Bu protokol, in vitro invazyon test, kantitatif bir protein açısından zengin matris yoluyla göç etmek ve gözenekli bir membran geçmesi için bir hücre hatları yeteneğini ölçmek için yararlı bir araçtır, kanser hücresi invazyonunun erken aşamalarında benzer bir süreç. Bu hücre hatları genetik olarak bir geni ifade etmek veya bu genin hücre göçünde mi yoksa hücre istilasında mı rol oynadığını belirlemek için genin ekspresyonunu azaltmak için değiştirilebilir. Birçok agresif kanserler hücre davranışıdramatik değişiklikler içerir, artan göç ve invazyon da dahil olmak üzere.
Yani bu in vitro invazyon tisali, bu süreçte yer alan genleri ve diğer faktörleri daha iyi anlamamızı sağlayabilir. Bu prosedüre başlamak için, 37 santigrat derecede %5 karbondioksit ve %100 nem oranıyla bir T25 şişesinde yapışkan fare meme tümörü hücrelerini büyütün ve deneyin ilk günü için %70 ila %90 oranında konkaya olurlar. Boyden oda ekler depolama dan almak ve 20 dakika oda sıcaklığına ısınmak için bir hücre kültür başlık aktarın.
Her deneme için her hücre satırı için istatistiksel olarak geçerli veriler oluşturmak için üç kesici uç kullanın. Ve sonra gözenekli membran ve jel her iki tarafta sulu böylece eklere önceden ısıtılmış serum içermeyen DMEM medya 500 mikrolitre ekleyin. En az iki saat boyunca %5 karbondioksit ve %100 nem ile 37 derecede kuluçkaya yatırın.
Bundan sonra, büyüme ortamını kaldırarak ve hücreleri beş mililitre HBSS ile durulayarak hücreleri hazırlayın. HBSS'yi çıkarın ve bir mililitre 0,25 tripsin EDTA çözeltisi ekleyin. 37 santigrat derecede 1 ila 5 dakika veya hücreler yuvarlak görünene veya kopma belirtileri gösterene kadar kuluçkaya yatın.
Sonra yavaşça tüm hücreleri ayırmak için şişe dokunun. %10 FBS ile beş mililitre DMEM'deki hücreleri yeniden askıya alın. Ve hücre süspansiyonuna steril 15 mililitrelik santrifüj tüpü aktarın.
Hücreleri santrifüj ve 1000 kez g beş dakika yavaşça hücreleri pelet. Ortamı çıkarın ve beş mililitre serumsuz DMEM'de peleti yeniden askıya alın. Santrifüj ve yeniden askıya alma işlemini toplam üç yıkıntı için iki kez daha tekrarlayın.
Bundan sonra, serumsuz DMEM'in son beş mililitresindeki hücreleri iyice yeniden askıya alın ve hücre kümelerinin olmadığından emin olun. Hücre konsantrasyonu belirlemek için bir hemositometre kullanın sadece canlı hücreleri saymak emin olun. Ve hücre süspansiyonu 50,000 hücre mililitre başına serumsuz DMEM beş mililitre seyreltmek.
Daha sonra, kuvözden ekler ile çanak çıkarın ve yavaşça bir eklemek medya aspire. Kesici ucu kaldırın ve medyayı kuyudan aspire edin. Hızlı çalışma, alt odaya chemoattractant ekleyin.
Sos'u kuyuya yerleştirin ve 24 kuyuluk için, hücre süspansiyonunun 500 mikrolitresini eklemeye ekleyin. Membranın her iki tarafında hava kabarcıkları olmadığından emin olun. 22 saat boyunca hücre kültürü kuluçka için çanak dönün.
22 saat sonra fiksasyon için %1 paraformaldehit ve bir X PBS çözeltisi hazırlayın. Temiz bir 24 iyi hücre kültürü çanak, her eklemek için bir kuyu var, böylece bireysel kuyulara fiksatif bir mililitre ekleyin. Daha sonra% 10 etanol ile PBS bir çözeltisi% 0.1 kristal menekşe boyama çözeltisi hazırlayın.
