Kemogenomik ve Biyolojik Tarama Platformu'ndan Fabrice Agou ve Alix Boucharlat'a, Institut Pasteur Paris'teki Teknolojik Kaynaklar ve Araştırma Merkezi'ne (C2RT) protokol hakkında yararlı öneriler için, BGPB Birimi'nin tüm üyelerine destek ve bilimsel tartışmalar için ve Simon Legood'a makalenin eleştirel okuması için teşekkür ederiz. Çalışma, Carnot Bulaşıcı Hastalıklar Enstitüsü ve Carnot Mikropları ve Sağlığı Enstitüsü'nün Küresel Bakım Girişimleri (15 CARN 0017-01 ve 16 CARN 0023-01) tarafından finanse edilmiştir.

1. Enzim ve substrat hazırlama
<ol><li>Enzimin saflaştırılması
	<ol><li>Lnt enzimini daha önce tarif edildiği gibi deterjanda çözünür membranlardan üretin ve saflaştırın 4,8. Kısaca, Lnt-strep geninin ekspresyonunu indükleyin, Lnt'yi bir C-terminal Strep etiketi ile kodlayın, OD600'de 0.6'da 16 saat boyunca 37 ° C'de susuz tetrasiklin (200 ng / mL) ile.</li>
		<li>Hücreleri 10 dakika boyunca 4.000 x g'de santrifüjleme ile toplayın ve süpernatanı atın.</li>
		<li>Hücre peletini tampon WA'da (20 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA) mL başına 100 OD600 birime kadar yeniden askıya alın.</li>
		<li>Hücreleri, 10.000 psi'de bir Fransız basınçlı hücre presinden iki geçitle kırın.</li>
		<li>Kırılmamış hücreleri ve kalıntıları 20 dakika boyunca 13.000 x g'de santrifüjleme ile temizleyin. Süpernatantı saklayın ve peleti atın.</li>
		<li>Süpernatantı 60 dakika boyunca 120.000 x g'de santrifüj yapın ve membran veziküllerini (yarı saydam kahverengi renkli pelet) toplayın. Süper natantı atın.</li>
		<li>Membran peletinden integral membran proteinlerini, oda sıcaklığında (RT) 30 dakika boyunca tampon WA'da% 1 (w/v) n-Dodesil β-D-maltosid (DDM) ile çözündürün. Çözünmeyen malzemeyi 120.000 x g'de 30 dakika boyunca santrifüj yapın ve çıkarın. Saflaştırma için süpernatant fraksiyonu kullanın.</li>
		<li>Lnt-strep'i Nozeret ve ark.8 tarafından açıklandığı gibi bir afinite kromatografisi sütununda (bkz. Malzeme Tablosu) ve bir S400 jel filtrasyon sütununda (bkz.</li>
		<li>Saflaştırılmış enzimi, -80 °C'de% 0.05 DDM ve% 10 gliserol içeren tampon WA'da saklayın. NOT: Enzim 5 yıldan fazla bir süredir stabildir.</li>
	</ol></li>
	<li>Alkin-fosfolipid ve biyotinile Fibroblast Uyarıcı Ligand (FSL-1-biotin) substratlarının hazırlanması
	<ol><li>Aliquot 100 μL özel sentezlenmiş alkin-POPE (1-hekzade-15-ynoil-2-oleoil-sn-glisero-3-fosfoetanolamin, bakınız Malzeme Tablosu) kloroformda 1.5 mL tüplere çözünür.</li>
		<li>Tüpleri bir şırınga ile delin ve kloroformu RT'de 2 saat boyunca bir hız boşluğunda buharlaştırın. Kuru fosfolipit örneklerini -20 °C'de saklayın.</li>
		<li>Kullanmadan önce alkin-PAPE'yi 500 μM'de% 0.1 Triton X-100'de çözün. Gerekirse alkin-POPE'yi çözündürmek için RT'de ultrasonik su banyosuna 3 dakikalık bir sonikasyon adımı ekleyin.</li>
		<li>FSL-1-biyotin'i suda 445 μM'de yeniden askıya alın. NOT: Her iki çözelti de -20 °C'de en az 2 ay saklanabilir.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Tüp testi
NOT: 1. Günde, Lnt reaksiyonunu 1,5 mL tüplerde ayarlayın (adım 2.1) ve 96 kuyu plakasını streptavidin ile kaplayın (adım 2.2).
<ol><li>Reaktif karışımının hazırlanması ve enzimatik reaksiyon
	<ol><li>Standart bir Lnt testi için, 1,5 mL tüplerde 18 μL'lik son hacimde alkin-POPE (500 μM stoktan son 50 μM) ve FSL-1-biyotin (445 μM stoktan 50 μM nihai konsantrasyon) Lnt reaksiyon tamponunda (50 mM Tris-HCl pH 7.2, 150 mM NaCl, %1 BSA içeren %0.1 Triton X-100) karıştırın. Tüm koşulları üçlü olarak gerçekleştirin.</li>
		<li>Substrat karışımını (adım 2.1.1'de hazırlanan) ultrasonik bir su banyosunda 3 dakika boyunca sonikleştirin ve Lnt enziminin eklenmesinden önce 5 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin (adım 2.1.3). NOT: MTSES (sodyum (2-sülfonatoetil)metanetiosülfonat), tiol-spesifik bir reaktif, Lnt8'i inhibe eder. Negatif kontrol numuneleri olarak kullanılmak üzere reaksiyon tüplerine (adım 2.1.1) 10 mM MTSES (% 100 DMSO'da 100 mM stok çözeltisi) ekleyin. Lnt reaksiyon tamponunun ses seviyesini toplam hacim 18 μL olacak şekilde ayarlayın.</li>
		<li>Aktif (1 ng/μL, 17,2 nM'ye karşılık gelir) veya inaktif Lnt (C387S) (%0,05 DDM içeren tampon WA'da 10 ng/μL'lik 2 μL) ekleyin ve yukarı ve aşağı pipetle indirerek substratlarla (adım 2.1.2) karıştırın.</li>
		<li>Isıtmalı kapaklı bir termomikserde 16 saat boyunca 37 ° C'de reaksiyonu inkübe edin.</li>
	</ol></li>
	<li>96 kuyu plakasının Streptavidin kaplaması
	<ol><li>H2O'da 2 mg / mL'de bir streptavidin stok çözeltisi hazırlayın. NOT: Bu çözelti -20 °C'de 6 aya kadar saklanabilir.</li>
		<li>Stok çözeltisinden, çalışma çözeltisi olarak suda 10 μg / mL streptavidin hazırlayın. 96 kuyucuk plakasının her bir kuyucuğuna 100 μL çözelti ekleyin. Kuyucukları havayla kurutmak için kapaksız olarak gece boyunca 37 °C'de inkübe ederek streptavidin'i plakaya bağlayın.</li>
	</ol></li>
</ol>NOT: 2. Günde, tıklama kimyası (adım 2.3) gerçekleştirin, Lnt reaksiyon karışımını streptavidin kaplı plakalara bağlayın (adım 2.4) ve floresanı tespit edin ve sonuçları analiz edin (adım 2.5).
<ol start="3"><li>Klik-kimya reaksiyonu
	<ol><li>Azido-FAM (DMSO'da 5 mM), TCEP (Tris (2-karboksiyetil) fosfin hidroklorür; suda hazırlanan 50 mM), TBTA (Tris [(1-benzil-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil]amin; tert-bütanolde 2 mM: DMSO (4: 1)) ve CuSO4∙5H2O (H2O'da taze hazırlanmış 50 mM) stok çözeltileri hazırlayın.</li>
		<li>Adım 2.1.4'te hazırlanan Lnt reaksiyon karışımını içeren 1,5 mL'lik tüplerde, reaktifleri aşağıdaki sırayla ekleyerek klik-kimyası gerçekleştirin: 0,2 μL stok Azido-FAM (nihai konsantrasyon 50 μM), 0,4 μL stok TCEP (nihai konsantrasyon 1 mM), 0,2 μL stok TBTA (nihai konsantrasyon 0,02 mM).</li>
		<li>Vorteks 5 s için çözüm. Daha sonra 0,4 μL stok CuSO4 (son konsantrasyon 1 mM) ekleyin. 5 s için tekrar vorteks. Örnekleri karanlıkta RT'de 1 saat boyunca inkübe edin.</li>
	</ol></li>
	<li>Lnt reaksiyon karışımının streptavidin kaplı plakalara bağlanması
	<ol><li>Streptavidin kaplı plakaların kuyucuklarını, 2.2.2 3x adımından bir gecede inkübasyondan sonra 200 μL PBS-T1 (% 0.05 Ara-20 içeren PBS) ile yıkayın. NOT: Streptavidin plakalar hemen kullanılabilir veya 4 °C'de kuru olarak saklanabilir.</li>
		<li>Klik-kimya karışımından 18 μL'yi adım 2.3.3'ten 96 kuyu streptavidin kaplı bir plakadaki bir kuyuya aktarın ve N-açil-FSL-1-biyotin-FAM ürününü streptavidin plakalarına bağlamak için 100 μL PBS-T1 ekleyin.</li>
		<li>Streptavidin bağlama ve floresan okuması için pozitif kontrol olarak biyotin-floresein (DMSO'daki 3.1 m'lik bir stoktan 0.26 μM) kullanın.</li>
