Drummond</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plastic pipettes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterile sealed boxes</td><td>Tuperware</td><td></td><td>diameter</td></tr><tr><td>Sterilized glass tube</td><td></td><td></td><td>&quot;sovirel&quot;</td></tr><tr><td>Thioglycolate Broth with Resazurin</td><td>Merck</td><td>90404-500G</td><td></td></tr><tr><td>Water bath</td><td>Fisher scientific</td><td></td><td>model: polystat 36, used to incubate 10 min at 100 &amp;deg;C the glass tubes with 9 mL thioglycolate broth with resazurin in order to regenerate the medium</td></tr></tbody></table>

production of germ-free fast-growing broilers from a commercial line for microbiota studies

Bağırsak mikrobiyotasının konakçı fizyolojisine ve immün yeterliliğine katkısı üzerine yapılan çalışmalar, altın standart olarak kabul edilen mikropsuz hayvan modellerinin mevcudiyeti ile kolaylaştırılmaktadır. Yuvalama kuşları, mikropsuz hayvanların üretimi için ideal modellerdir, çünkü akrabalarını steril koşullar altında yetiştirmeye gerek yoktur. Mikropsuz tavuklar esas olarak, ticari tavuk hatlarını zayıf bir şekilde temsil eden spesifik patojensiz (SPF) deney hatlarından üretilir. Burada önerilen yöntem, kanatlı hayvan endüstrisi tarafından yaygın olarak kullanılan hızlı büyüyen piliç hattı Ross PM3'ten mikropsuz tavukların üretilmesine izin verdi. Bir piliç yetiştiricisi çiftliğine döşendikten sonra yumurtalar hızla toplandı. Toplamadan steril bir yumurtadan çıkma izolatörüne girmeye kadar sıkı bir dekontaminasyon işlemine tabi tutuldular. Civcivler yumurtadan çıkmış ve sterilitelerini kontrol etmek için gerekli olan süre boyunca bu steril izolatörlerde tutulmuştur. Başlangıçta deneysel bir SPF beyaz bacak boynuzu hattı için geliştirilen mevcut protokol sadece Ross PM3 piliç hattına değil, aynı zamanda bıldırcınlara da uyarlanmıştır. Bu nedenle, diğer kanatlı hayvan türlerine ve ekonomik, biyolojik veya ekolojik açıdan yuva yapan kuşlara karşı sağlam ve kolayca uyarlanabilir bir prosedürü temsil eder.

