MikroRNA fonksiyonları ile nöral mikroRNA hedef etkileşimlerine erişmek için MikroRNA'ların hem sağlıklı hem de hastalıklı durumlarda çeşitli biyolojik süreçleri nasıl düzenlediğini anlamak çok önemlidir. Bu protokol, mikroRNA hedeflerini ve fonksiyonel mikroRNA'ları belirlemek için strateji yoluyla yeniden üretmeyi, mikroRNA'ların doğrudan hedefinin doğrulanması zor olarak tanımlar. Protokolümüz, bireysel mikroRNA'ların işlevi ve kanser tedavisinde bir mikroRNA'nın etkisi hakkında bilgi verebilir.
Yarım maksimal inhibitör konsantrasyonunun hesaplanması sadece mikroRNA çalışmaları için değil, diğer anti-kanser ilaçlarının etkili değerlendirilmesi için de önemli bir yöntemdir. Bir hücredeki mikroRNA seviyesini anlamak için temel yöntemi tanımladığımız için protokolümüz yeni araştırmacılara yardımcı olacaktır. Protokolü başlatmak için hücreleri hücre sayacıyla sayın.
Hücreleri 96 kuyu plakası ile kaplayın. Ertesi gün, mikroRNA kontrol mimik birkaç son konsantrasyonlarda hücreleri transfect transfection karışımları bir dizi hazırlamak ve mikroRNA-107 taklit. 25 mikromolar mikroRNA kontrol mimimi veya microRNA-107 taklit, seyreltmek ve mikrosantrifüj tüplertransfection reaktif ile birlikte azaltılmış serum media kontrol mimimi veya mikroRNA-107 mimik ekleyin bir stok.
Oligo içeren karışımları mikropipet kullanarak hafifçe karıştırın. Hücre kültürü başlık bir 10 dakika kuluçka sonra, yavaşça tekrar oligo içeren karışımları karıştırın ve sonra her kuyuya karışımları 50 mikrolitre ekleyin. Transfected hücreleri bir hücre kültürü kuluçka makinesinde tutun.
Dikkatlice plaka her kuyuda hücre kültürü medya aspire ve hemen her kuyuiçine% 10 trikloroasetik asit, ya da TCA 100 mikrolitre doldurun. %10 TCA içeren plakayı dört santigrat derecede bir saat boyunca saklayın. Daha sonra, musluk suyu ile bir küvet içine batırarak plaka birkaç kez yıkayın.
Su kalmayana kadar tabağa dokunarak kuyuların içinden fazla suyu çıkarın ve tabağı kurulayın. Pipet 50 mikrolitre 0.4% SRB çözeltisi boş kuyular da dahil olmak üzere her kuyuiçine. %0,4'lük SRB çözeltisi kuyuların altını eşit olarak kaplayana kadar plakayı hafifçe sallayın.
Sonra, 40-60 dakika boyunca plaka kuluçka. Kuluçkadan sonra, plakayı %1 asetik asitle yıkayın, ta ki bağlanmamış boya tamamen yıkanana kadar. Pipet 100 mikrolitre 10 milimolar Tris baz çözeltisi ilgili kuyular içine, boş kuyular da dahil olmak üzere.
Tabağı 10 dakika çalkalayın. Emiciliği 492 nanometre de ölçün. SRB testinin emicilik değerlerini kullanarak ortalama emicilik yüzdesini ve her grubun standart sapmasını hesaplayın.
Verileri dikey olarak hizalayarak, tedavi konsantrasyonları, ortalama absorbans ve standart sapma dahil olmak üzere ham verileri yazılıma aktarın. Grafik Oluştur sekmesini tıklatın ve Basit Dağılım Hatası Çubuklarını seçin. Çalışma sayfası sütunlarını Sembol değerleri olarak seçin ve sonrakini tıklatın.
Veri Biçimi panelinde X-Y çiftlerini seçin ve sonrakini tıklatın. Veri Seç panelinde karşılık gelen veri sütunlarını seçin. Çizimi oluşturmak için bitiş'i tıklatın.
Eksenölçekleme ölçekleme ölçeklendirme skalası türünü değiştirmek için X eksenine çift tıklayın. Ölçek türünü doğrusaldan günlüğe değiştirin. Başlangıç ve bitiş aralığı numarasını sırasıyla 0,01 ve 200 olarak değiştirin.
Herhangi bir dağılım çizimine sağ tıklayın, Eğri Sığdır'ı seçin ve Kullanıcı Tanımlı alt kategorisine gidin. Doz yanıt eğrisini seçin. Sonraki düğmeleri tıklatın ve sonra bitir'i tıklatın.
Rapor sekmesine gidin ve sonra n, k ve R değerlerini denetleyin. PCR'yi, eşlik eden metin protokolünde ayrıntılı olarak çalıştırın. Daha sonra reaksiyon karışımları birleştirerek çift sindirim e geçin, kısıtlama enzimleri Exo1 ve Not1 bir tüp dahil.