		<li>RT'deki plakaları karanlıkta 1 saat boyunca bir termomikserde inkübe edin, 300 rpm'de sallayın.</li>
		<li>96 kuyucuk plakasının manuel yıkama adımlarını çok kanallı elektronik pipetle aşağıdaki gibi gerçekleştirin: 200 μL PBS-T2 ile altı yıkama (%1 Ara-20 içeren PBS), pipetle üç yıkama, 200 μL PBS ile üç yıkama, pipetle üç yıkama.</li>
	</ol></li>
	<li>Floresan algılama ve analizi
	<ol><li>200 μL PBS ekleyin ve floresanı bir floresan mikroplaka okuyucusuna 520 nm'de kaydedin. Sonuçları e-tablo yazılımına kaydedin. NOT: Biotin-floresein, streptavidin bağlama ve 520 nm'de floresan tespiti için pozitif bir kontrol olarak kullanılır. 0.26 μM biyotin-floresein ile 30.000-40.000 A.U.'nun tekrarlanabilir bir okuması beklenmektedir. Tüm numuneler, kontroller de dahil olmak üzere üçlü olarak analiz edilir.</li>
		<li>İstatistiksel bir yazılım kullanarak eşleşmemiş t-testini kullanarak her reaksiyon için standart sapmayı ve negatif kontroller ve pozitif numuneler için P-değerlerini hesaplayın.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Çok kuyulu plaka testi
NOT: 1. Günde, Lnt reaksiyonunu 384 kuyu plakasında (adım 3.1) ayarlayın ve 384 kuyu plakasını streptavidin ile kaplayın (adım 3.2).
<ol><li>Reaktif karışımının hazırlanması ve enzimatik reaksiyon NOT: Reaktiflerin ve enzimin miktarı, tüp testine kıyasla azaltılır ve Lnt reaksiyonu doğrudan 384 kuyu plakasında gerçekleştirilir. Bu, daha az malzeme kullanılmasına ve daha da otomatikleştirilebilecek adımların azaltılmasına izin verir.<ol><li>Substratları aşağıdaki gibi karıştırın: alkin-POPE (500 μM stoktan son konsantrasyon 50 μM) ve FSL-1-biyotin (500 μM stoktan son 50 μM) Lnt reaksiyon tamponunda (50 mM Tris-HCl pH 7.2, 150 mM NaCl,% 1 BSA içeren% 0.1 Triton X-100) 384 kuyu plakası formatında kuyu başına reaksiyon başına 13.5 μL hacimde. Tüm koşulları üçlü olarak gerçekleştirin. Gerçekleştirilecek reaksiyon sayısı için gereken toplam reaktif miktarını hesaplayın (yani, bir 384 kuyu plakası için 5.184 μL).</li>
		<li>Substrat karışımını ultrasonik bir su banyosunda 3 dakika boyunca sonikleştirin.</li>
		<li>384 kuyucuklu bir plakada kuyu başına substrat karışımının Aliquot 13.5 μL'si. NOT: Negatif kontrol olarak, kuyu başına 10 mM MTSES (%100 DMSO'da 625 mM stok çözeltisi) eklenebilir. 13,5 μL'lik bir nihai reaksiyon hacmine ulaşmak için Lnt tamponunun ses seviyesini (adım 3.1.1) ayarlayın.</li>
		<li>Lnt enziminin eklenmesinden önce 5 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin (adım 3.1.5).</li>
		<li>3.1.3. adımdan itibaren reaksiyon karışımını içeren her bir kuyucuğa Lnt reaksiyon tamponuna (50 mM Tris-HCl pH 7.2, 150 mM NaCl, %0.1 Triton X-100, %1 BSA) 0,5 ng/μL (8,6 nM'ye karşılık gelen) aktif Lnt enzimi veya inaktif varyant (C387S) (% 0,05 DDM içeren tampon WA'daki 5 ng/μL stoktan 1,5 μL) ekleyin. Reaktifleri yukarı ve aşağı pipetle indirerek karıştırın. Toplam reaksiyon hacmi 15 μL'dir.</li>
		<li>Çok kuyulu plakalar için plakayı plastik folyo ile kapatın.</li>
		<li>Isıtmalı kapaklı bir termomikserde 16 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.</li>
	</ol></li>
	<li>Streptavidin kaplama 384 kuyu plakaları<ol><li>384 kuyu plakasının kuyularını kaplamak için 2.2.2 adımından itibaren 75 μL streptavidin (H 2 O'da 10 μg / mL) kullanın. Streptavidin, kuyucukları havayla kurutmak için kapaksız olarak gece boyunca 37 ° C'de inkübe ederek plakaya bağlanmasına izin verin.</li>
	</ol></li>
</ol>NOT: 2. Günde, tıklama kimyası (adım 3.3) gerçekleştirin, Lnt reaksiyon karışımını streptavidin kaplı plakalara bağlayın (adım 3.4), floresanı tespit edin ve sonuçları analiz edin (adım 3.5).
<ol start="3"><li>Klik-kimya reaksiyonu<ol><li>Azido-FAM (DMSO'da 1.2 mM), TCEP (tris (2-karboksiyetil) fosfin hidroklorür; H 2 O'da hazırlanan 24 mM), TBTA (Tris [(1-benzil-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil]amin; tert-bütanolde 0.48 mMM: DMSO (4: 1)) ve CuSO4∙5H 2 O(H2O'da taze hazırlanmış24mM) stok çözeltilerini hazırlayın.</li>
		<li>Üç klik-kimya reaktifini birleştirin: Azido-FAM (son konsantrasyon 50 μM), TCEP (1 mM final) ve TBTA (0.02 mM final) karışımı, her biri kuyucuk başına 2.25 μL'lik son hacimde 0.75 μL'de. 384 kuyu plakası başına gerekli hacmi hesaplayın (yani, 384 kuyu plakasının tüm kuyuları kullanıldığında 864 μL kullanın). Kuvvetlice karıştırın.</li>
		<li>3.1.7 adımından itibaren 384 kuyu plakasındaki tamamlanmış Lnt reaksiyonuna kuyu başına 2,25 μL reaktif çözeltisi ekleyin.</li>
		<li>Çok kanallı elektronik pipetle yukarı ve aşağı pipetle pipetleyerek karıştırın.</li>
		<li>CuSO4 (1 mM nihai konsantrasyon için 24 mM stoktan 0,75 μL) ekleyin ve çok kanallı elektronik pipetle yukarı ve aşağı pipetle pipetleyerek karıştırın.</li>
		<li>RT'de karanlıkta 1 saat boyunca inkübe edin.</li>
	</ol></li>
	<li>Lnt reaksiyon karışımının streptavidin kaplı 384 kuyu plakalarına bağlanması
	<ol><li>Streptavidin kaplı plakaların kuyularını, 3.2.1 1x adımından 85 μL PBS-T1 ile gece boyunca inkübasyondan sonra yıkayın.</li>
		<li>N-asil-FSL-1-biotin-FAM ürününü streptavidin plakalarına bağlamak için inkübasyon plakasının her bir kuyucuğundan 3.3.6 adımından streptavidin kaplı plakaya adım 3.4.1'den 11 μL klip-kimya reaksiyonunun 11 μL'sini aktarın.</li>
		<li>64 μL PBS-T1 arabellek ekleyin.</li>
		<li>Streptavidin kaplı kuyucuklara bağlanma kontrolü olarak biyotin-floresein (DMSO'daki 3,1 m'lik bir stoktan 0,19 μM) ekleyin.</li>
		<li>RT'deki 384 kuyu plakasını karanlıkta 1 saat boyunca bir termomikserde 300 rpm'de çalkalayarak inkübe edin.</li>
		<li>Otomatik bir plaka yıkayıcı kullanarak plakaları aşağıdaki gibi yıkayın: 85 μL PBS-T2 ile 10 yıkama, plakalar yıkamalar arasında çalkalanır; 85 μL PBS ile 5 yıkama, plakalar yıkamalar arasında çalkalanır.</li>
	</ol></li>
	<li>Floresan algılama ve analizi
	<ol><li>PBS (85 μL) ekleyin ve floresan mikroplaka okuyucusuna 535 nm'de floresan kaydedin.</li>