İki farklı Fransız çiftliğinden gelen Ross PM3 yumurtaları ile altı adet mikropsuz civciv üretimi gerçekleştirilmiştir (Tablo 1). Toplam 853 yumurta toplandı ve iki dekontaminasyon adımından ve 19 günlük inkübasyondan sonra% 86.40'ı yaşayabilirdi. Bu canlı yumurtaların 490'ı üçüncü bir dekontaminasyon adımına tabi tutuldu ve ortalama% 79.80'lik bir kuluçka oranı için çeşitli kuluçka izolatörlerine sokuldu. Bu, toplanan ilk yumurta sayısına kıyasla% 68.94'lük bir kuluçka oranını temsil eder.
Bununla birlikte, kuluçka sonuçları, gerçekleştirilen seriye göre önemli ölçüde değişmektedir: toplanan yumurta sayısına kıyasla canlı civcivlerin% 41.67 ila% 88.16'sı. Bu varyasyonlar, aynı deney sırasında farklı kapaklar arasında da gözlendi. Tüm izolatörler tüm koşular için kullanılmadığından, izolatöre bağımlı bir etkiyi dışlamak zordur. Bununla birlikte, bu parti etkisi, yaşlı tavuklardan gelen yumurtaların daha az canlı olduğu yumurtlayan tavukların yaşı ile doğrudan ilişkiliydi (Şekil 1).
Altı çalışma, dört farklı kuluçkalık izolatör kullanılarak gerçekleştirildi. Bakteriyolojik kontrolden sonra, 16 izolatörün 14'ünden gelen hayvanların mikropsuz olduğu doğrulandı. Bu da %87,5'lik bir başarı oranına tekabül etmektedir. Kalan iki izolatör, tek bir çevresel ve patojenik olmayan bakteri tarafından kontamine edildi.
Bilimsel deneyler için kullanılan tüm hayvanlar, çalışmaların sonuna kadar, yumurtadan çıktıktan sonra en az üç hafta boyunca mikropsuz kaldı.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61148/61148fig1v2.jpg"> Resim 1: Tavuk yaşının kuluçka hızına etkisi Mevcut rakam, yumurtlama haftalarıyla ifade edilen yumurtlayan tavuk sürüsünün yaşına göre gözlemlenen kuluçka oranlarını vurgulamaktadır. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61148/61148fig1v2large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:font-size="5px" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Toplanan yumurtalar</td>
			<td>D19 canlı yumurta</td>
			<td>D19 canlı yumurta/toplanan yumurtalar</td>
			<td>İzolatöre aktarılan yumurtalar 1</td>
			<td>İzolatöre aktarılan yumurtalar 2</td>
			<td>İzolatöre aktarılan yumurtalar 3</td>
			<td>İzolatöre aktarılan yumurtalar 4</td>
			<td>transfer edilen yumurtaların toplamı</td>
			<td>İzolatöre yumurtadan çıkan canlı civcivler 1</td>
			<td>İzolatöre yumurtadan çıkan canlı civcivler 2</td>
			<td>İzolatöre yumurtadan çıkan canlı civcivler 3</td>
			<td>İzolatöre yumurtadan çıkan canlı civcivler 4</td>
			<td>canlı yumurtadan çıkmış civcivlerin toplamı</td>
			<td>canlı yumurtadan çıkan/transfer edilen yumurta izolatör1</td>
			<td>canlı yumurtadan çıkan/transfer edilen yumurta izolatör2</td>
			<td>canlı yumurtadan çıkan/transfer edilen yumurta izolatör3</td>
			<td>canlı yumurtadan çıkan/transfer edilen yumurta izolatör4</td>
			<td c="">küresel olarak canlı yumurtadan çıkan/transfer edilen yumurtalar</td>
		</tr>
<tr>
<td>Koşu 1</td>
			<td>101</td>
			<td>93</td>
			<td>92.08%</td>
			<td>23</td>
			<td>24</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>47</td>
			<td>22</td>
			<td>23</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>45</td>
			<td>95.65%</td>
			<td>95.83%</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>95.74%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Koşu 2</td>
			<td>130</td>
			<td>117</td>
			<td>90.00%</td>
			<td>25</td>
			<td>25</td>
			<td>25</td>
			<td></td>
			<td>75</td>
			<td>20</td>
			<td>24</td>
			<td>18</td>
			<td>-</td>
			<td>62</td>
			<td>80.00%</td>
			<td>96.00%</td>
			<td>72.00%</td>
			<td></td>
			<td>82.67%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Koşu 3</td>
			<td>132</td>
			<td>97</td>
			<td>73.48%</td>
			<td>26</td>
			<td>-</td>
			<td>26</td>
			<td>45</td>
			<td>97</td>
			<td>14</td>
			<td>-</td>
			<td>13</td>
			<td>28*</td>
			<td>27</td>
			<td>53.85%</td>
			<td></td>
			<td>50.00%</td>
			<td>62.22%</td>
			<td>56.70%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Koşu 4</td>
			<td>130</td>
			<td>116</td>
			<td>89.23%</td>
			<td>36</td>
			<td>35</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>71</td>
			<td>33</td>
			<td>34</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>67</td>
			<td>91.67%</td>
			<td>97.14%</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>94.37%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Koş 5</td>
			<td>180</td>
			<td>148</td>
			<td>82.22%</td>
			<td>30</td>
			<td>30</td>
			<td>30</td>
			<td>30</td>
			<td>120</td>
			<td>26*</td>
			<td>25</td>
			<td>17</td>
			<td>24</td>
			<td>66</td>
			<td>86.67%</td>
			<td>83.33%</td>
			<td>56.67%</td>
			<td>80.00%</td>
			<td>76.67%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Koşu 6</td>
			<td>180</td>
			<td>166</td>
			<td>92.22%</td>
			<td>-</td>
			<td>40</td>
			<td>40</td>
			<td>-</td>
			<td>80</td>
			<td>-</td>
			<td>35</td>
			<td>35</td>
			<td>-</td>
			<td>70</td>
			<td>86.67%</td>
			<td>87.50%</td>
			<td>87.50%</td>
			<td></td>
			<td>87.50%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Toplam</td>
			<td>853</td>
			<td>737</td>
			<td>86.40%</td>
			<td>140</td>
			<td>154</td>
			<td>121</td>
			<td>75</td>
			<td>490</td>
			<td>89</td>
			<td>141</td>
			<td>83</td>
			<td>24</td>
			<td>337</td>
			<td>82.14%</td>
			<td>91.56%</td>
			<td>68.60%</td>
			<td>69.33%</td>
			<td>79.80%</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: Farklı kuluçka deneylerinin teknik sonuçları. Bu tablo, gerçekleştirilen 6 seri mikropsuz kuluçkalamanın sonuçlarını vurgulamaktadır: toplanan yumurta sayısı, embriyonun 19 günde yaşayabilirliği ve çeşitli izolatörlerde canlı yumurtadan çıkmış civcivler.

