Name: potato virus x-based microrna silencing (vbms) in potato.
Uploaded: 2020-05-11T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Potato Virus X-Based microRNA Silencing VbMS In Potato. at JoVE.com

PVX-LIC vektörü sağladığı için Tsinghua Üniversitesi'nden Dr. Yule Liu'ya teşekkür ederiz. Bu çalışma, Texas A&M AgriLife Research ve USDA Ulusal Gıda ve Tarım Enstitüsü'nden JS'ye TEX0-1-9675 Hatch Projesi'nden bir başlangıç fonu tarafından desteklendi.

1. Patates Bitkileri Yetiştirin.
<ol><li>In vitro patates bitkilerini kültür tüplerinde (25 x 150 mm) Murashige ve Skoog (MS) medyası ve Gamborg vitamini (MS bazal tuz karışımı, Gamborg'un vitamini, 30 g/L sakkaroz, 3,5 g/L agar, pH = 5,7) ile yay. Tüpleri büyüme odasına 20-22 °C, 16 saat ışık/8 saat koyu fotoperiyod ve ışık yoğunluğu 120 μmol/m2⭐s1'in altına yerleştirin. NOT: Yeni sürgünler ve kökler normalde bitkilerden 1-2 hafta içinde gelişir. Bitkileri her ay taze MS/Gamborg vitamin ortamı ile yayın.</li>
	<li>Dört hafta sonra, in vitro bitkileri toprağa nakledin ve 20-22 ° C, 16 saat ışık / 8 saat karanlık fotoperiyod ve ışık yoğunluğu 120 μmol / m2 ⭐ s1 altındaki bir serada yetiştirin. NOT: Yeni geliştirilen kökleri ve yaprakları olan bitkiler ekim için uygundur. Yeni nakledilen bitkiler için nemi ilk 3-4 gün koruyun.</li>
</ol>2. VbMS vektörlerini oluşturun.
<ol><li>Kısa tandem TM moleküllerini tasarlayın ve klonla (STTM, Şekil 1)22,53 ilgi miRNA için. NOT: Deneysel verilere dayalı olarak veya miRbase veritabanından miRNA dizileri alın54,55,56,57,58,59. Bu çalışmada kullanılan miR166 dizisi daha önce 60 olarak tanımlanmıştır.<ol>
<li>MiRNA'nın 10-11. nükleotitlerine karşılık gelen sahadaki miRNA'nın ters tamamlayıcı dizisine normalde 5'-CTA-3' uyumsuzluk dizisi ekleyerek TM modülini tasarlayın. NOT: Örneğin, Stu-miR160 dizisi 5'-UGCCUGGCUCCGUAUGCC-3'61'dir ve burada 10-11. Ters kompleman sırası (deoksinükleotidlerde) 5'-GGCATACAGGGAGCCAGGCA-3' ve uyumsuz şişkinlik ekleme bölgesi kalın olarak gösterilir. TM molekül dizisi (deoksinükleotid) 5'-GGCATACAGG-CTA-GAGCCAGGCA-3' olmalıdır.</li>
		<li>STTM parçasını klonlamak için astarlar tasarlayın (Şekil 1). PCR klonlama için şablon olarak 48 nt aralayıcı dizisine sahip DNA oligonükleotidlerini kullanın. İleri astar, bir LIC1 bağlayıcıdan (5'-CgACgACAAGACCgT-3'), yukarıdakilerin TM molekülü için tasarlanan ileri dizilimini ve 48 nt aralayıcının kısmi 5' dizisini (5'-GTTGTTTTGTTATGGT-3') oluşur. Ters astar, bir LIC2 bağlayıcıdan (5'-gAggAgAagAgCCgT-3'), TM molekülünün ters tamamlayıcı dizisinden ve 48 nt aralayıcının (5'-ATTCTTCTTCTTTAGACCAT-3') 3' dizisine kısmi bir ters tamamlayıcıdan oluşur. NOT: 48 nt aralayıcı sırası 5'-GTTGTTGTTGTTATGGTCTAATTTAAATGGTCTAAGAAGAAT-3'dür. Örneğin, STTM-miR160 için ileri astar 5'-CgACgACAAgACCgT-GGCATACAGG-CTA-GAGCCAGGCA-GTTGTTGTTGTTATGGT-3' olmalıdır; ters astar 5'-gAggAgAagAgCCgT-TGCCTGGCTC-TAG-CCTGTATGCC-ATTCTTCTTCTTTAGACCAT-3' olmalıdır (Şekil 1).</li>
		<li>Şablon olarak sentezlenmiş evrensel 48 nt aralayıcıyı ve yüksek doğrulukta bir DNA polimerazını kullanarak PCR tarafından 50 μL hacimde STTM parçasını güçlendirin.<ol>
<li>Her astarın 0,5 μL'si (40 μM), 0,5 μL'si 48 nt ara oligo (40 μM), 5 μL'si 10x PCR tamponu karıştırarak PCR reaksiyonunun ayarını ayarlayın, 1 μL dNTP karışımı (her biri 10 mM), 0,1 μL yüksek kaliteli DNA polimeraz (10 U/μL) ve 43 μL ddH2O toplam 50 μL hacme aşağıdaki gibi standart PCR amplifikasyonu gerçekleştirin: 3 dakika için 94 °C, 45 s için 94 °C 32 döngü, 45 s için 60 °C ve 60 s için 72 °C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>STTM parçasını etanol çökeltme ile arındırın. PCR ürünlerine 2,5 hacim etanol ve 1/10 hacimli 3 M sodyum asetat (pH = 4,0) ekleyin. 10 dakika boyunca 14.000 x g'da kuvvetlice karıştırın ve santrifüj. Süpernatant çıkarın ve peletin% 70 etanol 1 mL ile durulayın. Peletin kurut ve 20 μL ddH2O'da çözün. NOT: STTM PCR ürünlerinin amplifikasyonlarını kontrol etmek için DNA elektroforezi kullanın.</li>
		<li>2,5 μL saflaştırılmış STTM PCR ürünü, 0,5 μL 10x T4 DNA polimeraz tamponu, 0,05 μL 1 M ditiyothreitol (DTT), 0,25 μL 100 mM dATP karıştırarak buz üzerinde T4 DNA polimeraz reaksiyonu ayarlayın, 0,1 μL T4 DNA polimeraz (3 U/μL) ve 1,6 μL ddH2O toplam 5 μL hacme, karışımı 37 °C'de 15 dakika kuluçkaya yatır, ve T4 DNA polimerazını devre dışı bırakmak için ürünleri 75 °C'de 20 dakika boyunca tedavi edin.</li>
	</ol></li>
	<li>PVX tabanlı VbMS yapısını hazırlayın.<ol>
<li>100 μL hacimde 2,5 μL SmaI (20 U/μL) ile 5 μg PVX-LIC plazmid38 sindirin.</li>
		<li>Sindirilen PVX-LIC ürünlerine eşit miktarda fenol:kloroform:izopropanol (25:24:1, pH = 6.7/8.0) ekleyin ve kuvvetlice karıştırın. 10 dakika boyunca 14.000 x g'da santrifüj ve süpernatantı yeni bir santrifüj tüpüne aktarın. Eşit miktarda kloroform ekleyin:izopropanol (24:1) ve girdap kuvvetlice. 10 dakika boyunca 14.000 x g'da santrifüj. NOT: PVX-LIC vektörü klonlama için LIC kasetini barındırır. PVX-LIC vektörün LIC kaseti bir ccdB geni ve kloramfenikol dirençli bir gen içerir ve kanamycin (50 μg/L) ve kloramfenikol (15 μg/L) içeren LB ortamı kullanılarak E. coli strain DB3.1'de tutulması/yayılması gerekir.</li>
		<li>Süpernatantı yeni bir santrifüj tüpüne aktarın. 2,5 cilt etanol ve 1/10 hacim 3 M sodyum asetat (pH = 4,0) ekleyin ve kuvvetlice karıştırın. 10 dakika boyunca 14.000 x g'da santrifüj ve süpernatantı çıkarın.</li>
		<li>Peletin% 70 etanol ve girdaptan 1 mL ile kuvvetlice durulayın. 10 dakika boyunca 14.000 x g'da santrifüj ve süpernatantı çıkarın. Peleti kurutun ve sindirilen PVX-LIC plazmidini 100 μL ddH2O ile çözün.</li>
		<li>Sindirilmiş PVX-LIC vektör DNA'sının 2,5 μL'si, 10x T4 DNA polimeraz tamponunun 0,5 μL'si karıştırılarak buz üzerinde T4 DNA polimeraz reaksiyonunun kurulması, 1 M DTT'nin 0,05 μL'si, 100 mM dTTP'nin 0,25 μL'si ve toplam 5 μL hacimde 0,1 μL T4 DNA polimerazı (3 U/μL) karışımı 37 °C'de 15 dakika kuluçkaya yatırın ve ürünleri 20 dakika boyunca 75 °C'de tedavi edin T4 DNA polimerazını etkisiz hale getir.</li>
	</ol></li>
	<li>STTM dizisini LIC reaksiyon kullanarak PVX-LIC vektörüne klonlayın. T4 DNA polimerazla işlenmiş STTM PCR ürünlerini (5 μL) ve T4 DNA polimerazla işlenmiş PVX-LIC plazmidlerini (5 μL) karıştırın. 70 °C'de 5 dakika kuluçkaya yaslanın, 0,1 °C/s rampada 22 °C'ye kadar soğutun ve PCR makinesi kullanarak 30 dakika boyunca 22 °C'de tutun. NOT: LIC klonlamanın daha yüksek verimliliğini elde etmek için kuluçka süresini 4 °C'de geceleme süresine kadar uzatın.</li>
	<li>LIC reaksiyon ürünlerinin 5 μL'sini E. coli DH5α'ya dönüştürün ve 50 μg/mL kanamycin62,63 içeren bir LB plakasında büyüyün. PVX-LIC vektörü için klonlama astarları ve evrensel astar ve ardından sıralama ile PCR ile pozitif kolonileri seçin ve doğrulayın.<ol>
<li>Pozitif klonları tanımlamak için STTM klonlama için ters astar ile birlikte PVX-LIC (5'-GTGTTGGCTTGCAAACTAGAT-3') için ileri astar ile koloni PCR gerçekleştirin. PCR bandının boyutu ~300 bp olmalıdır. NOT: Sonlandırıcı döngüsü sırasıyla STTM parçalarının dizilerini doğrulayın64,65.</li>
	</ol></li>
	<li>PVX-STTM plazmidlerini doğrulanmış klonlardan ayırın ve bunları GV3101, GV2260 veya EHA10562,63 Agrobacterium suşlarına dönüştürün. Agrobacterium kolonilerini PCR ile doğrulayın. NOT: PVX-LIC için ileri astarı ve STTM klonlama için ters astarı kullanarak Agrobacterium kolonilerini PCR ile onaylayın.</li>
</ol>3. Patates bitkilerinde PVX tabanlı VbMS tahlilleri gerçekleştirin.