		<li>Verileri açıklandığı gibi analiz edin (adım 2.5.2).</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Buddelmeijer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+mechanism+of+bacterial+lipoprotein+modification--how,+when+and+why.">The molecular mechanism of bacterial lipoprotein modification--how, when and why.</a> FEMS Microbiology Reviews. 39 (2), 246-261 (2015).</li><li>Kovacs-Simon, A., Titball, R. W., Michell, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipoproteins+of+bacterial+pathogens.">Lipoproteins of bacterial pathogens.</a> Infections and Immunity. 79 (2), 548-561 (2010).</li><li>Jackowski, S., Rock, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+fatty+acids+from+the+1-position+of+phosphatidylethanolamine+to+the+major+outer+membrane+lipoprotein+of+Escherichia+coli.">Transfer of fatty acids from the 1-position of phosphatidylethanolamine to the major outer membrane lipoprotein of Escherichia coli.</a> Journal of Biological Chemistry. 261, 11328-11333 (1986).</li><li>Hillmann, F., Argentini, M., Buddelmeijer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+and+phospholipid+specificity+of+apolipoprotein+N-acyltransferase.">Kinetics and phospholipid specificity of apolipoprotein N-acyltransferase.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (32), 27936-27946 (2011).</li><li>Rangan, K. J., Yang, Y. Y., Charron, G., Hang, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Visualization+and+Large-Scale+Profiling+of+Bacterial+Lipoproteins+with+Chemical+Reporters.">Rapid Visualization and Large-Scale Profiling of Bacterial Lipoproteins with Chemical Reporters.</a> Journal of American Chemical Society. 132 (31), 10628-10629 (2010).</li><li>Thiele, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracing+fatty+acid+metabolism+by+click-chemistry.">Tracing fatty acid metabolism by click-chemistry.</a> ACS Chemical Biology. 7 (12), 2004-2011 (2012).</li><li>Ganesan, L., Shieh, P., Bertozzi, C. R., Levental, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click-Chemistry+Based+High+Throughput+Screening+Platform+for+Modulators+of+Ras+Palmitoylation.">Click-Chemistry Based High Throughput Screening Platform for Modulators of Ras Palmitoylation.</a> Science Reports. 7, 41147 (2017).</li><li>Nozeret, K., Boucharlat, A., Agou, F., Buddelmeijer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+fluorescence-based+assay+to+monitor+enzymatic+activity+of+the+essential+integral+membrane+protein+Apolipoprotein+N-acyltransferase+(Lnt).">A sensitive fluorescence-based assay to monitor enzymatic activity of the essential integral membrane protein Apolipoprotein N-acyltransferase (Lnt).</a> Science Reports. 9 (1), 15978 (2019).</li><li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays.">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> Journal of Biomolecules Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li><li>Mao, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+E.+coli+lipoprotein+diacylglyceryl+transferase.">Crystal structure of E. coli lipoprotein diacylglyceryl transferase.</a> Nature Communication. 7, 10198 (2016).</li><li>Vogeley, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+lipoprotein+signal+peptidase+II+action+and+inhibition+by+the+antibiotic+globomycin.">Structural basis of lipoprotein signal peptidase II action and inhibition by the antibiotic globomycin.</a> Science. 351 (6275), 876-880 (2016).</li><li>Wiktor, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+the+mechanism+of+the+membrane+integral+N-acyltransferase+step+in+bacterial+lipoprotein+synthesis.">Structural insights into the mechanism of the membrane integral N-acyltransferase step in bacterial lipoprotein synthesis.</a> Nature Communication. 8, 15952 (2017).</li><li>Noland, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+lipoprotein+N-acylation+by+Escherichia+coli+apolipoprotein+N-acyltransferase.">Structural insights into lipoprotein N-acylation by Escherichia coli apolipoprotein N-acyltransferase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (30), 6044-6053 (2017).</li><li>Lu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+E.+coli+apolipoprotein+N-acyl+transferase.">Crystal structure of E. coli apolipoprotein N-acyl transferase.</a> Nature Communication. 8, 15948 (2017).</li></ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Triasillenmiş ürünün floresan tespitine dayanan burada açıklanan Lnt testi protokolü hassas ve tekrarlanabilirdir. Biotin'in streptavidin'e spesifik ve verimli bağlanması, tahlilde kilit bir unsurdur. Lnt reaksiyonunun tamamlanmasından sonra bırakılan alkin-POPE substratı da FAM ile floresan olarak etiketlenir, ancak streptavidin plakalarına çoklu yıkama adımlarıyla bağlandıktan sonra verimli bir şekilde çıkarılır. Ayrıca, DMSO'nun eklenmesi Lnt aktivitesini etkilemez ve tahlil üzerinde hiçbir etkisi yoktur. Hem substrat hem de enzim oldukça lipofiliktir ve karışık misellerde reaksiyon koşulları gerektirir. Floresan polarizasyonu da dahil olmak üzere ürün tespiti için çözünür enzimlere ve substratlara dayanan teknikler uygulanamaz8. Tahlilin tek sınırlaması, enzimin alkin-substrat ile uyumluluğudur, çünkü tıklama-kimya reaksiyonu bu kimyasal gruba bağlıdır.
Lnt aktivitesini analiz etmek ve substrat özgüllüğünü belirlemek için önceki çalışmalarda jel kayma testleri bildirilmiştir4. Mevcut protokolle ve floresan spektrometrisine paralel olarak, bu format HTS için uygun olmasa da, Lnt aktivitesi8'i izlemek için jel içi floresan algılama kullanılabilir. Tüp tahlili, Lnt mutantlarının kinetik ve karşılaştırmalı çalışmaları için özellikle ilginçtir. Fosfolipid substrat özgüllüğü, bakterilerin metabolik olarak etiketlenmesiyle elde edilen alkin-fosfolipitler kullanılarak çeşitli zincir uzunluklarından ve doygunluk derecelerinden oluşan alkin-fosfolipitler kullanılarak ele alınabilir8.
384 kuyu plakası formatı HTS çalışmaları ile uyumludur, çünkü aktif enzim ile sadece substrat kontrolü arasında önemli bir fark gözlenmiştir. Ortalama Z' faktörü >0.6, burada sunulan optimize edilmiş koşullarla hesaplanmıştır. Tahlilin yüksek tekrarlanabilirliği, yüksek Z' faktörüne katkıda bulunur. Başarılı HTS için 0,6'nın üzerinde bir Z' faktörü9 önerilir. Yıkama adımları, otomatik bir plaka yıkayıcının kullanılmasıyla etkilidir. Küçük moleküllerin büyük kütüphanelerinin taranmasına izin verecek olan reaktiflerin pipetlenmesi de dahil olmak üzere diğer adımlar daha da optimize edilebilir.
Protokol, alkin grupları enzim tarafından substrat tanıma ile uyumluysa, yağ asidi içeren substratları kullanan diğer asiltransferazlara uygulanabilir. Ökaryotik Palmitoil Asil Transferaz'ın (PAT) spesifik inhibitörlerinin tanımlanması üzerine yapılan yeni bir çalışmada, substrat7 olarak membrana bağlı enzim ve alkin-açil-CoA'nın kullanılması tanımlanmaktadır. Küçük bir biyotinile Ras peptidinin palmitoilasyonu, klik kimyası florojenik tespiti ile gözlendi. Bu tahlilin 384 kuyu plakası formatındaki bir pilot ekran, spesifik PAT inhibitörlerini tanımladı, bu da alkin yağ asidi grubundan oluşan substratların, tıklama kimyası ve hassas floresan tespiti ile birleştirilmesinin hedef tabanlı HTS için umut verici bir yöntem olduğunu düşündürmektedir.