Watch this Scientific Journal Video about Production of Germ-Free Fast-Growing Broilers from a Commercial Line for Microbiota Studies at JoVE.com

Production of Germ-Free Fast-Growing Broilers from a Commercial Line for Microbiota Studies

Burada, ticari bir piliç hattı olan Ross PM3'ün yumurtalarından mikropsuz civcivlerin üretilmesi için bir yöntem açıklıyoruz. Bu yöntem, diğer kanatlı hayvan türlerinden mikropsuz hayvanların üretimi için uyarlanabilir.

Mikrobiyota Çalışmaları için Ticari Bir Hattan Mikropsuz Hızlı Büyüyen Piliçlerin Üretimi

Studies of the gut microbiota contribution to the host physiology and immunocompetence are facilitated by the availability of germ-free animal models, ...

production-germ-free-fast-growing-broilers-from-commercial-line-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

3.0K Görüntüleme.  INRAE, PFIE, UE-1277. Burada, ticari bir piliç hattı olan Ross PM3'ün yumurtalarından mikropsuz civcivlerin üretilmesi için bir yöntem açıklıyoruz. Bu yöntem, diğer kanatlı hayvan türlerinden mikropsuz hayvanların üretimi için uyarlanabilir.

Video: Production of Germ-Free Fast-Growing Broilers from a Commercial Line for Microbiota Studies

Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to successful identification of genes or loci underlying various traits in malaria parasites of rodents1-3 and humans4-6. The malaria parasite Plasmodium yoelii is one of many malaria species isolated from wild African rodents and has been adapted to grow in laboratories. This species reproduces many of the biologic characteristics of the human malaria parasites; genetic markers such as microsatellite and amplified fragment length polymorphism (AFLP) markers have also been developed for the parasite7-9. Thus, genetic studies in rodent malaria parasites can be performed to complement research on Plasmodium falciparum. Here, we demonstrate the techniques for producing a genetic cross in P. yoelii that were first pioneered by Drs. David Walliker, Richard Carter, and colleagues at the University of Edinburgh10.