37 derece santigrat su banyosunda 3-4 saat boyunca karışımları kuluçkaya yatırın. Çift sindirilmiş ürünleri %1'lik agarose jel üzerinde çalıştırın. Sonra UV ışığı altında bantları kesin.
Çift sindirilmiş PCR ürünlerini ve eksizlenmiş bantlardan luciferase vektörlerini arındırın. DNA ligaz dahil olmak üzere 20 mikrolitre ligasyon reaksiyonu karışımı hazırlayarak PCR ürünlerinin luciferase vektörlerine bağlanmasına devam edin. Kısaca 10 ila 15 saniye için tüp santrifüj.
Bir termal döngücü kullanarak bir gecede 16 santigrat derecede ligasyon kuluçka. Ertesi gün, yetkili hücreleri içeren tüp içine ligasyon karışımları ekleyerek dönüşüm gerçekleştirin. Yavaşça tüp dokunun ve 20 dakika buz üzerinde tutun.
Tüpü hızlı ve hafifçe 42 santigrat derecede30 saniye ile bir dakika arasında bir ısı bloğuna aktarın. Isı şoku sonrasında tüpü 20 dakika buza yerleştirin. Bir LB agar plaka üzerinde yetkili hücreleri yayıldı.
Bir gecede 37 santigrat derecede bir kuvözde yetkin hücreler yetiştirin. Ertesi gün, tek bir koloni seçin ve ultra saf su içeren 8 şeritli tüplerden birinde E.coli'yi yeniden askıya alın ve E.coli'yi rastgele seçilen dört koloniden sekize çıkarmak için bu adımı tekrarlayın. 25 mikrolitre E.coli süspansiyonu 8 şeritli tüplerin başka bir setine aktarın.
E.coli süspansiyonkullanarak koloni PCR gerçekleştirin. Luciferase tsay'ı 24 kuyu plakası içinde hazırlayın. Her kuyu için 500 mikrolitrelik hücre kültür medyasındaki dört hücreye 1-2 kat on ekleyin.
Gece kuluçkasonra, transfect 50 luciferase vektörleri transfect kontrol mimik veya belirli bir mikroRNA taklit ile hücrelere bir transfeksiyon reagent kullanarak. Ertesi gün, fosfat tamponlu tuzlu kullanarak iki kez kuyuların içini yıkayın. Kuyulara 200 mikrolitre likis reaktifi uygulayın ve luciferase aktivitesini ölçmeden önce hücre lisisini yeterince uygulayın.
Tabağı en az 15 dakika sallayın. Yeni tüpe 5 ila 10 mikrolitre hücre lisatı aktarın ve 100 mikrolitre reaktif bir tane ekleyin ve hemen pipetleme ile çözeltiyi karıştırın. Sonra 10 ila 15 saniye için illuminometre kullanarak firefly luciferase etkinliği okuyun.
Aynı tüpe 100 mikrolitre reaktif ekleyin ve iki kez pipetleme ile karıştırın. Son olarak, illuminometre kullanarak 10 ila 15 saniye renilla luciferase etkinliği okuyun. RTPCR, HPNE hücreleri ile karşılaştırıldığında mikroRNA-107 ve PANC-1 ve CAPAN-1 hücrelerinde önemli bir azalma gösterir.
MikroRNA-301 düzeyleri HPNE hücreleri ile karşılaştırıldığında, PANC-1 ve CAPAN-1 hücrelerinde önemli ölçüde upregulated edildi. Bu çalışmada SRB tsay açıkça panc-1 hücrelerinin çoğalması bir microRNA-107 taklit transfeksiyon sonrasında azaldığını göstermektedir. MicroRNA-107'nin öngörülen 11 potansiyel hedefinin taranması, tümör hücre büyümesinin pozitif düzenleyicisi olan sinüklein gama veya SNCG'nin mikroRNA-107 ve PANC-1 hücreleri ile doğrudan etkileşime girerek mikroRNA-107'nin SNCG ekspresyonunu modüle ederek PANC-1 hücrelerinin çoğalmasını olumsuz bir şekilde düzenleyebileceğini açıkça göstermektedir.
Tetra hidroleum bazlı varlık ve CFSE kullanan yetişkin hücre çoğalması tahlilleri, hücre tiplerine bağlı olarak mikroRNA mimikleri gibi etkilerinin taranması için uygulanabilir. mikroRNA'ların deneysel olarak doğrulanmış işlevine dayanarak, luciferase tahlillerinden önce aday hedeflerin listesini daraltmak için veritabanı ve hedef tahmin programının sistematik bir şekilde gözden geçirilmesi gerekmektedir. Anti-kanser ilaçları ile mikroRNA'ların kombinasyon etkinliğinin değerlendirilmesi için, kombinasyon indeksinin değerlendirilmesi için protokolümüze göre ayarlanmış IC değerlerinin hesaplanması avantajlıdır.