Bakteriyel lipoproteinler, amino terminlerinde kovalent olarak bağlanmış yağ asitleri ile karakterize edilir ve bu asitler 1,2 membranlarına sabitlenir. Proteinin olgun kısmı yapı ve işlev bakımından oldukça çeşitlidir, böylece lipoproteinlerin bakteriyel hücre zarfındaki çeşitli biyolojik süreçlerdeki rolünü açıklar.
Lipoproteinler, sitoplazmik membrana yerleştirildikten sonra fosfolipid kaynaklı yağ asitleri tarafından modifiye edilir. Prolipoproteinler, asillenmiş hale gelen değişmez bir sistein kalıntısı ve olgun proteindeki ilk amino asit içeren bir imza motifi olan lipobox içerir. Bu yolun ilk adımı, diasilgliseril grubunu fosfatidilgliserolden prolipoproteine diyasilgliseril ve sistein arasındaki bir tiyoeter bağlantısı yoluyla prolipoproteine aktaran prolipoprotein fosfatidilgliserol::d iasilgliseril transferaz (Lgt) tarafından katalize edilir. Sinyal peptidaz II (Lsp), sinyal peptidini diasilgliseril prolipoproteinden ayırır ve diasilgliserl moiety yoluyla membrana demirlenen bir apolipoprotein ile sonuçlanır. Üçüncü ve son adım, fosfolipitin sn-1 pozisyonundan apolipoprotein üzerine bir yağ asidi ekleyen ve triasile olgun lipoprotein ile sonuçlanan apolipoprotein N-asiltransferaz (Lnt) tarafından katalize edilir (Şekil 1)3. Lnt reaksiyonu, kararlı bir tiyoester açil enzim ara ürününün oluştuğu iki aşamalı bir pinpon reaksiyonudur. Lizofosfolipid yan ürünü, reaksiyonun ikinci adımında apolipoprotein substratının asilasyonundan önce salınır.
Fosfolipid substrat özgüllüğü, yüksek oranda Tris-Trisin Üre SDS-PAGE4 üzerinde N-açil diasilgliseril peptidin hareketlilik kaymasına dayanan bir Lnt testinde belirlenir. Küçük polar kafa gruplarına sahip, doymuş [sn-1] ve doymamış [sn-2] fosfolipitler tercih edilen substratlar4'tür. Jel kayma testi, apolipoprotein N-asiltransferazın kapsamlı kinetik çalışmaları veya HTS'nin inhibitör molekülleri tanımlaması için uygun değildir. Alkinli yağ asitlerini kullanan tıklama kimyası, bakteri5'te lipoprotein modifikasyonunu ve ökaryotlarda yağ asidi metabolizmasını incelemek için başarıyla kullanılmıştır6. Son zamanlarda, inhibitörleri7 tanımlamak için Ras palmitoylasyonunun in vitro bir testinin bildirildiği bildirilmiştir.
Burada açıklanan yöntemde, deterjandaki saflaştırılmış aktif Lnt, daha sonra floresan spektrometrisi ile tespit edilen alkin-triasile peptid oluşturmak için karışık misellerdeki substratlarla inkübe edilir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#196;kta Purifier FPLC system</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>NA</td>
			<td>Purity: NA 
			Lnt purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alkyne-POPE</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>900414P</td>
			<td>Purity: &#62;99% 
			Lnt substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Azido-FAM</td>
			<td>Lumiprobe</td>
			<td>A4130</td>
			<td>Purity: 100% (pure) 
			Click reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioPhotometer Plus</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purity: NA 
			OD 600 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioTek ELX 405 Select plate washer</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>N&#176; serie 115800, n&#176; materiel 405 Select</td>
			<td>Purity: NA 
			Wash steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotin-fluorescein</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>53608</td>
			<td>Purity: &#8805;90% 
			Fluorescence control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(II) sulfate pentahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3036</td>
			<td>Purity: &#8805;98% 
			Click reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDM</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D310A</td>
			<td>Purity: &#8805; 99% &#946;+&#945;; &#60; 15% &#945; 
			Detergent for Lnt purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D12435</td>
			<td>Purity: anhydrous 
			Solbilization Click reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic pipet Voyager 8 channels 0.5-12.5 uL</td>
			<td>INTEGRA</td>
			<td>4721</td>
			<td>Purity: NA 
			Handling reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>French Pressure Cell</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purity: NA 
			Cell disruption</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FSL-1-biotin</td>
			<td>EMC microcollections</td>
			<td>L7030</td>
			<td>Purity: NA 
			Lnt substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner Bio-One 384-well standard CELLSTAR polystyrene microplate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>781091</td>
			<td>Purity: NA 
			Black with transparent bottom (up or bottom reading)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner Bio-One 96-well sterile polystyrene plate, high binding</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>655097</td>
			<td>Purity: NA 
			Black with transparent bottom (up or bottom reading)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader Infinite M1000 pro</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purity: NA 
			Fluorescence detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTSES (sodium (2-sulfonatoethyl)methanethiosulfonate)</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>S110MT</td>
			<td>Purity: ~100% 
			Thiol specific inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optically Clear Adhesive Seal Sheets</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB-1170</td>
			<td>Purity: NA 
			Foil to seal multi-well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephacryl S400 HR 16/60 gel filtration column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>GE28-9356-04</td>
			<td>Purity: NA 
			Lnt purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StrepTactin Sepharose 50 %</td>
			<td>IBA Biotechnology</td>
			<td>2-1201-010</td>
			<td>Purity: NA 
			Lnt purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>streptavidin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S4762-1MG</td>
			<td>Purity: &#8805;13 units/mg protein 
			Biotin binding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBTA (tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>678937</td>
			<td>Purity: 97% 
			Click reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP (tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>75259</td>
			<td>Purity: &#8805;98% 
			Click reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TECAN Infinite F500</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purity: NA 
			Fluorescence detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TECAN Infinite M1000 pro</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purity: NA 
			Fluorescence detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer C</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382000015</td>
			<td>Purity: NA 
			Heated lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93443</td>
			<td>Purity: 10% in H2O 
			Lnt reaction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra centrifuge</td>
			<td>Beckman LC</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purity: NA 
			Cell fractionation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