<ol><li>4 haftalık tüp patates bitkilerini toprağa nakletin. Nakledilen bitkiler 3-4 gün sonra VbMS testine tabi tutulacaktır.</li>
	<li>Patates bitkilerini PVX-STTM plazmidlerini içeren Agrobacterium ile aşılayın. NOT: Patateste VbMS tahlili için Agrobakteri aracılı infiltrasyon ve kürdan tırmalama inoktülasyonu aynı anda gerçekleştirilir.<ol>
<li>PVX-STTM vektörleri içeren pozitif transformantları 50 μg/mL kanamycin ve 50 μg/mL rifampicin içeren 50 mL sıvı LB'ye alın ve aşılayın. OD600 = 1.0'a kadar 16 saat boyunca 220 rpm'de 28 °C inkübatörde büyüyün.</li>
		<li>Aynı zamanda, pozitif Agrobacterium kolonilerini 50 μg/ mL kanamycin ve 50 μg / mL rifampicin içeren en az iki yeni LB plakasına serin ve 1 gün boyunca 28 ° C'de büyüyün. Kontrol olarak PVX-LIC38,66 vektörünü ve virüs yayılmasını izlemek için PVX-GFP67,68'i dahil edin.</li>
		<li>Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 3.400 x g'da santrifüjleme ile Agrobacterium sıvı kültürünü toplayın. Agrobacterium hücrelerini eşit hacimli sızma tamponu (10 mM MgCl2, 10 mM MES ve 200 μM asetosyringone, pH = 5,6) ile yeniden biriktirin ve OD600 = 1,0'a ayarlayın. Oda sıcaklığında 6 saat kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Agrobacterium kültürünü 1 mL iğnesiz şırınga ile tamamen genişletilmiş yaprakların abaksiyel tarafına sızın.<ol>
<li>Bir yaprağı tek elinizle çevirin ve tutun, ardından bir parmağınızı sızıntı yerindeki adaxial taraftan yaprak laminasını desteklemek için kullanın. Şırınnayı diğer elinizle yaprak yüzeyine dikey tutun ve Agrobacterium kültürünü lamina'nın abaksiyel tarafına sızın.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Agrobacterium kültürünü LB plakalarından kazıyın ve sızan patates bitkilerinin ilk bir veya iki internotunun gövde yüzeyini kürdanla çizin. Sapın epidermisini hafifçe çizin. Bitkilere ciddi zararlar verebilecek gövdeden delinmekten kaçının.</li>
	</ol>
</li>
	<li>22 °C'de 22 °C'de 16 saat açık/8 saat koyu fotoperiyod ve bir serada 120 μmol/m2φ s1 ışık yoğunluğu ile bitkileri yetiştirin. NOT: MiRNA susturma nedeniyle fenotipler genellikle postinokokasyon sonrası 2-4 hafta içinde ortaya çıkar (Şekil 2, Şekil 3). VbMS fenotipinin sızmadan sonra görünmesi genellikle 10-20 gün sürer. VbMS fenotipi, spesifik miRNA ve hedef genlerin özelliklerine, büyüme koşullarına ve patates çeşitlerine bağlıdır.</li>
</ol>4. İfade analizi yapın.
<ol><li>Fenotipler 2-4 haftalık postinokokasyonda ortaya çıktığında, vbMS bitkilerinden fenotipli sürgünler, yapraklar, çiçekler veya kökler gibi dokuları ve kontrol tesislerinden gelen dokuları makasla toplayın. Toplanan dokulardan toplam RNA'ları izole edin.</li>
	<li>RNA kalitesini elektroforez62,63 ile kontrol edin ve OD260 absorbansını spektrofotometre ile ölçerek RNA konsantrasyonunu ölçün.</li>
	<li>MiRNA ifadesini analiz etmek için stem-loop gerçek zamanlı ters transkripsiyon PCR (RT-PCR) kullanın.<ol>
<li>Belirli miRNA'lar için bir kök döngü ters transkripsiyon astarı tasarlayin. Stem-loop RT primer'lar evrensel 5' omurga ve belirli bir miRNA'nın 3' 6 nt uzantısını içerir. Bir kök döngü yapısı oluşturan 5' evrensel omurga (5'- GTCTCCTCTGGTGCagggtccgaggtattcGCACCAGAGGAGAC-3') tasarlayın. (Büyük harf ters tekrarlanan bir sıraya ve döngü bölgesine küçük harfe karşılık gelir).</li>
		<li>Bir döngü oluşturan 5' omurga dizisinin bir kısmı, sonraki PCR amplifikasyonu için ters astar görevi görür (omurga dizisinde kalın-italik sıra). Ters transkripsiyon için özgüllük sağlamak üzere kök döngü astarı için ilgi miRNA'nın 3' ucuna ters tamamlayıcı olan 6 nt'lik bir uzantı dizisi ekleyin (Ek Şekil 1A). NOT: Chen ve ark.69 ve Erika Varkonyi-Gasic ve ark.70,71,72 tarafından tanımlandığı gibi kök-döngü ters transkripsiyon astarını tasarlayın. Örneğin, Stu-miR160 için kök döngü ters transkripsiyon astarı 5'-GTCTCCTCTGTGCagggtccgaggtattcGCACCAGAGGGACGGCATA-3' olarak tasarlanmıştır. Patates miR165/166 ailesi için kök döngü ters transkripsiyon astarı 5'-GTCTCCTCTGTGCagggtccgaggtattcGCACCAGAGGAGACGG(A/G)A-3' olarak tasarlanmıştır. (Kalın büyük harf dizileri, belirli miRNA'lar için ters transkripsiyonun özgüllüğünü sağlar).</li>
		<li>Toplam RNA'nın 50-200 ng'si, kök döngü ters transkripsiyon astarının 1 μL'si (100 μM), 2 μL 10x tamponu karıştırarak ters transkripsiyon reaksiyonunu ayarlayın, Buz üzerinde 0,2 μL RNaz inhibitörü (40 U/μL), 0,25 μL dNTP (her biri 10 mM) ve 1 μL ters transkriptaz (200 U/μL). Toplam 20 μL hacme çekirdeksiz ddH2O ekleyin.</li>
		<li>Darbeli ters transkripsiyon prosedürünü kullanarak ters transkripsiyon gerçekleştirin. Ters transkripsiyon reaksiyon karışımını 30 dakika boyunca 16 °C'de kuluçkalayın, 30 s için 30 °C, 30 s için 42 °C ve 1 s için 50 °C sıcaklık döngüsünü toplam 60 döngü boyunca gerçekleştirin ve ters transkriptazı 5 dakika boyunca 85 °C'de inkübasyonla etkisiz hale koyun.</li>
		<li>MiRNA ifadesinin gerçek zamanlı PCR analizi için, ileri astarı miRNA dizisine göre tasarlayın, ancak yukarıda tasarlanan kök döngü ters transkripsiyon astarı ile çakışır dizileri içermez. Uzunluğu, erime sıcaklığını ve GC içeriğini optimize etmek için ileri astarın 5' kısmına 3–7 nt uzantı ekleyin (Ek Şekil 1). NOT: Evrensel ters astar 5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'' dür. Örneğin, Stu-miR160 için kök döngü ters transkripsiyon astarı 5'-CGGCTGCCTGGCTCC-3' olarak tasarlanmıştır. MiR165/166 ailesi için kök-döngü ters transkripsiyon astarı 5'-CGGCTCGGACCAGGCTT-3''dür. Kalın diziler, astar optimizasyonu için 5' uzantı görevi eder. MiRNA için kök döngü ters transkripsiyon astarları ve gerçek zamanlı PCR astarları miRNA Primer Tasarım Aracı73 kullanılarak tasarlanabilir.</li>
	</ol></li>
	<li>Hedef mRNA'ların cDNA'larını standart ters transkripsiyon PCR (RT-PCR) ile sentezleyin. Ters transkripsiyon reaksiyon karışımını 37 °C'de 60 dakika kuluçkaya yatırın ve 5 dakika boyunca 85 °C'ye ısıtarak ters transkriptazı devre dışı bırakın. NOT: (1) Hedef mRNA'lar bilinmiyorsa psRNATarget programı74 kullanarak hedef mRNA'ları tahmin edin. (2) mRNA için evrensel ters transkripsiyon astarı, 5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3' bağlantılı bir astardır.</li>
	<li>Hem ilgi çekici miRNA hem de hedef mRNA'lar için gerçek zamanlı PCR reaksiyonlarını ayarlayın. Buz üzerinde toplam 5 μL hacimde 0,5 μL şablon cDNA, 5 μL 2x gerçek zamanlı PCR tamponu SYBR yeşili, her ileri ve ters astarın 0,05 μL'si (40 μM) ve 4,4 μL ddH2O'yu karıştırın.</li>
	<li>3 dakika boyunca 95 °C'de kuluçkaya yaslanın, 3 s için 95 °C'lik 40 döngü ve 30 sn için 60 °C. Sonraki erime eğrisi analizini aşağıdaki gibi yapın: 15 s için 95 °C'de kuluçkalayın, 20 °C/s'lik bir rampada 60 °C'ye kadar soğutun, 60 s için 60 °C'de tutun, 0,2 °C/s'lik bir rampada 95 °C'ye ısıtın ve 15 s için 95 °C'de tutun. ΔΔCt yöntemlerini kullanarak Ct değerlerini analiz edin76,77 ve standart hatalarla araçları çizin. NOT: (1) Hedef mRNA'lar için gerçek zamanlı PCR astarları açıklandığı gibi tasarlanabilir75. (2) Patates poliubiquitin 10 geni patateste normalleşme için bir iç kontrol görevi görebilirsiniz. Patates poliubiquitin 10 geni için ileri astar 5'-ATGTTGCCTTTTTTGTGGTTG-3' ve ters astar 5'-TTATTTATTCACATAACGACAGTTCAACC-3'. (3) Gerçek zamanlı PCR analizi için kontaminasyon ve astar-dimer oluşumu yanlış pozitif sonuçlar üretebilir. Spesifik olmayan amplifikasyonu izlemek ve gerçek zamanlı PCR analizinin sorumluluğunu artırmak için, şablonsuz kontrollerin dahil edilmesi ve gerçek zamanlı PCR tahlilleri için ters transkriptaz yapılması önerilir.</li>
</ol>