Genetic crosses in P. yoelii and other rodent malaria parasites are conducted by infecting mice Mus musculus with an inoculum containing gametocytes of two genetically distinct clones that differ in phenotypes of interest and by allowing mosquitoes to feed on the infected mice 4 days after infection. The presence of male and female gametocytes in the mouse blood is microscopically confirmed before feeding. Within 48 hrs after feeding, in the midgut of the mosquito, the haploid gametocytes differentiate into male and female gametes, fertilize, and form a diploid zygote (Fig. 1). During development of a zygote into an ookinete, meiosis appears to occur11. If the zygote is derived through cross-fertilization between gametes of the two genetically distinct parasites, genetic exchanges (chromosomal reassortment and cross-overs between the non-sister chromatids of a pair of homologous chromosomes; Fig. 2) may occur, resulting in recombination of genetic material at homologous loci. Each zygote undergoes two successive nuclear divisions, leading to four haploid nuclei. An ookinete further develops into an oocyst. Once the oocyst matures, thousands of sporozoites (the progeny of the cross) are formed and released into mosquito hemoceal. Sporozoites are harvested from the salivary glands and injected into a new murine host, where pre-erythrocytic and erythrocytic stage development takes place. Erythrocytic forms are cloned and classified with regard to the characters distinguishing the parental lines prior to genetic linkage mapping. Control infections of individual parental clones are performed in the same way as the production of a genetic cross.

Genetic crosses of rodent malaria parasites are performed by feeding two genetically distinct parasites to mosquitoes. Recombinant progeny are cloned from mouse blood after allowing mosquitoes to bite infected mice. This video shows how to produce genetic crosses of Plasmodium yoelii and is applicable to other rodent malaria parasites.

Kemirgen Sıtma Parazitler Genetik Haç üretimi için protokol

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is a model for understanding microbial interactions with animal hosts, facilitated by approaches to rear large sample sizes of Drosophila under microorganism-free (axenic) conditions, or with defined microbial communities (gnotobiotic). This work outlines a method for collection of Drosophila embryos, hypochlorite dechorionation and sterilization, and transfer to sterile diet. Sterilized embryos are transferred to sterile diet in 50 ml centrifuge tubes, and developing larvae and adults remain free of any exogenous microbes until the vials are opened. Alternatively, flies with a defined microbiota can be reared by inoculating sterile diet and embryos with microbial species of interest. We describe the introduction of 4 bacterial species to establish a representative gnotobiotic microbiota in Drosophila. Finally, we describe approaches for confirming bacterial community composition, including testing if axenic Drosophila remain bacteria-free into adulthood.

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

A method for rearing Drosophila melanogaster under axenic and gnotobiotic conditions is presented. Fly embryos are dechorionated in sodium hypochlorite, transferred aseptically to sterile diet, and reared in closed containers. Inoculating diet and embryos with bacteria leads to gnotobiotic associations, and bacterial presence is confirmed by plating whole-body Drosophila homogenates.

Meyve Fly Yetiştirme<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Aksenik ve gnotobiyotik Koşullarında

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is ...

Gelişim Biyolojisi

A Gnotobiotic System for Studying Microbiome Assembly in the Phyllosphere and in Vegetable Fermentation

The phyllosphere, the above ground portion of the plant that can be colonized by microbes, is a useful model system to identify processes of microbial community assembly. This protocol outlines a system for studying microbial community dynamics in the phyllosphere of Napa cabbage plants. It describes how to grow germ-free plants in test tubes with a calcined clay and nutrient broth substrate. Inoculation of germ-free plants with specific microbial cultures provides opportunities to measure microbial growth and community dynamics in the phyllosphere. Through the use of sterile vegetable extract produced from cabbages shifts in microbial communities that occur during fermentation can also be assessed. This system is relatively simple and inexpensive to set up in the lab and can be used to address key ecological questions in microbial community assembly. It also provides opportunities to understand how phyllosphere community composition can impact the microbial diversity and quality of vegetable fermentations. This approach for developing gnotobiotic cabbage phyllosphere communities could be applied to other wild and agricultural plant species.

A method of growing germ-free Napa cabbages has been developed which enables researchers to evaluate how single microbial species or multispecies microbial communities interact on cabbage leaf surfaces. A sterile vegetable extract is also presented which can be used to measure shifts in community composition during vegetable fermentation.