click-chemistry based fluorometric assay for apolipoprotein n-acyltransferase from enzyme characterization to high-throughput screening

Proteobakterilerden lipoproteinler, üç integral membran enziminin etkisiyle membran fosfolipitlerinden türetilen yağ asitleri tarafından posttranslasyonel olarak modifiye edilir ve triasile proteinlerle sonuçlanır. Lipoprotein modifikasyon yolundaki ilk adım, bir diasilgliseril grubunun fosfatidilgliserolden prolipoproteine transferini içerir ve bu da diasilgliseril prolipoprotein ile sonuçlanır. İkinci adımda, prolipoproteinin sinyal peptidi bölünür ve bir fosfolipitten türetilen üçüncü bir yağ asidi tarafından modifiye edilen bir apolipoprotein oluşturulur. Bu son adım apolipoprotein N-asiltransferaz (Lnt) tarafından katalize edilir. Lipoprotein modifikasyon yolu, çoğu γ-proteobakteride esastır ve bu da onu yeni antibakteriyel ajanların gelişimi için potansiyel bir hedef haline getirir. Burada açıklanan, küçük inhibitör moleküllerin yüksek verimli taraması ile uyumlu olan Lnt için hassas bir testtir. Enzim ve substratlar membrana gömülü moleküllerdir; bu nedenle, in vitro bir testin geliştirilmesi kolay değildir. Bu, aktif enzimin deterjan varlığında saflaştırılmasını, alkin-fosfolipitlerin ve diasilgliseril peptid substratlarının mevcudiyetini ve karışık misellerdeki reaksiyon koşullarını içerir. Ayrıca, aktivite testini yüksek verimli bir tarama (HTS) kurulumunda kullanmak için, reaksiyon ürününün doğrudan okunması, birleştirilmiş enzimatik reaksiyonlara göre tercih edilir. Bu florometrik enzim testinde, alkin-triasile peptid ürünü, bir tıklama-kimya reaksiyonu yoluyla floresan haline getirilir ve çok kuyulu bir plaka formatında tespit edilir. Bu yöntem, fosfolipitler ve açil-CoA dahil olmak üzere yağ asidi içeren substratlar kullanan diğer asiltransferazlar için geçerlidir.