STTM tasarımını PVX vektörüne entegre ederek patatesteki endojen miRNA'ların işlevini karakterize etmek için PVX tabanlı bir miRNA susturma sistemi sunuyoruz. VbMS sisteminin, bitki türleri arasında yüksek oranda korunmuş bir miRNA ailesi olan patateste miRNA165/166'nın susturılmasında etkili olduğu kanıtlanmıştır.
TM yaklaşımı, hedeflenen miRNA'nın elenmesi ve etkinliğinin tutuklanmasıyla sonuçlanan miRNA tamamlama sırasında beklenen bölünme bölgesinde uyumsuz bir döngü oluşturmak için tasarlanmış yapay bir miRNA hedef mimikine dayanan miRNA'ların ifadesini kesintiye uğratacak şekilde geliştirilmiştir22,35,78,79 . TM molekülleri ve hedef miRNA'lar arasındaki eşleştirme, belirli bir miRNA veya miRNA ailesinin seviyelerini düşürerek miRNA'ların işlevini engeller ve bu da hedef mRNA'ların yükselmesine yol açar. MiRNA'ların susturulması için endojen miRNA hedef taklitçiliği (eTM)79,80, eTM tabanlı miRNA taklitleri (MIM'ler)35,78, kısa tandem hedef taklitleri (STTM'ler)22,53, protein kodlama transkriptlerinin 3' UTR'sine entegre TM'lere sahip bir miRNA yem yaklaşımı81 ve miRNA'ları (CMSP'ler) hedeflemek için iki merkezi uyumsuzluğa sahip miRNA bağlama bölgeleri içeren miRNA SPONG'ları 82. STTM, ampirik olarak optimize edilmiş 48 nt'lik bir aralayıcı ile bağlantılı, 3 nt uyumsuz şişkinliğe sahip iki miRNA bağlama sitesinden oluşur. STTM, hedef miRNA'ların22,53'ün verimli inhibisyonunu tetikler. STTM teknolojisi son zamanlarda model bitki Arabidopsis ve pirinç ve mısır gibi büyük mahsullerden miRNA'ların büyük ölçekli fonksiyonel analizine başarıyla uygulanmıştır. Bu, mahsul ıslahını iyileştirmede büyük umut vaat eden verim ve hormon kontrolünde yer alan birkaç endojen miRNA'nın benzeri görülmemiş rollerinin keşfedilmesine yol açtı47. STTM tasarımının bu avantajlarına dayanarak, STTM'yi seçtik ve patatesteki miRNA'ların işlevsel karakterizasyonu için PVX vektörüne entegre ettik. CMSP'ler, MIM'ler ve STTM'ler gibi TM moleküllerinin çeşitli tasarımlarının farklı miRNAs82'nin işlevini engellemede değişken etkililiklere sahip olduğunu belirtmek gerekir. Bu nedenle, çeşitli TM tasarım stratejileri kullanmak daha etkili miRNA bastırma elde etmeye yardımcı olabilir. Eşsiz şişkinliğin uzunluğu ve dizi bağlamının yanı sıra miRNA bağlama bölgelerine bitişik nükleotid değişikliklerinin de belirli bir miRNA susturma sonucu için optimize edilmesi gerekebilir22,36,38,78,83. Ayrıca, deneysel analiz ile birlikte hesaplamalı tahminlerin rehberliğinde TM moleküllerinin tasarımı muhtemelen miRNAs84'ün daha güvenilir inhibisyonunu sağlayacaktır.
PVX tabanlı VIGS sisteminin hem diploid hem de ekili tetraploid Solanum türlerinde RNA susturma tetiklemesinde etkili olduğu gösterilmiştir. PVX tabanlı sistemik susturma, in vitro yayılımlı patates bitkilerinde ve in vitro olarak üretilen mikro yumrularda yaprak dokuları boyunca indüklenmiş ve korunur85. Son zamanlarda PVX tabanlı VIGS sisteminin Ancilla, Arran Pilot, Marius Bard ve Serrana86 gibi çeşitli tetraploid patates kültivatörlerinde ilgi genlerini susturabileceğini bildirdik. PVX tabanlı VbMS etkisinin patateste vejetatif yayılma yoluyla birkaç nesil boyunca bulaşıp sürdürülemeyeceği belirlenmeye devam etmektedir. TM moleküllerini patates bitkilerine saptırmak için transgenik yaklaşımlar, sonraki nesillerde ilgi çekici miRNA'ların susturma etkilerinin sürdürülmesi gerektiğinde hala tavsiye edilir.
Patates büyümesi ve gelişmesinde rol oynayan çok sayıda miRNA tespit edilmiştir. RNA-seq, genom dizilimi ve biyoinformatik tahmin, miRNA'ların ve hedeflerinin tanımlanmasını büyük ölçüde kolaylaştırmış 17,19,20,21. Şimdiye kadar, iki katı monoploid S. tuberosum Grubu Phureja klonu DM1-3, vahşi bir diploid türü S. commersonii ve S. chacoense87,88,89'un diploid inbred klonu M6 dahil olmak üzere üç patates genomu sıralandı. Güncel olarak, çoğu durumda TM teknolojisini kullanarak sadece sınırlı sayıda patates miRNA'sı işlevsel olarak karakterize edilmiştir. Örneğin, ÇİÇEKLİ LOCUS T (FT) homolog SP6A, patateste yumrulaşmayı kontrol etmek için mobil bir sinyal görevi görür ve SP6A transkriptinin ısı kaynaklı bölünmesine aracılık eden SP6A 'nın (SES) ifadesini baskılayan bir miRNA tarafından hedeflenir90,91. SES'in STTM aracılı aşırı ifadesi SES miRNA'nın aktivitesini engeller ve sürekli ısı koşullarında bile yumrulaşmayı kolaylaştırır91. İmmün yanıtta yer alan bir miRNA olan miR160'ın eTM yaklaşımı ile devrilmesi, patates92'de Phytophthora istilacılarına karşı hem lokal hem de sistemik edinilmiş dirençte miR160'ın gerekli olduğunu göstermiştir.
Biyoinformatik bir yaklaşım kullanılarak, patates ve domatesteki nükleotid bağlama bölgesi lösin bakımından zengin tekrar (NLR) immün reseptörlerini hedefleyen sekiz benzersiz miRNA ailesi tespit edildi93. MiRNA ailelerinden biri olan miR482/2118, çeşitli patojenlere karşı direnç sağlayan ve STTM yapılarının transgenik ekspresyonu ile aracılık edilen miR482/2118 ailesi miRNA'larının baskılanması, domateste P. infestans ve Pseudomonas syringae13'e karşı gelişmiş direnç gösterir. Artan kanıtlar, patojenlerde ve konakçılarda üretilen küçük RNA'ların iki organizma arasında seyahat edebildiğine ve krallıklar arası RNA parazitinin aracılık ettiği birbirlerinin gen ekspresyonını bastırabildiğine işaret ediyor94,95,96,97. Örneğin, oomycete patojen türevi sRNA'ların hedef taklitleri bu istilacı sRNA'ları çöpe atabilir ve patojen enfeksiyonunu azaltabilir61. Mevcut VbMS sisteminin, bitkilerdeki direnci artırmak için patojen türevi sRNA'ları hedeflemek için kullanılıp kullanılmayacağını incelemek ilginç olacaktır.
Özetle, virüs tabanlı miRNA susturma sistemi hızlı ve uygun maliyetlidir ve yüksek aktarım hızı biçiminde gerçekleştirilebilir. PVX tabanlı VbMS sistemi, belirli miRNA'ların veya miRNA ailelerinin ve hedef genlerin işlevini belirlemek için verimli ve sağlam bir genetik araç sağlar.