Fillosferde ve Bitkisel Fermantasyonda Mikrobiyom Montajı Nın İncelenmesi için Gnotobiyotik Sistem

The phyllosphere, the above ground portion of the plant that can be colonized by microbes, is a useful model system to identify processes of microbial ...

Çevre

Isolation of Preadipocytes from Broiler Chick Embryos

Primary preadipocytes are a valuable experimental system for understanding the molecular pathways that control adipocyte differentiation and metabolism. Chicken embryos provide the opportunity to isolate preadipocytes from the earliest stage of adipose development. This primary cell can be used to identify factors influencing preadipocyte proliferation and adipogenic differentiation, making them a valuable model for studies related to childhood obesity and control of excess fat deposition in poultry. The rapid growth of postnatal adipose tissue effectively wastes feed by allocating it away from muscle growth in broiler chickens. Therefore, methods to understand the earliest stages of adipose tissue development may provide clues to regulate this tendency and identify ways to limit adipose expansion early in life. The present study was designed to develop an efficient method for isolation, primary culture, and adipogenic differentiation of preadipocytes isolated from developing adipose tissue of commercial broiler (meat-type) chick embryos. The procedure has been optimized to yield cells with high viability (~98%) and increased capacity to differentiate into mature adipocytes. This simple method of embryonic preadipocyte isolation, culture, and differentiation supports functional analyses of fat growth and development in early life.

The present protocol describes a simple method for isolating preadipocytes from adipose tissue in broiler embryos. This method enables isolation with high yield, primary culture, and adipogenic differentiation of preadipocytes. Oil Red O staining and lipid/DNA stain measured the adipogenic ability of isolated cells induced with differentiation media.

Preadipositlerin Broiler Civciv Embriyolarından İzolasyonu

Primary preadipocytes are a valuable experimental system for understanding the molecular pathways that control adipocyte differentiation and metabolism. ...

GF Zebra Balığı Modellerinin Optimize Edilmesi: Üretim, Bakım ve Mikrobiyal Çalışmalar

Generation, Maintenance, and Identification of Germ-Free Zebrafish Models from Larvae to Juvenile Stages

Zebrafish serve as valuable models for research on growth, immunity, and gut microbiota due to their genomic similarities with mammals, transparent embryos developed in a relatively clean chorion environment, and extremely rapid development of larvae compared to rodent models. Germ-free (GF) zebrafish (Danio rerio) are crucial for evaluating pollutant toxicity and establishing human-like disease models related to microbial functions. In comparison to conventionally raised (CR) models (fish in common husbandry), GF zebrafish allow for more accurate manipulation of the host microbiota, aiding in determining the causal relationship between microorganisms and hosts. Consequently, they play a critical role in advancing our understanding of these relationships. However, GF zebrafish models are typically generated and researched during the early life stages (from embryos to larvae) due to limitations in immune function and nutrient absorption. This study optimizes the generation, maintenance, and identification of early GF zebrafish models without feeding and with long-term feeding using GF food (such as Artemia sp., brine shrimp). Throughout the process, daily sampling and culture were performed and identified through multiple detections, including plates and 16S rRNA sequencing. The aseptic rate, survival, and developmental indexes of GF zebrafish were recorded to ensure the quality and quantity of the generated models. Importantly, this study provides details on bacterial isolation and infection techniques for GF fish, enabling the efficient creation of GF fish models from larvae to juvenile stages with GF food support. By applying these procedures in biomedical research, scientists can better understand the relationships between intestinal bacterial functions and host health.

Yazar Spotlight: Mikrobiyota-Konak İlişkisi Çalışmaları için Mikropsuz Zebra Balığı Oluşturma

This protocol outlines the primary steps for obtaining germ-free (GF) fish embryos and maintaining them from larvae until the juvenile stage, including sampling and detecting their sterile status. The use of GF models with infection is important for understanding the role of microbes in host health.

