Tilapia Lake Virüs Ünün Özel ve Hızlı Tespiti İçin Ters Transkripsiyon Döngü Aracılı İzomal Amplifikasyon (RT-LAMP) Testi

Tilapia gölü virüsü, tilapia ve melez türlerinde yüksek mortaliteye neden olan yeni ortaya çıkan bir virüs ve bulaşıcı patojendir. Tilapia birçok gelişmekte olan ülkeler için ana protein kaynağı olduğu gibi, yeni virüs enfeksiyonu tilapia kültür balıkçılığı için büyük bir etkisi vardır, ve aynı zamanda dünya gıda güvenliğini tehdit ediyor. Balık dokusunda virüsü tespit etmek için hızlı, doğru ve hassas bir yöntem geliştirilmesi, hastalığın kontrolüne yardımcı olacak ve virüsün etkisini azaltacaktır.

Bu videoda, balık örneklerinde tilapia göl virüsünün hızlı bir şekilde saptanması için ters transkripsiyon döngü aracılı izomal amplifikasyon veya RT-LAMP testi göstereceğiz. İkinci bölüm, RNA çıkarma. İlk olarak, steril 1.5 mililitre mikrosantrifüj tüp içine karaciğer dokusunun 3250 miligram ekleyin, içeren 600 için 1000 mikrolitre asit guanidinium-fenol baz reaktif, ve homojen kadar kıyma.

Santrifüj 10, 000 RCF 30 saniye için, ve yeni bir tüp içine supernatant aktarın. Tüpe %95 eşit hacim ekleyin ve iyice karıştırın. Çözeltiyi bir toplama tüpüne yerleştirilen bir spin sütununa aktarın, ardından 10,000 RCF'de 30 saniye santrifüj edin.

Akışı atın ve sütunu yeni bir toplama tüpüne aktarın. Sütuna 400 mikrolitre RNA PreWash ekleyin ve 10,000 RCF'de 30 saniye santrifüj yapın. Akış tan atın ve bu adımı yineleyin.

Sütuna 700 mikrolitrelik RNA Yıkama Tamponu ekleyin ve 10,000 RCF'de iki dakika santrifüj edin. Daha sonra, steril bir 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüp içine sütun aktarın. Son olarak, 100 mikrolitre, nükleaz içermeyen su ve santrifüj ile sütun matrisiçine elute RNA 30 saniye boyunca 10,000 RCF.

Üçüncü bölüm, astar tasarımı. PrimerExplorer Sürüm 4 verimli LAMP tasarımı için en yaygın biyoinformatik aracıdır, veya RT-LAMP astarlar, hangi yazılım için iyi kılavuzları kendi web sitesinde mevcuttur. Burada, dört özel astar, iki iç ve iki dış astar oluşan, TiLV segment 3 altı farklı bölgeleri tanımak için tasarlanmıştır, Tayland kökenli.

Bağlantının videoda gösterildiği web sitesine girdikten sonra PrimerExplorer V4'e tıklayın. TiLV'nin 3. Oluştur düğmesine tıkladıktan sonra yazılım işlenir ve sonuçlar gösterecektir. LAMP amplifikasyon dizileri optimize edildikten sonra, toplamda, bir çift dış astar ve iki çift iç astar, TiLV enfeksiyonunu saptamak için bu çalışma için seçildi.

Bu astar kümesi burada gösterilmiştir. Dördüncü bölüm, RT-LAMP'nin gösterimi. Tilapia göl virüsüne özgü RT-LAMP ana karışımı aşağıdaki kimyasallardan oluşmaktadır.

Tabloda gösterilen kimyasalları kullanarak bir ana karışım hazırlayın. Steril 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüp içine ana karışımı 22 mikrolitre dağıtın. Daha sonra, reaksiyon tüpüne üç mikrolitre RNA şablonu ekleyin.

Negatif kontrol için RNA malzemeleri yerine distile su kullanın ve iyice karıştırın. Reaksiyonları 65 derecede 60 dakika, ardından 10 dakika boyunca 80 santigrat derece yedirin. 30 dakika kuluçkadan sonra kalorimetrik değişiklikler çıplak gözle görülür.

Uygun olduğu durumlarda, 100 Voltluk bir sabitle çalışan jel elektroforezini %1,5 agarose jel üzerinde 40 dakika boyunca gerçekleştirerek RT-LAMP tahsin sonuçlarını doğrulayabiliriz, bu şekilde bir kilobaz çifti moleküler boyutlu DNA Merdiveni parça boyutunu belirlemek için bir belirteç olarak yüklenir. Bölüm beş, temsili sonuçlar ve yorumlama. 30 dakika kuluçkadan sonra, balık dokularında TiLV'nin pozitif amplifikasyonunu öneren tahıl floresan reaksiyonu, uv ışığı altındaki enfekte örneklerde 365 nanometre dalga boyunda, negatif kontroldekilerin ise net ve biraz renksiz bir çözeltiye sahip olduğu açık bir şekilde gözlenmiştir.

Buna karşılık, RT-LAMP ürünlerinin amplifikasyonu agarose jel elektroforezinde doğrulandı, ters DNA tekrarlarının çoklu amplifikasyonlarının çeşitli boyutlarını gösteren, TiLV enfekte numunelerde UV lambası altında kök-döngü yapıları oluşturan, negatif kontrol kuyularında ise hiçbir bant görüntülenmedi, sonuçlar RT-LAMP testine uygun olarak yapıldı. Tilapia gölü virüsünün yayılmasını azaltmak için, etkili bir tanı yöntemi kullanarak bu enfekte balıkların hemen taranması önemli anahtarlardan biridir. Yani, yeni geliştirilen RT-LAMP testi biyogüvenlik önlemi sürecinde uygulanacak hızlı ve hassas bir tanı aracı sunmalıdır.

Teşp laboratuvarda veya yerinde tesislerde kullanılabilir. Bu yöntemin, tilapia gölü virüsünün yayılmasının azalmasına yol açabilecek enfekte balık popülasyonunun taranması için uygulanacağını umuyoruz.