Bitki mikroRNA'ları (miRNA'lar) 20-24 nükleotid uzunluğunda, nükleer kodlu düzenleyici RNA'lar1 olarak karakterize edilir ve büyüme ve gelişme2,3, fotosentez ve metabolizma4,5,6,7, hormon sentezi ve sinyalizasyon8,9, biyotik ve abiyotik yanıtlar dahil olmak üzere bitki biyolojik süreçlerinin hemen hemen her alanında temel roller oynar10, 11,12,13 ve besin ve enerji düzenlemesi14,15. Tesis miRNA'larının düzenleyici rolleri iyi programlanır ve genellikle transkripsiyon sonrası seviyelerde hedef mRNA'ları ayırarak veya çeviriyle bastırarak yerine getirilir.
Patateste miRNA'ların tanımlanması, transkripsiyonal profil oluşturma ve hedef tahminine doğru muazzam ilerleme kaydedildi16,17,18,19,20,21. Bununla birlikte, patates de dahil olmak üzere bitkilerdeki miRNA'ların fonksiyonel karakterizasyonu, verimli ve yüksek verimli genetik yaklaşımların olmaması nedeniyle diğer organizmaların gerisinde kaldı. Standart fonksiyon kaybı analizi ile bireysel miRNA'nın fonksiyonel analizini yapmak zordur, çünkü çoğu miRNA önemli genetik artıklığa sahip ailelere aittir22. Buna ek olarak, tek bir miRNA birden fazla hedef geni kontrol edebilir23 ve birkaç farklı miRNA aynı moleküler yolu işbirliği içinde modüle edebilir24,25. Bu özellikler, belirli bir miRNA veya miRNA ailesinin işlevini karakterize etmeyi zorlaştırır.
MiRNA'ların fonksiyonel analizinin çoğu, belirgin sınırlamaları olan işlev kazancı yaklaşımlarına büyük ölçüde güvenmektedir. Yapay miRNA (amiRNA) yöntemi, miRNA'ları yüksek düzeyde üretmek için endojen primer transkriptlerden (pri-miRNA' lar) yararlanır ve hedef gen ekspresyonunun inhibisyonunu önler26,27,28,29. Bununla birlikte, güçlü bir constitutive 35S promotörü kullanarak aktivasyon etiketleme ve miRNA aşırı ekspresyonu genellikle in vivo koşulları temsil etmeyen ve bu nedenle miRNAs30'un endojen işlevini yansıtmayabilecek miRNA'ların yüksek ekspresyonuna yol açar. Bağlama ve/veya bölünme bölgelerinde temizlenemez mutasyonlar içeren hedef genlerin miRNA'ya dirençli formlarının ekspresyonini içeren alternatif bir yaklaşım geliştirilmiştir31,32,33. Ancak bu yaklaşım, transgenik eserler nedeniyle miRNA dirençli hedef transgeneden türetilen fenotipin yanlış yorumlanmasına da neden olabilir. Bu nedenle, bu fonksiyon kazanım çalışmalarından sonuçlar dikkatle çıkarılmalıdır34. Yukarıda açıklanan yaklaşımların bir diğer önemli sınırlaması, emek yoğun ve zaman alıcı olan dönüşümü gerektirmeleridir. Ayrıca, transgene bağımlı yaklaşımlar dönüşüm-recalcitrant bitki türleri için neredeyse geçerli değil. Bu nedenle, miRNA'ların işlevini çözmek için hızlı ve verimli bir işlev kaybı yaklaşımı geliştirmek önemlidir.
Dönüştürme prosedürünün ön koşulunı atlamak için, hedef mimik (TM) stratejilerini virüs türevli vektörlerle birleştirerek virüs tabanlı mikroRNA susturma (VbMS) oluşturulmuştur. VbMS sisteminde, yapay olarak tasarlanmış TM molekülleri geçici olarak bir virüs omurgasından ifade edilir ve bitki endojen miRNA'ların işlevini parçalamak için güçlü, yüksek verim ve zaman kazandıran bir araç sunar35,36. VbMS başlangıçta tütün çıngırak virüsü (TRV)35,36,37 ile N. benthamiana ve domates geliştirilmiştir ve Arabidopsis genişletilmiştir, pamuk, buğday ve mısır, patates virüsü X (PVX)38, pamuk yaprağı buruşuk virüs (ClCrV)39, salatalık mozaik virüsü (CMV)40,41,42, Çin buğday mozaik virüsü (CWMV)43 dahil olmak üzere diğer çeşitli virüs ifade sistemlerini kullanarak ve arpa şerit mozaik virüs (BSMV)44,45.
Patates (Solanum tuberosum), yüksek besin değeri, yüksek enerji üretimi ve nispeten düşük girdi gereksinimleri nedeniyle dünyanın en önemli dördüncü gıda ürünü ve en yaygın olarak yetiştirilen noncereal mahsulüdür46. Patatesin çeşitli özellikleri onu çekici bir dikotilendonöz model bitki yapar. Yüksek outcrossing oranı, heterozygozite ve genetik çeşitliliğe sahip bitkisel olarak yayılan bir poliploid mahsulüdür. Bununla birlikte, bugüne kadar, VbMS kullanarak patatesteki miRNA'ların işlevini karakterize eden bir rapor yoktur. Burada, patates bitkilerinde miRNA'ların işlevini değerlendirmek için ligasyondan bağımsız klonlama (LIC) uyarlanmış patates PVX tabanlı VbMS yaklaşımını sunuyoruz38. MiR165/166 ailesini VbMS testini göstermek için seçtik, çünkü miR165/166 ailesi ve hedef mRNA'ları ve Sınıf III homeodomain/Leu fermuarı (HD-ZIP III) transkripsiyon faktörleri 22.47.48 olarak kapsamlı bir şekilde karakterize edilmiştir. HD-ZIP III genleri meristem gelişimin ve organ polaritesinin temel düzenleyicileridir ve miR165/166 işlevinin bastırılması HD-ZIP III genlerinin ekspresyonunun artmasına neden olarak, apikal hakimiyetin azalması ve yaprak polaritesinin anormal örüntüleri gibi pleotropik gelişimsel kusurlara neden oluyor22,35,38,41 . MiRNA165/166'nın susturuğu ile ilişkili kolayca dekore edilebilir gelişimsel fenotipler, PVX tabanlı VbMS testinin etkinliğinin doğru bir şekilde değerlendirilmesini sağlar.
Bu çalışmada, PVX tabanlı VbMS sisteminin patatesteki miRNA'ların işlevini etkili bir şekilde engelleyebileceğini gösteriyoruz. PVX tabanlı virüs kaynaklı gen susturma (VIGS) sistemi bir dizi patates çeşidinde kurulduğundan49,50,51,52, bu PVX tabanlı VbMS yaklaşımı büyük olasılıkla çok çeşitli diploid ve tetraploid patates türlerine uygulanabilir.