Larvalardan Gençlik Dönemlerine Kadar Mikropsuz Zebra Balığı Modellerinin Üretimi, Bakımı ve Tanımlanması

Zebrafish serve as valuable models for research on growth, immunity, and gut microbiota due to their genomic similarities with mammals, transparent ...

Preparation and Maintenance of Bioexclusion IsoPositive Cage Experiment for Human Fecal Transplantation into Germ-Free Mice

Germ-free mice are an important investigation tool for understanding the contribution of microorganisms in host health and disease, enabling assessment of the specific role of individuals, defined or complex groups of microorganisms in host response. Traditionally bred and reared in flexible-film or semi-rigid isolators, germ-free mouse husbandry and experimental manipulation are costly and require numerous trained staff and a large space footprint in animal housing facilities. The IsoPositive caging system allows for experimental manipulation of germ-free mice in individual, hermetically-sealed, positive-pressure isolator cages (isocages), reducing cost and enabling greater flexibility in experimental manipulations. 
Here, a protocol is described for transferring germ-free mice from breeding isolators to isocages and subsequent fecal transfer from human donor stool into mice to create stable long-term gut "humanized" mice for future studies. The materials and preparation needed for the utilization of the isocage system are described, including the use of chlorine-dioxide sterilant chemical sterilant to clean cages, supplies, equipment, and personal protective equipment. The methods for confirming the germ-free status of transferred mice and how to determine contamination in the caging system are discussed. The procedure for husbandry, including bedding, food, and water supply, is further discussed. The protocol for human fecal slurry preparation and gavage into germ-free mice to create gut "humanized" mice, along with stool collection to monitor the microbial community composition of these mice, are described. An experiment illustrates that two weeks post-human fecal transplant allows for stable colonization of donor microbiota in the murine hosts, enabling subsequent experimental usage. Furthermore, the collection of humanized mouse feces in viability preservation media, enabling use in further functional experiments, is described. Overall, these methods allow for the safe and effective establishment of humanized mouse communities in experimental gnotobiotic cages for further manipulation.

This protocol describes the best practices for germ-free mouse transfer to and housing in experimental single-cage isolators (isocages) while maintaining sterile conditions. Methods for fecal transplant into germ-free mice and the collection of viable bacteria from these gut "humanized" mice for further applications are discussed.

Mikropsuz Farelere İnsan Dışkı Nakli için Biyodışlama İzoPozitif Kafes Deneyinin Hazırlanması ve Sürdürülmesi

Germ-free mice are an important investigation tool for understanding the contribution of microorganisms in host health and disease, enabling assessment of ...

Establishment and Maintenance of Gnotobiotic American Cockroaches (Periplaneta americana)

Gnotobiotic animals are a powerful tool for the study of controls on microbiome structure and function. Presented here is a protocol for the establishment and maintenance of gnotobiotic American cockroaches (Periplaneta americana). This approach includes built-in sterility checks for ongoing quality control. Gnotobiotic insects are defined here as cockroaches that still contain their vertically transmitted endosymbiont (Blattabacterium) but lack other microbes that normally reside on their surface and in their digestive tract. For this protocol, egg cases (oothecae) are removed from a (nonsterile) stock colony and surface sterilized. Once collected and sterilized, the oothecae are incubated at 30 &#176;C for approximately 4&#8722;6 weeks on brain-heart infusion (BHI) agar until they hatch or are removed due to contamination. Hatched nymphs are transferred to an Erlenmeyer flask containing a BHI floor, sterile water, and sterile rat food. To ensure that the nymphs are not housing microbes that are unable to grow on BHI in the given conditions, an additional quality control measure uses restriction fragment-length polymorphism (RFLP) to test for nonendosymbiotic microbes. Gnotobiotic nymphs generated using this approach can be inoculated with simple or complex microbial communities and used as a tool in gut microbiome studies.

