En az hücre tasarımı ve ilaç dağıtımı için supramoleküler yapıların verimli bir şekilde biraraya toplanması zorlu olmaya devam etmektedir. Burada, ampifilik elastin benzeri proteinlere dayalı supramoleküler yapılar sağlayan etkili protokoller gösteriyoruz. Sunulan montaj protokolleri veziküller, lifler ve koaservatlar gibi uyarlanabilir fiziksel özelliklere sahip çok yönlü supramoleküler yapılar oluşturur.
Protein membran tabanlı bölmeler faz ayırma davranışını gösterir ve kimyasal olarak çeşitli floresan kargo moleküllerinin kapsüllemesine olanak sağlar. F20E20-mEGFP ve F20E20-mCherry ifadesi için, bir gecede ön kültürden 0.3'lük bir OD600'e kadar ana ifade kültürünü aşıla. 37 santigrat derece ve 200 rpm uygun antibiyotikler ile desteklenen steril LB orta 400 mililitre kuluçka.
İfade kültürü 0,5 ile 0,8 arasında OD600'e ulaştığında, IPTG'yi bir milimolar'ın son konsantrasyonuna ekleyin ve kuluçka sıcaklığını 20 santigrat dereceye düşürün. Doğal olmayan amino asit ile ampifilik ELP ifadesi için, 0.3 bir OD uygun plazmidler içeren gece E.coli ön kültür den ana ifade kültürü aşılamak. 37 santigrat derece ve 200 rpm kanamisin ve kloramfenikol ile desteklenen steril LB orta 400 mililitre kuluçka.
100 milimolar doğal olmayan amino asit stok hazırlamak için, ultrasaf su sekiz mililitre doğal olmayan amino asit 206.2 miligram ekleyin. Çözeltinin pH'ını üç molar sodyum hidroksitle yükseltin ve şiddetle karıştırın. Doğal olmayan amino asit çözündüğünde, pH'ı yaklaşık 10,5'e düşürün ve 10 mililitrelik bir hacme ultra saf su ekleyin.
Çözeltiyi steril 0,22 mikrometrefiltre ile filtreleyin ve iki mililitrelik reaksiyon tüplerinde yerleştirin. İfade kültürü 0,5 ila 0,8 OD600 ulaştığında, iki milimolar son konsantrasyonuna doğal olmayan amino asit ekleyin. 10 dakika daha kuluçkaya yatırın.
Daha sonra iptg ve arabinose eşzamanlı ilave si ile hedef protein ve gerekli tRNA sentezinin ekspresyonu indükleyin. Kuluçka sıcaklığını 20 dereceye düşürün ve ifadenin yaklaşık 20 saat devam etmesine izin verin. Kuluçkadan sonra hücreleri 40 dakika boyunca 4 santigrat derecede ve 4,000 kez g olarak santrifüjle hasat edin.
Lysis tamponundaki hücre peletini lysozyme ve PMSF ile yeniden askıya alın. Çözeltiyi 30 dakika buzüzerinde kuluçkaya yatırın. Daha sonra sıvı nitrojen ebatına batırarak iki kez dondurup eritin.
Süspansiyonu sonicate ve 40 dakika boyunca 10, 000 kez g ve dört derece santigrat santrifüj ile lysate temizleyin. Daha sonra afinite kromatografisi kullanarak proteini arındırın. Protein elüsasyonundan sonra, daha fazla kullanım anına kadar dört santigrat derecede saklayın.
ELP çözeltisi 500 mikrolitre floresan boya bir mikrolitre ekleyin ve bir ThermoMixer sallayarak 15 santigrat derece yaklaşık 10 saat boyunca reaksiyon kuluçka, ışıktan korumak için emin olun. Aşırı floresan boyayı çıkarmak için ultra saf suda bir diyaliz zarına 10 dakika denk gelir. Tıklanan ELP çözeltisi ile reaksiyon tüpünün açılmasının üzerine yerleştirilecek doğru boyuta membranı kesin.
Daha sonra çekirdeksiz bir kapak ile tüp kapatarak açılış membran düzeltmek. Havanın bindirmesini önlemek için kapak ve membran arasındaki boşluğu tamponla doldurun. Daha sonra reaksiyon tüpünü seçilen tampona yerleştirin, yüzeyin altına itin ve ters çevirin.
Diyalizi en az üç saat dört santigrat derecede gerçekleştirerek, diyalizin her tampon değişikliğinden sonra en az üç saat daha devam etmesini sağlar. THF şişmesi için homojen ELP çözeltisini fosfat veya Tris tamponuna karşı kararlı pH 7.5 ile diyalize alın. Lyophilizer hazırlayın ve dondurularak kurutma için başlangıç sıcaklığına soğutun.