<table><tbody><tr><td>100 &amp;micro;M dATP and 100 &amp;micro;M dTTP</td><td>Omega Bio-tek, Inc., Norcross, Norcross, GA 30071 , USA</td><td>TQAC136</td><td></td></tr><tr><td>3 M Sodium acetate, pH 4.0.</td><td>Teknova, Hollister, CA 95023, USA</td><td>#S0297</td><td></td></tr><tr><td>Acetosyringone</td><td>TCI America, Portland, OR 97203, USA</td><td>D2666-25G</td><td></td></tr><tr><td>Agrobacterium tumefaciens strains: GV3101, GV2260 or EHA105.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA</td><td>VWRV0757-950ML</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide, DMSO</td><td>TCI America, Portland, OR 97203, USA</td><td>D0798-25G</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA</td><td>VWRV0281-25G</td><td></td></tr><tr><td>E. coli DB3.1</td><td></td><td></td><td>for maintenance of PVX-LIC and pTRV2e containing the ccdB gene</td></tr><tr><td>E. coli DH5&amp;alpha;</td><td></td><td></td><td>for the destination constructs generated by LIC cloning</td></tr><tr><td>Fertilizer: Peters Peat Lite Special 15-0-15 Dark Weather Feed</td><td>ICL Specialty Fertilizers, Summerville, SC 29483, USA</td><td>G99260</td><td></td></tr><tr><td>High fidelity PCR reagents: KAPA HiFi DNA Polymerase with dNTPs</td><td>Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems,&lt;br/&gt; Wilmington, MA, USA</td><td>7958960001</td><td></td></tr><tr><td>Isoamyl alcohol</td><td>VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA</td><td>VWRV0944-1L</td><td></td></tr><tr><td>Koptec Pure Ethanol &amp;ndash; 200 Proof</td><td>Decon Labs, King of Prussia, PA 19406 , USA</td><td>V1005M</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>TCI America, Portland, OR 97203, USA</td><td>M0606-250G</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA</td><td>MFCD00149781</td><td></td></tr><tr><td>M-MuLV Reverse Transcriptase</td><td>New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA</td><td>M0253L</td><td></td></tr><tr><td>Nano-drop spectrometer: NanoDrop One&lt;sup&gt;C&lt;/sup&gt; Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi</td><td>ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA</td><td>ND-ONEC-W</td><td></td></tr><tr><td>PCR machine: Bio-Rad MyCycler PCR System</td><td>Bio-Rad, Hercules, California 94547, USA</td><td>170-9703</td><td></td></tr><tr><td>PCR machine: Eppendorf Mastercycler pro</td><td>Eppendorf, Hauppauge, NY 11788, USA</td><td>950030010</td><td></td></tr><tr><td>pH meter</td><td>Sper Scientific, Scottsdale, AZ 85260, USA</td><td>Benchtop pH / mV Meter - 860031</td><td></td></tr><tr><td>Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1), pH 6.7/8.0.</td><td>VWR Corporate, Radnor, PA 19087-8660, USA</td><td>VWRV0883-400ML</td><td></td></tr><tr><td>Phytagel: Gellan Gum</td><td>Alfa Aesar, Tewksbury, MA 01876, USA</td><td>J63423-A1</td><td></td></tr><tr><td>PVX VIGS vector: PVX-LIC</td><td></td><td></td><td>Zhao et al., 2016</td></tr><tr><td>Real-time PCR machine: QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System</td><td>ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA</td><td>4485697</td><td></td></tr><tr><td>Real-time PCR reagent: KAPA SYBR&amp;reg; FAST qPCR Master Mix (2x) Kit</td><td>Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems,&lt;br/&gt; Wilmington, MA 01887, USA</td><td>7959389001</td><td></td></tr><tr><td>Restriction enzyme: SmaI</td><td>New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA</td><td>R0141S</td><td></td></tr><tr><td>Reverse transcription reagents: qScript cDNA SuperMix</td><td>Quanta BioSciences, Gaithersburg, MD 20877 , USA</td><td>95107-100</td><td></td></tr><tr><td>RNA extraction Kit: E.Z.N.A. Plant RNA Kit</td><td>Omega Bio-tek, Inc., Norcross, Norcross, GA 30071 , USA</td><td>SKU: D3485-01</td><td></td></tr><tr><td>RNase Inhibitor Murine</td><td>New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA</td><td>M0314L</td><td></td></tr><tr><td>RNAzol RT</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63103, USA</td><td>R4533</td><td></td></tr><tr><td>Soil: Metro-Mix 360</td><td>Sun Gro Horticulture, Agawam, MA 01001-2907, USA</td><td>Metro-Mix 360</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA polymerase and buffer</td><td>New England BioLabs, Ipswich, MA 01938-2723 USA</td><td>M0203S</td><td></td></tr></tbody></table>

potato virus x-based microrna silencing (vbms) in potato.

Virüs bazlı mikroRNA susturma (VbMS), bitkilerdeki mikroRNA'ların (miRNA'lar) fonksiyonel karakterizasyonu için hızlı ve verimli bir araçtır. VbMS sistemi Nicotiana benthamiana, domates, Arabidopsis, pamuk ve buğday ve mısır gibi monokot bitkileri de dahil olmak üzere çeşitli bitki türleri için geliştirilmiş ve uygulanmıştır. Burada, patatesteki endojen miRNA'ları susturmak için PVX tabanlı VbMS vektörlerini kullanarak ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz. Belirli bir miRNA'nın ifadesini yıkmak için, ilgi çekici miRNA'nın hedef mimik (TM) molekülleri tasarlanmış, bitki virüs vektörlerine entegre edilmiş ve patateste Agrobacterium infiltration ile doğrudan ilgi çekici sonojen miRNA'ya bağlanmak ve işlevini engellemek için ifade edilir.