Lnt reaksiyonunda, fosfolipitlerden gelen sn-1 yağ asidi bir diasilgliseril peptid üzerine aktarılır ve olgun triasile peptid8 ile sonuçlanır. Burada tarif edilen in vitro Lnt testi, substrat olarak bir alkin yağ asidi (alkin-POPE) ve FSL-1-biyotin içeren fosfolipitleri kullanmak üzere tasarlanmıştır ve bu da alkin-FSL-1-biyotin oluşumuna neden olur. Azido-FAM ile bir tıklama-kimya reaksiyonu üzerine, bu ürün floresan olarak etiketlenmeli ve floresan spektrometri ile tespit edilmelidir (Şekil 2).
Reaksiyon koşulları, bir plaka okuyucuda 520 nm'de maksimum floresan okuması için optimize edilmiştir. 1 ng/μL enziminde FSL-1-biyotinin tam dönüşümü8 gözlendi (Şekil 3). Negatif kontroller, enzim olmadan, enzimin inaktif bir varyantı (aktif bölge mutantı C387S) veya düşük floresan tespiti ile sonuçlanan tiol spesifik inhibitör MTSES ile reaksiyonları içeriyordu. Biotin-floresein, streptavidin kaplı plakalara verimli bir şekilde bağlandı ve maksimum floresan sinyali için dahili kontrol olarak kullanıldı. Tüm deneyler üçlü ve standart sapma hesaplamalarında yapıldı ve istatistiksel analizler tahlilin hassas ve tekrarlanabilir olduğunu gösterdi.
Lnt'nin küçük moleküllü inhibitörlerini taramak için bir HTS testi geliştirmek için, reaktiflerin miktarı azaltıldı ve reaksiyonlar doğrudan 384 kuyu plakasında gerçekleştirildi. Ayrıca, yıkama adımları bir plaka yıkayıcı kullanılarak otomatikleştirildi (bakınız Malzeme Tablosu). Tüp testine gelince, reaksiyon duyarlı ve tekrarlanabilirdi, negatif kontrol (C387S) ve aktif enzim (Lnt) arasında anlamlı bir fark vardı (Şekil 4). HTS'de Z' faktörü, bir tahlildeki yanıtın tarama amaçları için yeterince büyük olup olmadığını belirler9 ve aşağıdaki denklem kullanılarak hesaplanır:
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61146/61146equ01.jpg">
Burada S ortalama sinyal, B arka plan sinyalidir ve σ standart sapmadır.
Ortalama Z' faktörü, 384 kuyu plakası kullanılarak HTS formatında gerçekleştirilen Lnt testi için >0.6 idi, bu da Lnt inhibisyonu için küçük molekülün taranması için yapılan tahlilin olağanüstü olduğunu düşündürmektedir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61146/61146fig1v2.jpg"> Şekil 1: Proteobakterilerde lipoproteinin posttranslasyonel modifikasyonunda enzimatik reaksiyonlar. Sıralı basamaklar sitoplazmik membranda Lgt 10, Lsp11 ve Lnt 12,13,14 tarafından katalize edildi. PGN: peptidoglikan, SP: sinyal peptidi, LB: lipobox, Cys+1 içeren korunmuş motif ve yağ asitleri ile modifiye edilmiş ve olgun lipoproteindeki ilk amino asit, PG: fosfatidilgliserol, G-1-P: gliserol-1-fosfat, PE: fosfatidiletanolamin, lizoPE: lizo- fosfatidiletanolamin. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61146/61146fig1v2large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61146/61146fig2v2.jpg"> Şekil 2: Apolipoprotein N-asiltransferaz (Lnt) için florometrik enzim testinin şeması. FSL-1-biotin (sarı) ve alkin-POPE (mavi) substratları, deterjanda çözünen saflaştırılmış Lnt enzimi ile karıştırıldı. Reaksiyon 37 ° C'de karışık misellerde gerçekleştirildi (adım 1). Alkin-FSL-1-biyotin ürünü, tıklama kimyası (adım 2) ile floresein (turuncu) ile etiketlendi ve streptavidin kaplı plakalara bağlandıktan sonra bir floresan plaka okuyucusunda tespit edildi (adım 3). Şekil, Nozeret ve ark.8 tarafından Creative Commons lisansına göre yayınlanan Şekil 1B'nin değiştirilmiş bir versiyonudur (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61146/61146fig2v2large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61146/61146fig3v2.jpg"> Şekil 3: 96 kuyu formatında Lnt aktivitesinin floresan tespiti. Lnt reaksiyonları tüplerde 37 °C'de 16 saat boyunca gerçekleştirildi. Klik kimyası ile floresan etiketleme ve streptavidin kaplı plakalara bağlanma işleminden sonra, floresan floresan spektrometrisi ile ölçüldü. Floresan için kontrol olarak biyotin-floresein (biotin-fluo 0.26 μM) kullanıldı. Tampon sadece reaksiyon tamponuydu. Alkin-POPE (50 μM), FSL-1-biyotin (50 μM) ve substratları (alkin-POPE ve FSL-1-biyotin karışımı, her biri 50 μM) gösteren örnekler enzim içermiyordu. Negatif kontroller MTSES (10 mM) ile inhibisyon ve inaktif bir Lnt varyantı (C387S) içeriyordu. Lnt enzimi 1 ng/μL'de eklendi. Standart sapmalar n=3 deney için hesaplandı. ** P değeri 0,005'<. 494 nm'de uyarma, 5 nm bant genişliği ve 520 nm'de emisyon, 5 nm bant genişliği. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61146/61146fig3v2large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61146/61146fig4v2.jpg"> Resim 4: HTS ile uyumlu 384 kuyu plakasındaki Lnt reaksiyonunun floresan okuması. Enzimatik Lnt reaksiyonları 37 °C'de 384 kuyu plakasında gerçekleştirildi. Floresan için kontrol olarak biyotin-floresein (biotin-fluo 0.19 μM) kullanıldı. Tampon, DMSO içeren reaksiyon tamponuydu. Negatif kontroller MTSES (10 mM) ile inhibisyon ve inaktif bir Lnt varyantı (C387S) içeriyordu. Lnt enzimi 0.5 ng/μL'de eklendi. n = 3 deney için standart sapmalar hesaplandı. P değeri 0,0005'<. 485 nm'de uyarma, 20 nm bant genişliği ve 535 nm'de emisyon, bant genişliği 25 nm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61146/61146fig4v2large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Click-Chemistry Based Fluorometric Assay for Apolipoprotein N-acyltransferase from Enzyme Characterization to High-Throughput Screening at JoVE.com

Click-Chemistry Based Fluorometric Assay for Apolipoprotein N-acyltransferase from Enzyme Characterization to High-Throughput Screening

Burada, diyasilgliseril peptid ve alkin-fosfolipitleri klik-kimyası ile substrat olarak kullanarak apolipoprotein N-asiltransferaz aktivitesini izlemek için hassas bir floresan testi sunulmaktadır.

Enzim Karakterizasyonundan Yüksek Verimli Taramaya Kadar Apolipoprotein N-asiltransferaz için Click-Kimya Tabanlı Florometrik Analiz

Lipoproteins from proteobacteria are posttranslationally modified by fatty acids derived from membrane phospholipids by the action of three integral ...

click-chemistry-based-fluorometric-assay-for-apolipoprotein-n

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

1.8K Görüntüleme.  Institut Pasteur, Unité Biologie et génétique de la paroi bactérienne, Paris, France ; CNRS, UMR 2001 « Microbiologie intégrative et Moléculaire », Paris, France ; INSERM, Équipe Avenir, Paris, France. Burada, diyasilgliseril peptid ve alkin-fosfolipitleri klik-kimyası ile substrat olarak kullanarak apolipoprotein N-asiltransferaz aktivitesini izlemek için hassas bir floresan testi sunulmaktadır.

Video: Click-Chemistry Based Fluorometric Assay for Apolipoprotein N-acyltransferase from Enzyme Characterization to High-Throughput Screening

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper and food industries. A deeper understanding of CAZymes is important from both fundamental biology and industrial standpoints. Vast numbers of CAZymes exist in nature (especially in microorganisms) and hundreds of thousands have been cataloged and described in the carbohydrate active enzyme database (CAZy). However, the rate of discovery of putative enzymes has outstripped our ability to biochemically characterize their activities. One reason for this is that advances in genome and transcriptome sequencing, together with associated bioinformatics tools allow for rapid identification of candidate CAZymes, but technology for determining an enzyme's biochemical characteristics has advanced more slowly. To address this technology gap, a novel high-throughput assay kit based on insoluble chromogenic substrates is described here. Two distinct substrate types were produced: Chromogenic Polymer Hydrogel (CPH) substrates (made from purified polysaccharides and proteins) and Insoluble Chromogenic Biomass (ICB) substrates (made from complex biomass materials). Both CPH and ICB substrates are provided in a 96-well high-throughput assay system. The CPH substrates can be made in four different colors, enabling them to be mixed together and thus increasing assay throughput. The protocol describes a 96-well plate assay and illustrates how this assay can be used for screening the activities of enzymes, enzyme cocktails, and broths.

A high-throughput assay for enzyme screening is described. This multiplexed ready-to-use assay kit comprises of pre-chosen Chromogenic Polymer Hydrogel (CPH) substrates and complex Insoluble Chromogenic Biomass (ICB) substrates. Target enzymes are polysaccharide degrading endo-enzymes and proteases.