Aliquot 1.5 mililitrelik reaksiyon tüpleri içinde diyaliz protein çözeltisi, ve donma-kurutma seyri basınç değişiklikleri nedeniyle katı örnek kaybetmemek için küçük bir delik ile kapaklar ile mühür. Sıvı nitrojendeki numuneleri şok-dondurun. Dondurulmuş protein örneklerini sıvı nitrojenden alın ve dondurularak kurumaya başlamak için hemen lyophilizer'a yerleştirin.
Numune tamamen kuruduktan sonra, kuru nitrojenle havalandırın ve hava nemi ile temas tan kaçınmak için reaksiyon tüpü kapaklarını hemen kapatın. Lyophilized örnekleri saf THF ekleyin ve 15 dakika boyunca buzlu su ile bir su banyosu sonicator çözüm yerleştirin. Vezikül oluşumu için 30 ila 60 santigrat dereceye veya lif oluşumu için 90 santigrat dereceye kadar bir termocycler önceden ısıtın ve ultrasaf su veya tampon ile yeni reaksiyon tüpleri hazırlayın.
Sonication sonra, beş dakika boyunca termocycler ELP / THF çözeltisi ve hazırlanan su veya tampon yerleştirin. Daha sonra ELP çözeltisini su veya tamponun üzerine yerleştirin, iki faz ın ve ayrı bir ara fazın ayrılmasının görünür olmasını sağlar ve karışımı termocycler'a geri yerleştirin. Numunenin oda sıcaklığında 10 dakika soğumasını bekleyin ve su veya tampona veya floresan mikroskopiye karşı diyalize devam edin.
Bir-50-mikromolar ELP çözeltisi hazırlayın ve 10 ila% 20 1-butanol ekleyin. Hemen yukarı ve aşağı borulama tarafından çözelti karıştırın. Vezikül oluşumunu gösteren, karıştırma sırasında çözeltinin bulanıklığı artmalıdır.
Dar bir boyut dağılımı elde etmek için, bir mikrometre gözenek boyutu ile bir membran ile mini ekstrüzyon ile veziküller ekstrüzyon. Boya kapsülleme için, 10 milimolar Tris-HCl'de yaklaşık 40 mikrolitre ELP çözeltisini DMSO'da bir mikrolitre Dextran Texas Red stok çözeltisi ile karıştırın. 1-butanol 10 mikrolitre ekleyin ve 0,25-by-25 milimetrelik iğne ile donatılmış bir şırınga ile 5 ila 10 kez ekstrüzyon.
THF şişme yöntemi art arda üç adımdan oluşur ve sıcaklığa bağlı olarak ELP'nin farklı supramoleküler derlemeleri ile sonuçlanır. Epifloresan mikroskopi görüntüleri, BDP-R20F20'den monte edilen vezikülleri ve BDP-R40F20'den monte edilen fibrillary yapıları göstermektedir. 1-butanol ekstrüzyon yöntemi sadece ELP veziküloluşumuna yol açar.
THF şişme yöntemine göre yaklaşık iki büyüklüğe daha fazla vezikül üretilir. BDP-R40F20 %10-15 butanol ile karıştırıldı ve veziküller karışımın ekstrüzyonu ile hazırlandı. Thf şişme protokolü ile BDP-R40F20'den farklı supramoleküler yapılar monte edildi.
Tamponun pH'ı ve montaj işleminin sıcaklığı koaservatlar, fibriller veya veziküller oluşturacak şekilde ayarlandı. Montaj protokolündeki küçük hatalar agregaoluşumuna yol açabilir. Pozitif yüklü boya ATTO Rho 13 ve polisakkarit dextran kırmızı 3000 1-butanol ekstrüzyon yöntemi ile F20R20-mEGFP monte veziküllü içine kapsüllenmiş edildi.
Konfokal mikroskopi görüntüleri yeşil kanaldaki vezikülleri, kırmızı kanaldaki kargoyu ve elde edilen birleştirilmiş kanaldaki başarılı kapsüllemeyi gösterir. TEK PMBC yapı taşlarının biraraya getirilen PMBC popülasyonları ile karıştırılması üzerine ELP amhipilelerinin faz ayrıştırma ve füzyon davranışları da gösterilmiştir. PMBC montajından önce karıştırılması, monte edilmiş PMBC membranı içinde homojen olarak dağılmış moleküllere yol açarken, birleştirilmiş vezikül popülasyonlarının karıştırılması en az 20 dakika boyunca görülebilen kırmızı veya yeşil floresan membran yamalara yol açar.
Bu prosedürü denerken, doğru adım sırasına ve THF şişme yöntemi ile butanol ekstrüzyon yöntemi arasındaki farklara dikkat etmek önemlidir. Bu protokolü takiben, ELP veziküller ilaç dağıtım mekiği olarak, in vitro transkripsiyon ve çeviri gibi enzimatik reaksiyonlar için platform olarak veya sentetik minimal hücrelerin oluşumunda kullanılabilir.