Şekil 2 , PVX-STTM165/166 patates bitkilerini (Katahdin) damarlar boyunca yaprak laminanın abaksiyel tarafından yaprak dokularının ektopik büyümesi ile göstermektedir. Trompet şeklinde yaprak oluşumu gibi daha şiddetli fenotipler de gözlenmiştir. Buna karşılık PVX kontrol tesislerinde fenotipik anormallik gözlenmedi. Bu sonuçlar, VbMS sisteminin tetraploid patates bitkilerinde endojen miRNA fonksiyonunu bastırmada etkili olduğunu ve PVX-VbMS sisteminin spesifik miRNA'ların veya miRNA ailelerinin işlevini belirlemek için sağlam bir genetik araç olduğunu göstermektedir.
Şekil 3 , PVX-STTM165/166 patates bitkilerini (Russet Burbank) damarlar boyunca yaprak laminasının abaksiyel tarafından ektopik yaprak dokusu büyümesi ile göstermektedir. Bu sonuçlar, PVX-VbMS sisteminin büyük bir patates cultivar da dahil olmak üzere diğer patates türlerine uygulanabileceğini göstermektedir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61067/61067fig1.jpg"> Şekil 1: PVX tabanlı VbMS vektörlerinin şematik diyagramı ve PVX-STTM165/166 yapısı. LB = T-DNA sol kenarlık; RB = T-DNA sağ kenarlığı; 35S = karnabahar mozaik virüs 35S promotörü; NOST = nopaline synthase sonlandırıcı; RdRP = RNA'ya bağımlı RNA polimeraz; TGB1 = üçlü gen bloğu proteini 1; TGB2 = üçlü gen bloğu proteini 2; TGB3 = üçlü gen bloğu proteini 3; sgP = PVX subgenomik RNA promotörü; CP = kat proteini; LIC Kaset = ligasyondan bağımsız klonlama kaseti; 48 nt = 48 nükleotid kusurlu kök döngü bağlayıcısı. STTM165/166, 48 nt kusurlu kök döngü bağlayıcı dizisi ile ayrılmış miR165/166'nın tandem TM dizilerinden oluşur. PVX-LIC vektöründeki yeşil ok ucu, STTM dizisini barındıran PVX altgenomik RNA'nın başlangıç bölgesini gösterir. MiRNA dizilerindeki üçlü eksi tireler bölünme bölgelerini gösterir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61067/61067fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61067/61067fig2.jpg"> Şekil 2: Tetraploid patates çeşidi Katahdin'de miR165/166 VbMS. PVX vektör kontrolünü veya PVX-STTM165/166'yı ifade eden patates bitkilerinin (Katahdin) fenotipleri. Macenta okları yaprak damarlarında ektopik olarak oluşturulan yaprak yapılarını gösterir. Turuncu ok ucu trompet benzeri yaprak yapılarını gösterir. Çubuklar = 1 cm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61067/61067fig2large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61067/61067fig3.jpg"> Şekil 3: Tetraploid patates çeşidi Russet Burbank'te miR165/166 vbMS. PVX vektörü kontrol veya PVX-STTM165/166 olarak ifade eden patates bitkilerinin fenotipleri (Russet Burbank). Macenta okları yaprak damarlarında ektopik olarak oluşturulan yaprak yapılarını gösterir. Çubuklar = 1 cm. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61067/61067fig3large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Şekil 1: MiRNA'ların kök döngü RT-PCR analizinin şematik diyagramları ve gerçek zamanlı PCR astar tasarımı. (A) MiRNA'ların kök-döngü RT-PCR analizi. Ters transkripsiyon sırasında, kök döngü astarının 3' miRNA'ya bağlanması ters transkripsiyon başlattı ve cDNA sentezlendi. PCR ürünleri, ilgi çekici miRNA'nın belirli bir ileri astarı ve evrensel ters astar ile güçlendirildi. (B) Gerçek zamanlı PCR astar tasarımı. Stu-miR160 ve Stu-miR165/166 için ileri ve ters astarlar gösterilir. İleri astar miRNA dizisine göre tasarlanmıştır, ancak tasarlanmış kök döngü ters transkripsiyon astarı ile çakılan dizileri içermez. Uzunluğu, erime sıcaklığını ve GC içeriğini ayarlamak için ileri astarın 5' kısmına 3–7 nt'lik bir uzantı eklendi. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61067/61067supfig1large.jpg" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Potato Virus X-Based microRNA Silencing VbMS In Potato. at JoVE.com

Potato Virus X-Based microRNA Silencing VbMS In Potato.

Patatesteki endojen mikroRNA'ları (miRNA'lar) işlevsel olarak karakterize etmek için patates virüsü X (PVX) bazlı mikroRNA susturma (VbMS) sistemi için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. İlgi çekici miRNA hedef mimik (TM) molekülleri PVX vektörüne entegre edilir ve hedef miRNA veya miRNA ailesini susturmak için patatesle geçici olarak ifade edilir.

Patates virüsü X bazlı mikroRNA Susturma (VbMS) Patateste.

Virus-based microRNA silencing (VbMS) is a rapid and efficient tool for functional characterization of microRNAs (miRNAs) in plants. The VbMS system has ...

potato-virus-x-based-microrna-silencing-vbms-in-potato

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Environment

Potato Virus X-Based microRNA Silencing (VbMS) In Potato.

3.1K Görüntüleme.  Texas A&M University System. Patatesteki endojen mikroRNA'ları (miRNA'lar) işlevsel olarak karakterize etmek için patates virüsü X (PVX) bazlı mikroRNA susturma (VbMS) sistemi için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. İlgi çekici miRNA hedef mimik (TM) molekülleri PVX vektörüne entegre edilir ve hedef miRNA veya miRNA ailesini susturmak için patatesle geçici olarak ifade edilir.

Video: Potato Virus X-Based microRNA Silencing VbMS In Potato.

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being investigated for applications in imaging and therapy. Viral nanoparticles (VNPs) derived from plants can be regarded as self-assembled bionanomaterials with defined sizes and shapes. Plant viruses under investigation in the Steinmetz lab include icosahedral particles formed by Cowpea mosaic virus (CPMV) and Brome mosaic virus (BMV), both of which are 30 nm in diameter. We are also developing rod-shaped and filamentous structures derived from the following plant viruses: Tobacco mosaic virus (TMV), which forms rigid rods with dimensions of 300 nm by 18 nm, and Potato virus X (PVX), which form filamentous particles 515 nm in length and 13 nm in width (the reader is referred to refs. 1 and 2 for further information on VNPs).
From a materials scientist's point of view, VNPs are attractive building blocks for several reasons: the particles are monodisperse, can be produced with ease on large scale in planta, are exceptionally stable, and biocompatible. Also, VNPs are "programmable" units, which can be specifically engineered using genetic modification or chemical bioconjugation methods 3. The structure of VNPs is known to atomic resolution, and modifications can be carried out with spatial precision at the atomic level4, a level of control that cannot be achieved using synthetic nanomaterials with current state-of-the-art technologies.
In this paper, we describe the propagation of CPMV, PVX, TMV, and BMV in Vigna ungiuculata and Nicotiana benthamiana plants. Extraction and purification protocols for each VNP are given. Methods for characterization of purified and chemically-labeled VNPs are described. In this study, we focus on chemical labeling of VNPs with fluorophores (e.g. Alexa Fluor 647) and polyethylene glycol (PEG). The dyes facilitate tracking and detection of the VNPs 5-10, and PEG reduces immunogenicity of the proteinaceous nanoparticles while enhancing their pharmacokinetics 8,11. We demonstrate tumor homing of PEGylated VNPs using a mouse xenograft tumor model. A combination of fluorescence imaging of tissues ex vivo using Maestro Imaging System, fluorescence quantification in homogenized tissues, and confocal microscopy is used to study biodistribution. VNPs are cleared via the reticuloendothelial system (RES); tumor homing is achieved passively via the enhanced permeability and retention (EPR) effect12. The VNP nanotechnology is a powerful plug-and-play technology to image and treat sites of disease in vivo. We are further developing VNPs to carry drug cargos and clinically-relevant imaging moieties, as well as tissue-specific ligands to target molecular receptors overexpressed in cancer and cardiovascular disease.

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Plant viral nanoparticles (VNPs) are promising platforms for applications in biomedicine. Here, we describe the procedures for plant VNP propagation, purification, characterization, and bioconjugation. Finally, we show the application of VNPs for tumor homing and imaging using a mouse xenograft model and fluorescence imaging.

Viral Nanopartiküller<em&gt; In vivo</em&gt; Tümör Görüntüleme

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being ...