Yeni çözünmez Kromojenik altyapı deneyiyle kitleri kullanılarak karbonhidrat parçalayıcı Enzimlerin yüksek verimli tarama

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

Biyokimya

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages for identifying biologically active chemical structures that can modify complex phenotypes such as lifespan. Described here is a simple protocol for producing hundreds of 96-well culture plates with fairly consistent numbers of C. elegans in each well. Next, we specified how to use these cultures to screen thousands of chemicals for effects on the lifespan of the nematode C. elegans. This protocol makes use of temperature sensitive sterile strains, agar plate conditions, and simple animal handling to facilitate the rapid and high throughput production of synchronized animal cultures for screening.

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Here we describe a simple protocol for rapidly producing hundreds of nematode growth media agar, 96-well culture plates with consistent numbers of Caenorhhabditis elegans per well. These cultures are useful for the phenotypic screening of whole organisms. We focus here on using these cultures to screen chemicals for pro-longevity effects.

Yüksek işlem hacmi Caenorhabditis Elegans kimyasal tarama için basit bir yöntem

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

A High-Throughput Luciferase Assay to Evaluate Proteolysis of the Single-Turnover Protease PCSK9

Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) is a single-turnover protease which regulates serum low-density lipoprotein (LDL) levels and, consequently, cardiovascular disease. Although PCSK9 proteolysis is required for its full hypercholesterolemic effect, the evaluation of its proteolytic function is challenging: PCSK9 is only known to cleave itself, undergoes only a single turnover, and after proteolysis, retains its substrate in its active site as an auto-inhibitor. The methods presented here describe an assay which overcomes these challenges. The assay focuses on intermolecular proteolysis in a cell-based context and links successful cleavage to the secreted luciferase activity, which can be easily read out in the conditioned medium. Via sequential steps of mutagenesis, transient transfection, and a luciferase readout, the assay can probe PCSK9 proteolysis under conditions of either genetic or molecular perturbation in a high-throughput manner. This system is well suited for both the biochemical evaluation of clinically discovered missense single-nucleotide polymorphisms (SNPs), as well as for the screening of small-molecule inhibitors of PCSK9 proteolysis.

This protocol presents a method to evaluate the proteolytic activity of an intrinsically low-activity, single turnover protease in a cellular context. Specifically, this method is applied to evaluate the proteolytic activity of PCSK9, a key driver of lipid metabolism whose proteolytic activity is required for its ultimate hypercholesterolemic function.

Tek-ciro proteaz PCSK9 proteolizis değerlendirmek için bir yüksek-den geçerek Luciferase tahlil

Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) is a single-turnover protease which regulates serum low-density lipoprotein (LDL) levels and, ...

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used strategy for RBP capture exploits the polyadenylation [poly(A)] of target RNAs, which mostly occurs on eukaryotic mature mRNAs, leaving most binding proteins of non-poly(A) RNAs unidentified. Here we describe the detailed procedures of a recently reported method termed click chemistry-assisted RNA-interactome capture (CARIC), which enables the transcriptome-wide capture of both poly(A) and non-poly(A) RBPs by combining the metabolic labeling of RNAs, in vivo UV cross-linking, and bioorthogonal tagging.

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

A detailed protocol for applying the click chemistry-assisted RNA-interactome capture (CARIC) strategy to identify proteins binding to both coding and noncoding RNAs is presented.

Yakalama ve tıklama Kimya destekli RNA-interactome kullanarak RNA bağlanıcı proteinler tanımlaması (CARIC) strateji yakalama

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would not occur spontaneously. These proteins are crucial for essentially all aspects of cellular life, including metabolism, cell division, responses to environmental changes and movement. The protocol presented here describes a nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)-coupled ATPase assay that has been adapted to semi-high throughput screening of small molecule ATPase inhibitors. The assay has been applied to cardiac and skeletal muscle myosin II's, two actin-based molecular motor ATPases, as a proof of principle. The hydrolysis of ATP is coupled to the oxidation of NADH by enzymatic reactions in the assay. First, the ADP generated by the ATPase is regenerated to ATP by pyruvate kinase (PK). PK catalyzes the transition of phosphoenolpyruvate (PEP) to pyruvate in parallel. Subsequently, pyruvate is reduced to lactate by lactate dehydrogenase (LDH), which catalyzes the oxidation of NADH in parallel. Thus, the decrease in ATP concentration is directly correlated to the decrease in NADH concentration, which is followed by change to the intrinsic fluorescence of NADH. As long as PEP is available in the reaction system, the ADP concentration remains very low, avoiding inhibition of the ATPase enzyme by its own product. Moreover, the ATP concentration remains nearly constant, yielding linear time courses. The fluorescence is monitored continuously, which allows for easy estimation of the quality of data and helps to filter out potential artifacts (e.g., arising from compound precipitation or thermal changes).

A nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)-coupled ATPase assay has been adapted to semihigh throughput screening of small molecule myosin inhibitors. This kinetic assay is run in a 384-well microplate format with total reaction volumes of only 20 &#181;L per well. The platform should be applicable to virtually any ADP producing enzyme.

Küçük Molekül Inhibitörlerinin Taranması için NADH-Coupled ATPase Tsay'ın Yarı-Yüksek İş-İşLenme Adaptasyonu

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  &#946; Reporter Assay

Plants are a source of food for many animals, and&#160;they can produce thousands of chemicals. Some of these compounds affect physiological processes in the vertebrates that consume them, such as endocrine function. Phytoestrogens, the most well studied endocrine-active phytochemicals, directly interact with the hypothalamo-pituitary gonadal axis of the vertebrate endocrine system. Here we present the novel use of a cell-based assay to screen plant extracts for the presence of compounds that have estrogenic biological activity. This assay uses mammalian cells engineered to highly express estrogen receptor beta (ER&#946;) and that have been transfected with a luciferase gene. Exposure to compounds with estrogenic activity results in the cells producing light. This assay is a reliable and simple way to test for biological estrogenic activity. It has several improvements over transient transfection assays, most notably, ease of use, the stability of the cells, and the sensitivity of the assay.

We have optimized a commercially available estrogen receptor &#946; reporter assay for screening human and nonhuman primate foods for estrogenic activity. We validated this assay by showing that the known estrogenic human food soy registers high, while other foods show no activity.

Hücre Tabanlı Östrojen Reseptörü Kullanarak Fitoöstrojen taraması β Reporter Assay

Plants are a source of food for many animals, and&#160;they can produce thousands of chemicals. Some of these compounds affect physiological processes in ...

Optimized Incorporation of Alkynyl Fatty Acid Analogs for the Detection of Fatty Acylated Proteins using Click Chemistry

Fatty acylation, the covalent addition of saturated fatty acids to protein substrates, is important in regulating a myriad of cellular functions in addition to its implications in cancer and neurodegenerative diseases. Recent developments in fatty acylation detection methods have enabled efficient and non-hazardous detection of fatty acylated proteins, particularly through the use of click chemistry with bio-orthogonal labeling. However, click chemistry detection can be limited by the poor solubility and potential toxic effects of adding long chain fatty acids to cell culture. Described here is a labeling approach with optimized delivery using saponified fatty acids in combination with fatty-acid free BSA, as well as delipidated media, which can improve detection of hard to detect fatty acylated proteins. This effect was most pronounced with the alkynyl-stearate analog, 17-ODYA, which has been the most commonly used fatty acid analog in click chemistry detection of acylated proteins. This modification will improve cellular incorporation and increase sensitivity to acylated protein detection. In addition, this approach can be applied in a variety of cell types and combined with other assays such as pulse-chase analysis, stable isotope labeling with amino acids in cell culture, and mass spectrometry for quantitative profiling of fatty acylated proteins.