Her kesici uç için temiz bir kuyuya bu boyama çözeltisinin bir mililitresini ekleyin. Forceps kullanarak, her kesici uç birer birer kaldırın. Her kesici uç içine steril bir pamuklu bez yerleştirin ve herhangi bir göç edilmemiş hücreleri kaldırmak için membranın üst tarafında bez.
Bu işlemi ikinci bir pamuklu bez ile tekrarlayın. Ardından, kalan ortamları kesici uçtan çıkarın ve ayrılmış hücreleri temizlemek için 750 mikrolitre PBS ekleyin. PBS'yi çıkarın ve taze PBS ile yıkayın.
Daha sonra membranın alt tarafında geçirilen hücreleri düzeltmek için bir kuyu içeren fiksatif içine eklemek yerleştirin. Tüm kesici uçlar için bu işlemi tekrarlayın ve uçların oda sıcaklığında 15 dakika boyunca düzeltilmesine izin verin. Bundan sonra, her bir inserti kuyudan birer birer çıkarın ve 750 mikrolitre PBS ile yıkayın.
Ekleyi iyi içeren bir boyama çözeltisine yerleştirin ve tüm geçirilen ve sabit hücreleri boyamak için 15 dakika bekletin. Daha sonra kesici uçları çıkarın ve uçtan akan su temizlenene kadar damıtılmış su içeren bir kabın içine batırın. Fazla su damlacıklarını çıkarın ve kesici ucu bir filtre kağıdının üzerine yanlara yerleştirin.
Kesici uçların havayı kurutun. Her kesici uç için temiz bir cam mikroskop kaydırağı etiketleyerek ve her sürün ortasına küçük bir damla mikroskop daldırma yağı yerleştirerek membranı görüntülemeye hazırlayın. Bir neşter kullanarak, membran ayırmak için plastik eklemek içinde membran çevre etrafında kesti.
Membranı çıkarmak ve etiketli slayttaki yağ damlasının üzerine yerleştirmek için forceps kullanın. Bileşik bir mikroskop kullanarak hücreleri beş kez, 10 kez veya 20 kez büyütmeyle görüntüleyin. Niceleme için, 10 kat büyütme de birden fazla çakışmayan görüntü alın.
Tüm örnekler için alan başına toplam işgalci hücre veya hücre sayısını belirleyin. Her deneme için, her koşulu tahminde üç çoğaltma ucuyla gerçekleştirin ve istatistiksel olarak yararlı sonuçlar için birden çok kez yineleyin. Bu çalışmada, bir protein matrisi ile in vitro invitro invitro invazyon çinko parmak proteini, Zc3h8 değiştirilmiş ifade ile fare meme tümör hücrelerinin onkojenik hücre davranışlarında agresif fenotipleri değerlendirmek için kullanılır.
Zc3h8 ekspresyonunun daha yüksek düzeyleri tümör hücre hatlarında veya plazmidden promotör aracılı ekspresyonda görülür, bu da hızlı hücre çoğalma hızları, hızlı göç, 3Boyutlu ortamlarda büyüme ve in vitro invazyon testinde artan tecavüzle sonuçlanır. Tersine, shRNA tarafından azalan ifade daha az agresif çoğalma, göç ve istila ile sonuçlanır. Zc3h8 ifadesinin SHRNA'nın yıkılması üzerine hücre istilası azalırken, ifade kurtarıldığında bu istila kurtarılır.
Hücre davranışını incelemek için hızlı, ucuz, esnek ve nispeten kolay bir yaklaşım olduğu için in vitro invazyon testi tekniği son derece yararlıdır. Kültürde yetişen hücrelerin genetik olarak manipüle etmesi kolaydır. Hatta belirli mutasyonlar için test edilebilir.
In vitro invazyon sistemi aynı zamanda hücre göçü ve invazyonu üzerindeki etkileri için mikro RNA'lar gibi küçük molekül inhibitörlerinin yanı sıra biyolojik ajanların analizine de olanak sağlar. Bu teşp aynı zamanda matris, gözenek boyutu ve kemoattractant protein içeriğinin değiştirilmesi için izin, esneklik büyük miktarda içerir.