Biyomühendislik

Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation of Potato and the Promoter Activity of a Suberin Gene by GUS Staining

Agrobacterium sp. is one of the most widely used methods to obtain transgenic plants as it has the ability to transfer and integrate its own T-DNA into the plant&#39;s genome. Here, we present two transformation systems to genetically modify potato (Solanum tuberosum) plants. In A. tumefaciens transformation, leaves are infected, the transformed cells are selected and a new complete transformed plant is regenerated using phytohormones in 18 weeks. In A. rhizogenes transformation, stems are infected by injecting the bacteria with a needle, the new emerged transformed hairy roots are detected using a red fluorescent marker and the non-transformed roots are removed. In 5-6 weeks, the resulting plant is a composite of a wild type shoot with fully developed transformed hairy roots. To increase the biomass, the transformed hairy roots can be excised and self-propagated. We applied both Agrobacterium-mediated transformation methods to obtain roots expressing the GUS reporter gene driven by a suberin biosynthetic gene promoter. The GUS staining procedure is provided and allows the cell localization of the promoter induction. In both methods, the transformed potato roots showed GUS staining in the suberized endodermis and exodermis, and additionally, in A. rhizogenes transformed roots the GUS activity was also detected in the emergence of lateral roots. These results suggest that A. rhizogenes can be a fast alternative tool to study the genes that are expressed&#160;in roots.

Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation of Potato and the Promoter Activity of a Suberin Gene by GUS Staining

Here, we present two protocols to transform potato plants. The Agrobacterium tumefaciens transformation leads to a complete transgenic plant while the Agrobacterium rhizogenes produces transgenic hairy roots in a wild type shoot that can be self-propagated. We then detect promoter activity by GUS staining in the transformed roots.

Agrobacterium tumefaciens ve Agrobacterium rhizogenes-aracılı dönüştürme, patates ve GUS Staining tarafından Suberin gen organizatörü etkinliği

Agrobacterium sp. is one of the most widely used methods to obtain transgenic plants as it has the ability to transfer and integrate its own T-DNA into ...

Çevre

Screening and Identification of RNA Silencing Suppressors from Secreted Effectors of Plant Pathogens

RNA silencing is an evolutionarily conserved, sequence-specific gene regulation mechanism in eukaryotes. Several plant pathogens have evolved proteins with the ability to inhibit the host plant RNA silencing pathway. Unlike virus effector proteins, only several secreted effector proteins have showed the ability to suppress RNA silencing in bacterial, oomycete, and fungal pathogens, and the molecular functions of most effectors remain largely unknown. Here, we describe in detail a slightly modified version of the co-infiltration assay that could serve as a general method for observing RNA silencing and for characterizing effector proteins secreted by plant pathogens. The key steps of the approach are choosing the healthy and fully developed leaves, adjusting the bacteria culture to the appropriate optical density (OD) at 600 nm, and observing green fluorescent protein (GFP) fluorescence at the optimum time on the infiltrated leaves in order to avoid omitting effectors with weak suppression activity. This improved protocol will contribute to rapid, accurate, and extensive screening of RNA silencing suppressors and serve as an excellent starting point for investigating the molecular functions of these proteins.

Here, we present a modified screening method that can be extensively used to quickly screen RNA silencing suppressors in plant pathogens.

Bitki Patojenlerinin Gizli Efektörlerinden RNA Susturucu Baskılayıcıların Taranması ve Tanımlanması

RNA silencing is an evolutionarily conserved, sequence-specific gene regulation mechanism in eukaryotes. Several plant pathogens have evolved proteins ...

Genetik

VIGS-Mediated Forward Genetics Screening for Identification of Genes Involved in Nonhost Resistance

Nonhost disease resistance of plants against bacterial pathogens is controlled by complex defense pathways. Understanding this mechanism is important for developing durable disease-resistant plants against wide range of pathogens. Virus-induced gene silencing (VIGS)-based forward genetics screening is a useful approach for identification of plant defense genes imparting nonhost resistance. Tobacco rattle virus (TRV)-based VIGS vector is the most efficient VIGS vector to date and has been efficiently used to silence endogenous target genes in Nicotiana benthamiana.

	In this manuscript, we demonstrate a forward genetics screening approach for silencing of individual clones from a cDNA library in N. benthamiana and assessing the response of gene silenced plants for compromised nonhost resistance against nonhost pathogens, Pseudomonas syringae pv. tomato T1, P. syringae pv. glycinea, and X. campestris pv. vesicatoria. These bacterial pathogens are engineered to express GFPuv protein and their green fluorescing colonies can be seen by naked eye under UV light in the nonhost pathogen inoculated plants if the silenced target gene is involved in imparting nonhost resistance. This facilitates reliable and faster identification of gene silenced plants susceptible to nonhost pathogens. Further, promising candidate gene information can be known by sequencing the plant gene insert in TRV vector. Here we demonstrate the high throughput capability of VIGS-mediated forward genetics to identify genes involved in nonhost resistance. Approximately, 100 cDNAs can be individually silenced in about two to three weeks and their relevance in nonhost resistance against several nonhost bacterial pathogens can be studied in a week thereafter. In this manuscript, we enumerate the detailed steps involved in this screening. VIGS-mediated forward genetics screening approach can be extended not only to identifying genes involved in nonhost resistance but also to studying genes imparting several biotic and abiotic stress tolerances in various plant species.

Virus-induced gene silencing is an useful tool for identifying genes involved in nonhost resistance of plants. We demonstrate the use of bacterial pathogens expressing GFPuv in identifying gene silenced plants susceptible to nonhost pathogens. This approach is easy, fast and facilitates large scale screening and similar protocol can be applied to studying various other plant-microbe interactions.

Genler belirlenmesi için VIGS-aracılığı ile İleri Genetik Tarama konakçı olmayan Direnç ilgilendim


	Nonhost disease resistance of plants against bacterial pathogens is controlled by complex defense pathways. Understanding this mechanism is important ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA regulators: microRNAs, which are produced from non-protein coding genes and short interfering RNAs (siRNAs). Plants use RNAi to control transposons and to exert tight control over developmental processes such as flower organ formation and leaf development2,3,4. Plants also use RNAi to defend themselves against infection by viruses. Consequently, many viruses have evolved suppressors of gene silencing to allow their successful colonization of their host5.
Virus-induced gene silencing (VIGS) is a method that takes advantage of the plant RNAi-mediated antiviral defense mechanism. In plants infected with unmodified viruses the mechanism is specifically targeted against the viral genome. However, with virus vectors carrying sequences derived from host genes, the process can be additionally targeted against the corresponding host mRNAs. VIGS has been adapted for high-throughput functional genomics in plants by using the plant pathogen Agrobacterium tumefaciens to deliver, via its Ti plasmid, a recombinant virus carrying the entire or part of the gene sequence targeted for silencing. Systemic virus spread and the endogenous plant RNAi machinery take care of the rest. dsRNAs corresponding to the target gene are produced and then cleaved by the ribonuclease Dicer into siRNAs of 21 to 24 nucleotides in length. These siRNAs ultimately guide the RNA-induced silencing complex (RISC) to degrade the target transcript2.
Different vectors have been employed in VIGS and one of the most frequently used is based on tobacco rattle virus (TRV). TRV is a bipartite virus and, as such, two different A. tumefaciens strains are used for VIGS. One carries pTRV1, which encodes the replication and movement viral functions while the other, pTRV2, harbors the coat protein and the sequence used for VIGS6,7. Inoculation of Nicotiana benthamiana and tomato seedlings with a mixture of both strains results in gene silencing. Silencing of the endogenous phytoene desaturase (PDS) gene, which causes photobleaching, is used as a control for VIGS efficiency. It should be noted, however, that silencing in tomato is usually less efficient than in N. benthamiana. RNA transcript abundance of the gene of interest should always be measured to ensure that the target gene has efficiently been down-regulated. Nevertheless, heterologous gene sequences from N. benthamiana can be used to silence their respective orthologs in tomato and vice versa8.

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

Description of a virus-induced gene silencing (VIGS) method for knock-down of gene expression in Nicotiana benthamiana and tomato.

Virüs indüklenen gen susturma (VIGS) Nicotiana benthamiana Ve Domates

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

Biyoloji

RNA Blot Analysis for the Detection and Quantification of Plant MicroRNAs

MicroRNAs (miRNAs) are a class of endogenously expressed non-coding, ~21 nt small RNAs involved in the regulation of gene expression in both plants and animals. Most miRNAs act as negative switches of gene expression targeting key genes. In plants, primary miRNAs (pri-miRNAs) transcripts are generated by RNA polymerase II, and they form varying lengths of stable stem-loop structures called pre-miRNAs. An endonuclease, Dicer-like1, processes the pre-miRNAs into miRNA-miRNA* duplexes. One of the strands from miRNA-miRNA* duplex is selected and loaded onto Argonaute 1 protein or its homologs to mediate the cleavage of target mRNAs. Although miRNAs are key signaling molecules, their detection is often carried out by less than optimal PCR-based methods instead of a sensitive northern blot analysis. We describe a simple, reliable, and extremely sensitive northern method that is ideal for the quantification of miRNA levels with very high sensitivity, literally from any plant tissue. Additionally, this method can be used to confirm the size, stability and the abundance of miRNAs and their precursors.