The study of fatty acylation has important implications in cellular protein interactions and diseases. Presented here is a modified protocol to improve click chemistry detection of fatty acylated proteins, which can be applied in various cell types and combined with other assays, including pulse-chase and mass spectrometry.

Click Kimya Kullanarak Yağ Asillenmiş Proteinlerin Tespiti için Alkinil Yağ Asidi Analoglarının Optimize Edilmiş Birleştirilmesi

Fatty acylation, the covalent addition of saturated fatty acids to protein substrates, is important in regulating a myriad of cellular functions in ...

A High-Throughput Enzyme-Coupled Activity Assay to Probe Small Molecule Interaction with the dNTPase SAMHD1

Sterile alpha motif and HD domain-containing protein 1 (SAMHD1) is a pivotal regulator of intracellular deoxynucleoside triphosphate (dNTP) pools, as this enzyme can hydrolyze dNTPs into their corresponding nucleosides and inorganic triphosphates. Due to its critical role in nucleotide metabolism, its association to several pathologies, and its role in therapy resistance, intense research is currently being carried out for a better understanding of both the regulation and cellular function of this enzyme. For this reason, development of simple and inexpensive high-throughput amenable methods to probe small molecule interaction with SAMHD1, such as allosteric regulators, substrates, or inhibitors, is vital. To this purpose, the enzyme-coupled malachite green assay is a simple and robust colorimetric assay that can be deployed in a 384-microwell plate format allowing the indirect measurement of SAMHD1 activity. As SAMHD1 releases the triphosphate group from nucleotide substrates, we can couple a pyrophosphatase activity to this reaction, thereby producing inorganic phosphate, which can be quantified by the malachite green reagent through the formation of a phosphomolybdate malachite green complex. Here, we show the application of this methodology to characterize known inhibitors of SAMHD1 and to decipher the mechanisms involved in SAMHD1 catalysis of non-canonical substrates and regulation by allosteric activators, exemplified by nucleoside-based anticancer drugs. Thus, the enzyme-coupled malachite green assay is a powerful tool to study SAMHD1, and furthermore, could also be utilized in the study of several enzymes which release phosphate species.

SAMHD1 is a deoxynucleoside triphosphate triphosphohydrolase with critical roles in human health and disease. Here we present a versatile enzyme-coupled SAMHD1 activity assay, deployed in a 384-well microplate format, that allows for the evaluation of small molecules and nucleotide analogues as SAMHD1 substrates, activators, and inhibitors.

dNTPase SAMHD1 ile Küçük Molekül Etkileşimini Araştırmak için Yüksek Verimli Enzime Bağlı Aktivite Testi

Sterile alpha motif and HD domain-containing protein 1 (SAMHD1) is a pivotal regulator of intracellular deoxynucleoside triphosphate (dNTP) pools, as this ...

Optical Tweezers to Study RNA-Protein Interactions in Translation Regulation

RNA adopts diverse structural folds, which are essential for its functions and thereby can impact diverse processes in the cell. In addition, the structure and function of an RNA can be modulated by various trans-acting factors, such as proteins, metabolites or other RNAs. Frameshifting RNA molecules, for instance, are regulatory RNAs located in coding regions, which direct translating ribosomes into an alternative open reading frame, and thereby act as gene switches. They may also adopt different folds after binding to proteins or other trans-factors. To dissect the role of RNA-binding proteins in translation and how they modulate RNA structure and stability, it is crucial to study the interplay and mechanical features of these RNA-protein complexes simultaneously.&#160;This work illustrates how to employ single-molecule-fluorescence-coupled optical tweezers to explore the conformational and thermodynamic landscape of RNA-protein complexes at a high resolution. As an example, the interaction of the SARS-CoV-2 programmed ribosomal frameshifting element with the trans-acting factor short isoform of zinc-finger antiviral protein is elaborated. In addition, fluorescence-labeled ribosomes were monitored using the confocal unit, which would ultimately enable the study of translation elongation. The fluorescence coupled OT assay can be widely applied to explore diverse RNA-protein complexes or trans-acting factors regulating translation and could facilitate studies of RNA-based gene regulation.

This protocol presents a complete experimental workflow for studying RNA-protein interactions using optical tweezers. Several possible experimental setups are outlined including the combination of optical tweezers with confocal microscopy.

Çeviri Yönetmeliğinde RNA-Protein Etkileşimlerini İncelemek için Optik Cımbız

RNA adopts diverse structural folds, which are essential for its functions and thereby can impact diverse processes in the cell. In addition, the ...

A "Dual-Addition" Calcium Fluorescence Assay for the High-Throughput Screening of Recombinant G Protein-Coupled Receptors

G protein-coupled receptors (GPCRs) represent the largest superfamily of receptors and are the targets of numerous human drugs. High-throughput screening (HTS) of random small molecule libraries against GPCRs is used by the pharmaceutical industry for target-specific drug discovery. In this study, an HTS was employed to identify novel small-molecule ligands of invertebrate-specific neuropeptide GPCRs as probes for physiological studies of vectors of deadly human and veterinary pathogens.
The invertebrate-specific kinin receptor was chosen as a target because it regulates many important physiological processes in invertebrates, including diuresis, feeding, and digestion. Furthermore, the pharmacology of many invertebrate GPCRs is poorly characterized or not characterized at all; therefore, the differential pharmacology of these groups of receptors with respect to the related GPCRs in other metazoans, especially humans, adds knowledge to the structure-activity relationships of GPCRs as a superfamily. An HTS assay was developed for cells in 384-well plates for the discovery of ligands of the kinin receptor from the cattle fever tick, or southern cattle tick, Rhipicephalus microplus. The tick kinin receptor was stably expressed in CHO-K1 cells.
The kinin receptor, when activated by endogenous kinin neuropeptides or other small molecule agonists, triggers Ca2+ release from calcium stores into the cytoplasm. This calcium fluorescence assay combined with a &#34;dual-addition&#34; approach can detect functional agonist and antagonist &#34;hit&#34; molecules in the same assay plate. Each assay was conducted using drug plates carrying an array of 320 random small molecules. A reliable Z&#39; factor of 0.7 was obtained, and three agonist and two antagonist hit molecules were identified when the HTS was at a 2 &#181;M final concentration. The calcium fluorescence assay reported here can be adapted to screen other GPCRs that activate the Ca2+ signaling cascade.

In this work, a high-throughput, intracellular calcium fluorescence assay for 384-well plates to screen small molecule libraries on recombinant G protein-coupled receptors (GPCRs) is described. The target, the kinin receptor from the cattle fever tick, Rhipicephalus microplus, is expressed in CHO-K1 cells. This assay identifies agonists and antagonists using the same cells in one "dual-addition" assay.

Rekombinant G Proteinine Bağlı Reseptörlerin Yüksek Verimli Taraması için "Çift İlaveli" Bir Kalsiyum Floresan Testi

G protein-coupled receptors (GPCRs) represent the largest superfamily of receptors and are the targets of numerous human drugs. High-throughput screening ...