Establishment and Maintenance of Gnotobiotic American Cockroaches Periplaneta americana

This protocol is used in establishing and maintaining gnotobiotic American cockroaches (Periplaneta americana) by surface sterilizing the egg cases (oothecae) prior to hatching. These gnotobiotic insects contain their vertically transmitted Blattabacterium endosymbionts but have axenic guts.

Gnotobiyotik Amerikan Hamamböceklerinin Kurulması ve Bakımı (Periplaneta americana)

Gnotobiotic animals are a powerful tool for the study of controls on microbiome structure and function. Presented here is a protocol for the establishment ...

Biyoloji

Preparing and Rearing Axenic Insects with Tissue Cultured Seedlings for Host-Gut Microbiota Interaction Studies of the Leaf Beetle

Insect guts are colonized by diverse bacteria that can profoundly impact the host&#39;s physiological traits. Introducing a particular bacterial strain into an axenic insect is a powerful method to verify gut microbial function and elucidate the mechanisms underlying gut microbe-host interactions. Administering antibiotics or sterilizing egg surfaces are two commonly used methods to remove gut bacteria from insects. However, in addition to the potential adverse effects of antibiotics on insects, previous studies indicated that feeding antibiotics could not eliminate gut bacteria. Thus, germ-free artificial diets are generally employed to maintain axenic insects, which is a tedious and labor-intensive process that cannot fully resemble nutritional components in natural food. Described here is an efficient and simple protocol to prepare and maintain axenic larvae of a leaf beetle&#160;(Plagiodera versicolora). Specifically, surfaces of the beetle eggs were sterilized, following which germ-free poplar leaves were used to rear axenic larvae. The axenic status of the insects was further confirmed via culture-dependent and culture-independent assays. Collectively, by combining egg disinfection and germ-free cultivation, an efficient and convenient method was developed to obtain axenic P. versicolora, providing a readily transferable tool for other leaf-eating insects.

To obtain an axenic insect, its egg surface is sterilized, and the hatched larva is subsequently reared using axenic leaves. This method provides an efficient way for axenic insect preparation without administering antibiotics or developing an artificial diet, which can also be applied to other leaf-eating insects.

Yaprak Böceğinin Host-Gut Mikrobiyota Etkileşim Çalışmaları için Doku Kültürlü Fidanlarla Aksenik Böceklerin Hazırlanması ve Yetiştirilmesi

Insect guts are colonized by diverse bacteria that can profoundly impact the host&#39;s physiological traits. Introducing a particular bacterial strain ...

Mikrobiyota Çalışmaları için Ticari Bir Hattan Mikropsuz Hızlı Büyüyen Piliçlerin Üretimi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Kemirgen Sıtma Parazitler Genetik Haç üretimi için protokol

Meyve Fly Yetiştirme

Fillosferde ve Bitkisel Fermantasyonda Mikrobiyom Montajı Nın İncelenmesi için Gnotobiyotik Sistem

Preadipositlerin Broiler Civciv Embriyolarından İzolasyonu

Larvalardan Gençlik Dönemlerine Kadar Mikropsuz Zebra Balığı Modellerinin Üretimi, Bakımı ve Tanımlanması

Larvalardan Gençlik Dönemlerine Kadar Mikropsuz Zebra Balığı Modellerinin Üretimi, Bakımı ve Tanımlanması

Larvalardan Gençlik Dönemlerine Kadar Mikropsuz Zebra Balığı Modellerinin Üretimi, Bakımı ve Tanımlanması

Mikropsuz Farelere İnsan Dışkı Nakli için Biyodışlama İzoPozitif Kafes Deneyinin Hazırlanması ve Sürdürülmesi

Gnotobiyotik Amerikan Hamamböceklerinin Kurulması ve Bakımı (Periplaneta americana)

Yaprak Böceğinin Host-Gut Mikrobiyota Etkileşim Çalışmaları için Doku Kültürlü Fidanlarla Aksenik Böceklerin Hazırlanması ve Yetiştirilmesi