This method demonstrates use of the northern hybridization technique to detect miRNAs from total RNA extract.

Bitki MikroRNAlarının Saptanması ve Ölçülmesi için RNA Leke Analizi

MicroRNAs (miRNAs) are a class of endogenously expressed non-coding, ~21 nt small RNAs involved in the regulation of gene expression in both plants and ...

Biyokimya

MicroRNA-based Regulation of Picornavirus Tropism

Cell-specific restriction of viral replication without concomitant attenuation can benefit vaccine development, gene therapy, oncolytic virotherapy, and understanding the biological properties of viruses. There are several mechanisms for regulating viral tropism, however they tend to be virus class specific and many result in virus attenuation. Additionally, many viruses, including picornaviruses, exhibit size constraints that do not allow for incorporation of large amounts of foreign genetic material required for some targeting methods. MicroRNAs are short, non-coding RNAs that regulate gene expression in eukaryotic cells by binding complementary target sequences in messenger RNAs, preventing their translation or accelerating their degradation. Different cells exhibit distinct microRNA signatures and many microRNAs serve as biomarkers. These differential expression patterns can be exploited for restricting gene expression in cells that express specific microRNAs while maintaining expression in cells that do not. In regards to regulating viral tropism, sequences complementary to specific microRNAs are incorporated into the viral genome, generally in the 3' non-coding regions, targeting them for destruction in the presence of the cognate microRNAs thus preventing viral gene expression and/or replication. MicroRNA-targeting is a technique that theoretically can be applied to all viral vectors without altering the potency of the virus in the absence of the corresponding microRNAs. Here we describe experimental methods associated with generating a microRNA-targeted picornavirus and evaluating the efficacy and specificity of that targeting in vitro. This protocol is designed for a rapidly replicating virus with a lytic replication cycle, however, modification of the time points analyzed and the specific virus titration readouts used will aid in the adaptation of this protocol to many different viruses.

We describe here a method for regulating picornavirus tropism by incorporating sequences complementary to specific microRNAs into the viral genome. This protocol can be adapted to all different classes of viruses with modifications based upon the length and nature of their life cycle.

Picornavirüs tropizm MicroRNA tabanlı Yönetmelik

Cell-specific restriction of viral replication without concomitant attenuation can benefit vaccine development, gene therapy, oncolytic virotherapy, and ...

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

Agroinfiltration and PVX agroinfection are two efficient transient expression assays for functional analysis of candidate genes in plants. The most commonly used agent for agroinfiltration is Agrobacterium tumefaciens, a pathogen of many dicot plant species. This implies that agroinfiltration can be applied to many plant species. Here, we present our protocols and expected results when applying these methods to the potato (Solanum tuberosum), its related wild tuber-bearing Solanum species (Solanum section Petota) and the model plant Nicotiana benthamiana. In addition to functional analysis of single genes, such as resistance (R) or avirulence (Avr) genes, the agroinfiltration assay is very suitable for recapitulating the R-AVR interactions associated with specific host pathogen interactions by simply delivering R and Avr transgenes into the same cell. However, some plant genotypes can raise nonspecific defense responses to Agrobacterium, as we observed for example for several potato genotypes. Compared to agroinfiltration, detection of AVR activity with PVX agroinfection is more sensitive, more high-throughput in functional screens and less sensitive to nonspecific defense responses to Agrobacterium. However, nonspecific defense to PVX can occur and there is a risk to miss responses due to virus-induced extreme resistance. Despite such limitations, in our experience, agroinfiltration and PVX agroinfection are both suitable and complementary assays that can be used simultaneously to confirm each other&#39;s results.

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

Agroinfiltration and PVX agroinfection are routine functional assays for transient ectopic expression of genes in plants. These methods are efficient assays in effectoromics strategies (rapid resistance and avirulence gene discovery) and crucial to modern research in molecular plant pathology. They meet the demand for robust high-throughput functional analysis in plants.

Patates ve Nicotiana benthamiana'da Agroinfiltrasyon ve PVX Agroinfection

Agroinfiltration and PVX agroinfection are two efficient transient expression assays for functional analysis of candidate genes in plants. The most ...

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short period of time. However, this technology is only just beginning to be applied to large-scale production as many technological obstacles to scale up are now being overcome. Here, we demonstrate a simple and reproducible method for industrial-scale transient protein production based on vacuum infiltration of Nicotiana plants with Agrobacteria carrying launch vectors. Optimization of Agrobacterium cultivation in AB medium allows direct dilution of the bacterial culture in Milli-Q water, simplifying the infiltration process. Among three tested species of Nicotiana, N. excelsiana (N. benthamiana &#215; N. excelsior) was selected as the most promising host due to the ease of infiltration, high level of reporter protein production, and about two-fold higher biomass production under controlled environmental conditions. Induction of Agrobacterium harboring pBID4-GFP (Tobacco mosaic virus-based) using chemicals such as acetosyringone and monosaccharide had no effect on the protein production level. Infiltrating plant under 50 to 100 mbar for 30 or 60 sec resulted in about 95% infiltration of plant leaf tissues. Infiltration with Agrobacterium laboratory strain GV3101 showed the highest protein production compared to Agrobacteria laboratory strains LBA4404 and C58C1 and wild-type Agrobacteria strains at6, at10, at77 and A4. Co-expression of a viral RNA silencing suppressor, p23 or p19, in N. benthamiana resulted in earlier accumulation and increased production (15-25%) of target protein (influenza virus hemagglutinin).

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Transient protein production in Nicotiana plants based on vacuum infiltration with Agrobacteria carrying launch vectors (Tobacco mosaic virus-based) is a rapid and economic approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins. We simplified the procedure and improved target accumulation by optimizing conditions of bacteria cultivation, selecting host species, and co-introducing RNA silencing suppressors.

Optimizasyon ve Kullanımı<em&gt; Agrobacterium</emIn&gt; aracılı Geçici Protein Üretimi<em&gt; Nicotiana</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

Direct Agroinoculation of Maize Seedlings by Injection with Recombinant Foxtail Mosaic Virus and Sugarcane Mosaic Virus Infectious Clones

Agrobacterium-based inoculation approaches are widely used for introducing viral vectors into plant tissues. This study details a protocol for the injection of maize seedlings near meristematic tissue with Agrobacterium carrying a viral vector. Recombinant foxtail mosaic virus (FoMV) clones engineered for gene silencing and gene expression were used to optimize this method, and its use was expanded to include a recombinant sugarcane mosaic virus (SCMV) engineered for gene expression. Gene fragments or coding sequences of interest are inserted into a modified, infectious viral genome that has been cloned into the binary T-DNA plasmid vector pCAMBIA1380. The resulting plasmid constructs are transformed into Agrobacterium tumefaciens strain GV3101. Maize seedlings as young as 4 days old can be injected near the coleoptilar node with bacteria resuspended in MgSO4 solution. During infection with Agrobacterium, the T-DNA carrying the viral genome is transferred to maize cells, allowing for the transcription of the viral RNA genome. As the recombinant virus replicates and systemically spreads throughout the plant, viral symptoms and phenotypic changes resulting from the silencing of the target genes lesion mimic 22 (les22)&#160;or&#160;phytoene desaturase (pds) can be observed on the leaves, or expression of green fluorescent protein (GFP) can be detected upon illumination with UV light or fluorescence microscopy. To detect the virus and assess the integrity of the insert simultaneously, RNA is extracted from the leaves of the injected plant and RT-PCR is conducted using primers flanking the multiple cloning site (MCS) carrying the inserted sequence. This protocol has been used effectively in several maize genotypes and can readily be expanded to other viral vectors, thereby offering an accessible tool for viral vector introduction in maize.

An Agrobacterium-based injection (agroinjection) protocol is presented for the inoculation of foxtail mosaic virus&#160;and sugarcane mosaic virusclones into maize seedlings. Inoculation in this manner leads to viral infection, virus-induced gene silencing of marker genes, and viral overexpression of GFP.

Patates virüsü X bazlı mikroRNA Susturma (VbMS) Patateste.

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Viral Nanopartiküller